基于QuEChERS樣品前處理的間接競爭酶聯(lián)免疫分析法快速檢測薏苡仁中黃曲霉毒素B1

張磊，關(guān)凱儀，黃雨心，王淑美

（1.廣東藥科大學(xué)中藥學(xué)院，廣東 廣州 510006；2.國家中醫(yī)藥管理局中藥數(shù)字化質(zhì)量評價(jià)技術(shù)重點(diǎn)研究室，廣東 廣州 510006；3.廣東省中藥質(zhì)量工程技術(shù)研究中心，廣東 廣州 510006）

黃曲霉毒素（aflatoxins，AFs）是一類主要由黃曲霉和寄生曲霉產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物[1]。其中黃曲霉毒素B1（aflatoxin B1,AFB1）的毒性最強(qiáng)，屬于I 類致癌物（international agency for research on cancer,1993 年）。AFB1對肝臟有明顯損傷作用[2]，能誘發(fā)原發(fā)性肝癌，還具有致畸性及致突變性[3-4]。鑒于AFB1的危害性，2020年版《中國藥典》規(guī)定部分易污染中藥材中AFB1不得超過5 μg/kg，薏苡仁是當(dāng)中的藥材之一。

薏苡仁是禾本科植物薏米Coixlacryma-jobiL.var.ma-yuen（Roman.）Stapf 的干燥成熟種仁，廣泛分布于熱帶和溫帶地區(qū)[5]，在我國主產(chǎn)于貴州[6]。薏苡仁富含淀粉、蛋白質(zhì)、多糖、脂質(zhì)、多酚、植物甾醇等物質(zhì)[7]，具有較好的藥用和食用價(jià)值。薏苡仁具有抗炎[8]、降糖[9]、調(diào)節(jié)免疫[10]、抗癌[11]等作用，常用于治療水腫、腳氣、小便不利、脾虛泄瀉、濕痹拘攣、肺癰、腸癰、贅疣、癌腫；此外，作為食品，薏苡仁已有數(shù)千年的應(yīng)用歷史，其營養(yǎng)成分高于大多數(shù)谷物，除特有成分外，薏苡仁中的蛋白質(zhì)、碳水化合物和脂質(zhì)的比例高于大米、玉米和小麥[5，12-14]，但豐富的營養(yǎng)物質(zhì)也為霉菌生長提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。

目前，國內(nèi)外常采用高效液相色譜法[15-17]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法等[18-20]檢測中藥中的真菌毒素。相對于這些大型精密儀器檢測方法，間接競爭酶聯(lián)免疫分析方法（indirect competitive enzyme-linked immunosorbent assay，ic-ELISA）是高通量快速檢測真菌毒素的有效手段，然而在中藥檢測的應(yīng)用中常面臨復(fù)雜基質(zhì)干擾的挑戰(zhàn)，仍需要相對復(fù)雜的樣品前處理過程或繁瑣的陰性樣品校正來降低基質(zhì)的影響[21]。Liu等[22]的研究表明，薏苡仁中的基質(zhì)成分對免疫分析存在較大干擾，無法采用溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量分析，需要用基質(zhì)匹配的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行校準(zhǔn)。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，ic-ELISA 檢測薏苡仁中真菌毒素的基質(zhì)效應(yīng)可能與薏苡仁中的極性成分有關(guān)，因此如何去除薏苡仁基質(zhì)中的這部分干擾成分，是提高檢測準(zhǔn)確度的關(guān)鍵。QuEChERS 是一種適合大量樣品的快速前處理技術(shù)，2003 年被提出[23]，因其具有快速（quick）、簡單（easy）、經(jīng)濟(jì)（cheap）、高效（effective）、可靠（rugged）和安全（safe）等特點(diǎn)，被縮寫為“QuEChERS”。QuEChERS法通常在提取樣品時(shí)加入鹽，通過鹽析作用降低真菌毒素在水相中的溶解度，增大有機(jī)相中待測物的含量，并促進(jìn)水相和有機(jī)相的分離，從而可通過離心除去溶于水的雜質(zhì)。與傳統(tǒng)的液-液萃取或免疫親和柱凈化相比，QuEChERS 具有更簡便、快捷以及低成本等多種優(yōu)勢。

本研究著重探究簡便且能消除薏苡仁基質(zhì)干擾的樣品前處理方法，在課題組前期研究基礎(chǔ)上，較系統(tǒng)地優(yōu)化了稀釋溶劑和稀釋方式對ic-ELISA的影響，并進(jìn)一步對比了簡單稀釋法和QuEChERS技術(shù)對消除基質(zhì)效應(yīng)的效果，旨在開發(fā)一種簡便、快速、準(zhǔn)確且能抗基質(zhì)干擾的ic-ELISA 用于薏苡仁中AFB1的快速檢測。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Spark 酶標(biāo)儀購于tecan（上海）貿(mào)易有限公司；電子天平（ME104）購于梅特勒-托利多儀器（中國）有限公司；MB100-4A 微孔板恒溫振蕩器購于杭州奧盛儀器有限公司；DHM-200 多管渦旋振蕩器購于美博實(shí)驗(yàn)儀器（廣州）有限公司；H1650-W 離心機(jī)購于湖南湘儀科學(xué)儀器設(shè)備有限公司；Agilent 1290-6470 液相色譜儀-串聯(lián)質(zhì)譜儀（liquid chromatography/tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）購于安捷倫科技（中國）有限公司。

1.2 試劑與材料

AFB1單克隆抗體和AFB1-BSA 抗原均購于深圳安提生物科技有限公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠二抗（IgG-HRP）購于南寧市藍(lán)光生物技術(shù)有限公司；3，3′，5，5′-四甲基聯(lián)苯胺（TMB）單組分顯色液購于合肥巴斯夫生物科技有限公司；牛血清白蛋白（BSA）購于阿拉丁試劑（上海）有限公司；AFB1、AFB2、AFG1、AFG2對照品購于Pribolab 公司（新加坡）；甲醇（質(zhì)譜級）、甲酸（質(zhì)譜級）、乙酸銨均購于廣州蘇鋮粵貿(mào)易有限公司；其他試劑均為分析級試劑，購于天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司。實(shí)驗(yàn)用磷酸鹽緩沖液（phosphate-buffered saline, PBS,pH 7.4）、洗滌液（PBST）和包被液（50 mmol/L 碳酸鹽緩沖液，pH 9.6）均參照課題組前期研究中的方法進(jìn)行配制[24]。122 批薏苡仁（Cocis Semen）和即食薏苡仁粉樣品隨機(jī)購于藥店、超市和電商，編號為S1－S122、粉碎、密封放置于-20 ℃冰箱中保存，其中樣品S101-S122為即食薏苡仁粉。

2 方法

2.1 樣品溶液的制備

2.1.1 簡單稀釋法 稱取薏苡仁樣品1 g，加入80%（體積分?jǐn)?shù)，下同）乙腈5 mL，渦旋3 min 后于10 000 r/min 離心5 min，取適量上清液用稀釋溶劑稀釋20倍后再于10 000 r/min離心5 min，取上清液備用。

2.1.2 QuEChERS 凈化法 稱取薏苡仁樣品1 g，加入80%乙腈5 mL，渦旋3 min后立即加入硫酸鎂1 g和乙酸鈉0.25 g[25]，渦旋1 min 后于10 000 r/min 離心5 min，取上清液用PBS稀釋20倍，于10 000 r/min離心5 min，取上清液備用。

2.2 ic-ELISA檢測過程

在96 孔酶標(biāo)板上加入100 μL 用包被液稀釋的AFB1-BSA 溶液，于4 ℃過夜孵育。用洗板液洗滌3次后拍干，加入200 μL 封閉液，于37 ℃孵育2 h，用洗板液洗滌2 次后拍干，然后依次加入50 μL AFB1對照品溶液或樣品稀釋溶液，再加入50 μL 稀釋后的抗體溶液，于37 ℃孵育1 h，用洗板液洗滌3 次后拍干，加入100 μL IgG-HRP，于37 ℃孵育1 h，用洗板液洗滌4次后拍干。加入TMB顯色液100 μL，室溫顯色10 min 后加入1 mol/L 鹽酸終止液50 μL，于酶標(biāo)儀450 nm處測定吸光度值。

2.3 LC-MS/MS檢測條件

采用的LC-MS/MS 檢測方法在Wu[26]等報(bào)道的方法基礎(chǔ)上略有修改。色譜條件：色譜柱為Waters CORTECSTM UPLC C18（100 mm×2.1 mm×1.6 μm）；流動(dòng)相：水（0.1%甲酸+1 mmol/L 乙酸銨）為流動(dòng)相A，甲醇為流動(dòng)相B，梯度洗脫（0~2 min，10%B；2~8 min，90%B；8~8.1 min，10%B；8.1~11 min，10%B）；柱溫：35 ℃；流速：0.3 mL/min；進(jìn)樣量：2 μL。

質(zhì)譜條件：采用電噴霧離子源（Electrospray ionization，ESI），離子源溫度：150 ℃，脫溶劑溫度：350 ℃，多反應(yīng)監(jiān)測（Multiple reaction monitoring，MRM）模式掃描。質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 質(zhì)譜條件參數(shù)Table 1 Mass spectrometry condition parameters

3 結(jié)果與討論

3.1 抗原、抗體濃度的優(yōu)化

采用棋盤滴定法對抗原和抗體濃度進(jìn)行優(yōu)化，以達(dá)到最佳的檢測靈敏度。本研究分別選擇了5個(gè)不同的抗原、抗體濃度進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果見表2?？梢?，當(dāng)抗原質(zhì)量濃度為0.062 5 μg/mL，抗體質(zhì)量濃度為0.125 μg/mL；抗原質(zhì)量濃度為0.031 25 μg/mL，抗體質(zhì)量濃度為0.25 μg/mL時(shí)，吸光度值接近于1.0。采用這兩組抗原、抗體條件繪制抑制曲線，結(jié)果如圖1所示。可見，兩組抗原、抗體條件的半數(shù)抑制濃度（half inhibitory concentration,IC50）相同，從低濃度AFB1的檢測靈敏度和檢測成本考慮，選擇抗原濃度為0.062 5 μg/mL，抗體濃度為0.125 μg/mL進(jìn)行后續(xù)研究。

圖1 不同抗原、抗體條件的抑制曲線Figure 1 Inhibition curves of different antigen-antibody conditions

表2 不同AFB1抗原、抗體濃度條件下的吸光度值Table 2 Absorbance values for different AFB1 antigen and antibody concentrations

3.2 提取溶劑的選擇

通過查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，乙腈-水體系和甲醇-水體系常用于提取AFB1[27-28]，此外，以乙腈作為提取溶劑可以減少脂溶性雜質(zhì)溶出[29]。因此，參考課題組前期研究結(jié)果[30]，選取80%乙腈作為提取溶劑。

3.3 簡單稀釋法的優(yōu)化

本研究考察了不同稀釋溶劑種類和稀釋方式（一步稀釋法和二步稀釋法）對ic-ELISA 顯色值和靈敏度的影響。一步稀釋法對比了水、PBS、10%甲醇水、10%甲醇PBS，4 種具有代表性的溶劑；二步稀釋法考察了PBS 和10%甲醇水的不同組合，即先用10%甲醇水稀釋2 倍，混勻后用PBS 稀釋10 倍和先用PBS 稀釋2 倍、混勻后再用10%甲醇水稀釋10倍。如圖2 所示，簡單稀釋法能夠消除基質(zhì)對檢測靈敏度的影響，但無法解決基質(zhì)對檢測顯色值的抑制問題。

基于上述結(jié)果，本研究考察了應(yīng)用QuEChERS技術(shù)進(jìn)行樣品前處理的效果。QuEChERS 凈化過程參見“2.1”，樣品首先用80%乙腈渦旋提取3 min，然后加入無水硫酸鎂-乙酸鈉（體積比4∶1）繼續(xù)渦旋1 min，經(jīng)離心后，AFB1轉(zhuǎn)移到有機(jī)相中，而基質(zhì)中的極性成分則保留在水層，從而消除樣品基質(zhì)中極性成分的干擾?；赒uEChERS 技術(shù)凈化提取液后的稀釋溶劑優(yōu)化結(jié)果見圖3，當(dāng)稀釋溶劑為PBS 時(shí)，BX0/B0和IX0/I0分別為1.05、0.99，均相對最接近于1.0，表明該條件下基質(zhì)干擾最小。因此，后續(xù)研究采用QuEChERS 技術(shù)凈化提取液，然后采用PBS 進(jìn)行稀釋。此外，綜合課題組前期研究結(jié)果[30]可進(jìn)一步說明，利用QuEChERS 方法去除的極性物質(zhì)，是干擾ic-ELISA顯色值的重要因素。

圖3 QuEChERS凈化法的稀釋方式優(yōu)化Figure 3 Optimization of dilution mode based on purification by QuEChERS technology

3.4 方法學(xué)考察

3.4.1 線性與范圍 按“2.1.2”項(xiàng)下制備陰性薏苡仁樣品溶液。以陰性樣品溶液和溶劑分別配制質(zhì)量濃度為4、1、0.5、0.25、0.125、0.062 5、0.031 3、0.015 6、0.003 9、0.001、0 ng/mL 的AFB1對照品溶液，并按照“2.2”項(xiàng)下進(jìn)行檢測。以抑制率（不同濃度AFB1的吸光度值和0 ng/mL AFB1吸光度值的比值）為縱坐標(biāo)，AFB1對照品溶液的質(zhì)量濃度對數(shù)為橫坐標(biāo)，采用Logistic 4P 模型進(jìn)行擬合，繪制溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線和基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見圖4和表3。

圖4 溶劑和基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線Figure 4 Solvent and matrix-matched standard curves

表3 標(biāo)準(zhǔn)曲線參數(shù)Table 3 Parameters of the standard curve

3.4.2 基質(zhì)效應(yīng)評價(jià) 基質(zhì)效應(yīng)（matrix effect,ME）常采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線與溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率比值（ME=B/A×100%，其中A 為溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性方程斜率，B 為基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性方程斜率）進(jìn)行評價(jià)[31-32]。但實(shí)際研究中發(fā)現(xiàn)，除標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率比值符合要求外，還需要關(guān)注陰性樣品溶液與空白溶劑顯色值之間的差異，二者差異越小，越有利于提高檢測的準(zhǔn)確度。

由表3的結(jié)果計(jì)算可得，ME=101%，此外，陰性樣品溶液與空白溶劑的吸光度值比值為0.98，基質(zhì)效應(yīng)在可接受范圍內(nèi)[33]，可用溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線代替基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量分析。

3.4.3 特異性 方法的特異性通過檢測AFB1與其結(jié)構(gòu)類似物之間的交叉反應(yīng)進(jìn)行評價(jià)。AFB1類似物的交叉反應(yīng)率計(jì)算公式為：

結(jié)果表明，AFB1與AFB2、AFG1、AFG2的交叉反應(yīng)率分別為67.3%、1.5%、1.3%，在實(shí)際檢測過程中，當(dāng)自然污染的樣品中存在AFB2時(shí)，所建立的方法可能會(huì)產(chǎn)生一定的正偏差。

3.4.4 準(zhǔn)確度與精密度 根據(jù)薏苡仁中AFB1的限量標(biāo)準(zhǔn)（5 μg/kg）和可定量的檢測范圍，在陰性薏苡仁樣品中添加低（2.5 μg/kg）、中（5 μg/kg）、高（10 μg/kg）3 個(gè)濃度水平的AFB1對照品溶液考察方法準(zhǔn)確度。加標(biāo)樣品經(jīng)提取和稀釋后按“2.2”項(xiàng)下進(jìn)行檢測，結(jié)果見表4?？梢?，方法的加標(biāo)回收率為75.12%~84.46%，RSD小于6%；平行稱取6份陰性薏苡仁樣品以5 μg/kg 添加水平進(jìn)行加標(biāo)，加標(biāo)樣品經(jīng)提取和稀釋后按“2.2”項(xiàng)下進(jìn)行檢測，檢測結(jié)果的RSD為3.6%。表明方法的準(zhǔn)確度和精密度可滿足檢測需求[21]。

表4 準(zhǔn)確度考察結(jié)果Table 4 The results of accuracy(n=3)

3.4.5 檢測限和定量限 檢測限（limit of detection,LOD）為ELISA 產(chǎn)生10%抑制率時(shí)對應(yīng)的分析物濃度；定量限（limit of quantification,LOQ）為ELISA產(chǎn)生20%抑制率時(shí)對應(yīng)的分析物濃度。本研究建立的ic-ELISA 測定薏苡仁中AFB1的檢測限和定量限分別為0.49、1.37 μg/kg。

3.5 實(shí)際樣品檢測

采用建立的ic-ELISA對122批薏苡仁及即食薏苡仁粉中的AFB1污染狀況進(jìn)行測定。當(dāng)樣品中AFB1含量大于檢測限則判定為陽性樣品，共檢出25批陽性樣品，陽性率為20.5%，污染水平為1.76~27.56 μg/kg，陽性樣品的超標(biāo)率為24.0%。值得關(guān)注的是，超標(biāo)的6 批樣品中，除1 批次污染水平為8.34 μg/kg外，其余5批樣品的污染水平是限量標(biāo)準(zhǔn)（5 μg/kg）的2.7~5.5 倍，提示有必要在薏苡仁的采收、加工、儲(chǔ)藏及流通等過程中采取一定的防控措施，降低污染的發(fā)生。

3.6 LC-MS/MS確證

用LC-MS/MS 對ic-ELISA 檢測的25 批陽性樣品進(jìn)行檢測，以確證建立的ic-ELISA 的可靠性，陽性樣品代表性譜圖見圖5。對ic-ELISA 和LC-MS/MS 大于定量限的檢測結(jié)果進(jìn)行相關(guān)性分析（圖6），相關(guān)系數(shù)（r）為0.98，表明建立的ic-ELISA能較準(zhǔn)確的檢測薏苡仁中的AFB1。

圖5 對照品（A）和陽性樣品（B）的代表性LC-MS/MS譜圖Figure 5 The representative LC-MS/MS spectrums of reference substance(A)and positive sample(B)

圖6 LC-MS/MS 與ic-ELISA 測定陽性樣品中AFB1含量的相關(guān)性曲線Figure 6 Correlation curves for AFB1 in coix seed between the LC-MS/MS and the developed ic-ELISA

4 結(jié)論

本研究建立了適用于薏苡仁中AFB1高通量、快速篩查的ic-ELISA，方法靈敏可靠，且無需任何校正。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，在ic-ELISA檢測中，薏苡仁的基質(zhì)效應(yīng)與其基質(zhì)中的極性成分密切相關(guān)，QuEChERS樣品前處理技術(shù)能夠去除薏苡仁樣品提取液中的水溶性雜質(zhì)，從而改善樣品基質(zhì)對顯色值的干擾。在所檢測的樣品中，AFB1的污染率超過20%，表明需要進(jìn)一步加強(qiáng)薏苡仁或其相關(guān)產(chǎn)品的防霉變措施，提高薏苡仁的藥用或食用安全性。