基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的康復(fù)新液治療胃潰瘍的機(jī)理研究

薛豐富，寇繼光

［錦州醫(yī)科大學(xué)研究生培養(yǎng)基地（孝感市中心醫(yī)院），湖北 孝感 432100］

胃潰瘍（gastric ulcer）是臨床上常見(jiàn)的消化疾病，具有多種復(fù)雜的病因，例如幽門(mén)螺桿菌感染、非甾體抗炎藥物的使用、吸煙飲酒和應(yīng)激、細(xì)胞因子的基因多態(tài)性、胃腸道微生物組生態(tài)失調(diào)、地理、氣候等［1］。胃潰瘍的癥狀包括胃痛、體重減輕、惡心、嘔吐等，累及肌層甚至漿膜層血管可能出現(xiàn)嚴(yán)重出血或穿孔等［2］，同時(shí)慢性胃潰瘍患者2 年內(nèi)發(fā)生胃癌的風(fēng)險(xiǎn)遠(yuǎn)高于普通人群［3］，因此，臨床上需重視并且采取有效措施治療胃潰瘍。目前，合成藥物如PPI 等可有效抑制胃酸分泌，從對(duì)胃潰瘍有著良好的療效，但長(zhǎng)期使用上述藥物具有一定的副作用，如引起胃組織病理學(xué)改變，例如頂葉細(xì)胞突出到腺腔、胃底腺囊性擴(kuò)張和中央凹上皮增生等［4］。目前的研究證明，一些草藥和動(dòng)物藥材為基礎(chǔ)的中藥對(duì)胃潰瘍具有非常好的療效［5-8］。康復(fù)新液的主要成分為美洲大蠊干燥蟲(chóng)體提取物，先前的許多研究都集中在美洲大蠊對(duì)人類住所的侵?jǐn)_和傳播致病真菌的能力上［9］，然而，越來(lái)越多的生理和藥理學(xué)研究表明，美洲大蠊具有促進(jìn)組織修復(fù)、抗菌、抗腫瘤等功能［10］。近年來(lái)，康復(fù)新液在多種疾病中得到運(yùn)用［11-13］，特別是在胃潰瘍中，有著令人滿意的療效［14-18］。近年來(lái)，基于生物信息學(xué)，系統(tǒng)生物學(xué)和多藥理學(xué)的快速進(jìn)展，萌生了網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)這一新興的研究方法［19］，即通過(guò)各類藥物、疾病、基因等數(shù)據(jù)庫(kù)，構(gòu)建藥物、疾病、靶點(diǎn)、途徑等相連接的互作網(wǎng)絡(luò)，從而達(dá)到分析藥物機(jī)制、篩選作用通路的目的，對(duì)藥物及疾病研究有巨大的推動(dòng)作用?？祻?fù)新液在胃潰瘍領(lǐng)域已得到成熟應(yīng)用，但目前暫無(wú)相關(guān)基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的研究，本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理及分子對(duì)接探究康復(fù)新液對(duì)胃潰瘍作用的潛在機(jī)制，初步發(fā)現(xiàn)康復(fù)新液作用于胃潰瘍的靶點(diǎn)，為進(jìn)一步應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 有效化學(xué)成分篩選

目前TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//ibts.hkbu.edu.hk/LSP/Tcmsp.php）中暫無(wú)美洲大蠊相關(guān)的藥物成分及成分靶點(diǎn)，因此我們通過(guò)CNKI 數(shù)據(jù)庫(kù)及PubMed 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行相關(guān)文獻(xiàn)檢索篩選出美洲大蠊的12 種有效化學(xué)成分，分別為胞嘧啶、胞苷、胸腺嘧啶、尿嘧啶、鳥(niǎo)苷、腺嘌呤、次黃嘌呤、肌苷、尿苷、cyclo-(L-Val-L-Pro)、熊果苷、(E)-3-hexenyl-β-D-glucopyranoside。

1.2 藥物的靶點(diǎn)預(yù)測(cè)

將美洲大蠊的有效化學(xué)成分導(dǎo)入PubChem（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）以獲得化合物的SMILES，PubChem 中檢索不到的化合物則使用ChemDraw 軟件（V20.0）進(jìn)行化學(xué)結(jié)構(gòu)的畫(huà)圖，將結(jié)果導(dǎo)入Super-PRED 數(shù)據(jù)庫(kù)中（https：//prediction.charite.de/subpages/target_prediction.php）用于獲取預(yù)測(cè)靶點(diǎn)，該數(shù)據(jù)庫(kù)于2022 年3 月完成了更新［20］。

1.3 藥物與疾病相關(guān)靶點(diǎn)篩選

以“gastric ulcer”及“stomach ulcer”為關(guān)鍵詞于OMIM（http：//www.omim.org/）、GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.genecards.org/）、PharmGkb數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.pharmgkb.org/）、TTD 數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//db.idrblab.net/ttd/）及drugbank 數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//go.drugbank.com/）中進(jìn)行檢索，其中對(duì)GeneCards 數(shù)據(jù)庫(kù)檢索結(jié)果以relevance score＞1 進(jìn)行篩選，整合上述5 數(shù)據(jù)庫(kù)的基因，以獲得較完善的疾病相關(guān)靶點(diǎn)，并去除重復(fù)項(xiàng)。最后，利用韋恩圖取藥物靶點(diǎn)基因與疾病靶點(diǎn)基因的交集基因。

1.4 網(wǎng)絡(luò)建設(shè)與分析

1.4.1 復(fù)合目標(biāo)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 將康復(fù)新液的藥物成分及其治療胃潰瘍的潛在靶點(diǎn)引入Cytoscape 3.9.0，構(gòu)建藥物活性成分和疾病靶點(diǎn)的網(wǎng)絡(luò)圖，同時(shí)進(jìn)行分析，以degree 值來(lái)設(shè)置基因的大小的展示。

1.4.2 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 將藥物與疾病交集基因通過(guò)String 數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//string-db.org/）進(jìn)行分析，最小相互作用打分閾值設(shè)置為0.4，得到蛋白-蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)圖，同時(shí)利用Cytoscape 3.9.0 軟件實(shí)現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)可視化，利用Cytoscape 中的“Cytohubba”插件，進(jìn)行關(guān)鍵基因篩選。

1.4.3 富集分析 使用R 4.1.2 中的“clusterprofiler”包對(duì)關(guān)鍵基因進(jìn)行基因本體（GO）和京都基因與基因組百科全書(shū)（KEGG）通路進(jìn)行富集分析，以調(diào)整后的P＜0.05 且q＜0.05 作為閾值篩選有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的通路，以闡明康復(fù)新液治療胃潰瘍的潛在愈合機(jī)制。

2 結(jié)果

2.1 美洲大蠊中的活性成分及靶點(diǎn)

從文獻(xiàn)中篩選出的12 種化合物共有1 273 個(gè)預(yù)測(cè)靶點(diǎn)，化合物與預(yù)測(cè)靶點(diǎn)數(shù)見(jiàn)表1，然后刪除重復(fù)基因，得到370 個(gè)藥物靶點(diǎn)。

表1 美洲大蠊中的活性成分及預(yù)測(cè)靶點(diǎn)數(shù)目

2.2 康復(fù)新液治療胃潰瘍的靶點(diǎn)基因

通過(guò)上述5 個(gè)疾病數(shù)據(jù)庫(kù)得到5 964 個(gè)胃潰瘍相關(guān)靶點(diǎn)（圖1），利用韋恩圖取藥物靶點(diǎn)基因與疾病靶點(diǎn)基因的交集基因共134 個(gè)（圖2）。

圖1 胃潰瘍相關(guān)靶點(diǎn)韋恩圖

圖2 康復(fù)新液與胃潰瘍靶點(diǎn)韋恩圖

2.3 化合物-靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)

以康復(fù)新液與胃潰瘍的134 個(gè)共同靶基因建立藥物成分靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖（圖3）。其中，節(jié)點(diǎn)表示靶基因和藥物成分，邊緣表示藥物成分和靶基因之間的相互作用。總共有146 個(gè)節(jié)點(diǎn)和503 條邊。12 種化合物分別作用于多個(gè)靶點(diǎn)。根據(jù)Degree 由高到低排序篩選可能的關(guān)鍵成分：cyclo-(L-Val-L-Pro)（Degree=64）、腺嘌呤（Degree=56）、鳥(niǎo)苷（Degree=44）。

圖3 藥物成分靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 蛋白-蛋白互作網(wǎng)絡(luò)

將藥物與疾病交集基因通過(guò)String 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行分析，得到了一個(gè)蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)（圖4），該網(wǎng)絡(luò)有126 個(gè)蛋白質(zhì)節(jié)點(diǎn)，1 174 條邊。利用CytoNCA 插件對(duì)節(jié)點(diǎn)的 Betweenness（BC）、Closeness（CC）、Degree（DC）、Eigenvector（EC）、LAC、Network（NC）進(jìn)行分析，選取出上述指標(biāo)均大于平均值的節(jié)點(diǎn)進(jìn)行新的網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，得到一個(gè)節(jié)點(diǎn)數(shù)目為36 的互作網(wǎng)絡(luò)（圖5），重復(fù)上述操作，最終得到一個(gè)13 個(gè)節(jié)點(diǎn)、122 條邊的互作網(wǎng)絡(luò)，13 個(gè)節(jié)點(diǎn)即為康復(fù)新液治療胃潰瘍的潛在關(guān)鍵基因（圖6），分別為STAT3、HSP90AA1、MTOR、MMP9、EZH2、CXCR4、MMP2、PTGS2、TLR4、CDK2、PTPN11、GSK3B、PDGFRB。

圖4 蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)

圖5 第一次篩選后的關(guān)鍵基因

圖6 第二次篩選后的關(guān)鍵基因

2.5 GO 富集分析

使用R 4.1.2 中的“clusterprofiler”包對(duì)關(guān)鍵基因進(jìn)行基因本體論（GO）分析，以P＜0.05 且q＜0.05 為閾值，共包括三個(gè)方面：分子功能（MF），細(xì)胞成分（CC）和生物過(guò)程（BP），共篩選出1 535 條結(jié)果，顯示三個(gè)方面中排名前20 的結(jié)果（圖7）。其中，生物過(guò)程包括MAPK 級(jí)聯(lián)正調(diào)控、對(duì)氧氣水平的反應(yīng)、對(duì)氧化應(yīng)激的反應(yīng)、細(xì)胞對(duì)氧化應(yīng)激的反應(yīng)、細(xì)胞因子產(chǎn)生的正向調(diào)節(jié)等；細(xì)胞成分包括膜筏、粘著斑、質(zhì)膜的外側(cè)面、細(xì)胞基質(zhì)結(jié)等；分子功能包括跨膜受體蛋白酪氨酸激酶活性、蛋白酪氨酸激酶活性、跨膜受體蛋白激酶活性等。

圖7 GO 分析

2.6 KEGG 富集分析

將PPI 網(wǎng)絡(luò)中獲得的靶基因用R 4.1.2 中的“clusterprofiler”包進(jìn)行KEGG 富集分析，以調(diào)整后的P＜0.05 作為閾值篩選有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的通路，共篩選出70 條信號(hào)通路，選取出排名前30 的信號(hào)通路來(lái)闡明康復(fù)新液治療胃潰瘍的潛在愈合機(jī)制，主要富集于JAK-STAT、PI3K-Akt、HIF-1、MAPK 信號(hào)通路、EGFR 酪氨酸激酶抑制劑耐藥性、T 輔助細(xì)胞17 細(xì)胞分化等（圖8）。

圖8 KEGG 富集分析

3 討論

康復(fù)新液的主要成分為美洲大蠊干燥蟲(chóng)體提取物，其在胃潰瘍中的治療得到了越來(lái)越廣泛的應(yīng)用［14-18］。本文從文獻(xiàn)中篩選出9 個(gè)康復(fù)新液活性成分，構(gòu)建藥物活性成分與胃潰瘍共同靶點(diǎn)的PPI 網(wǎng)絡(luò)，經(jīng)過(guò)篩選后得出13 個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)，即STAT3、HSP90AA1、MTOR、MMP9、EZH2、CXCR4、MMP2、PTGS2、TLR4、CDK2、PTPN11、GSK3B、PDGFRB。將上述靶點(diǎn)進(jìn)行GO與KEGG 富集分析，表明康復(fù)新液對(duì)胃潰瘍的治療作用涉及多種機(jī)制，包括減少化學(xué)刺激、抗氧化應(yīng)激、減少炎癥反應(yīng)、調(diào)控細(xì)胞因子等。

3.1 康復(fù)新液通過(guò)減少化學(xué)刺激及抗氧化應(yīng)激治療胃潰瘍

胃潰瘍的發(fā)生機(jī)制涉及多個(gè)方面，當(dāng)胃黏膜屏障受到如幽門(mén)螺旋桿菌、非甾體抗炎藥、酒精刺激、應(yīng)激等有害因素累及時(shí)，血管與微血管的損傷會(huì)誘導(dǎo)黏膜缺血、缺氧、及自由基的形成，從而導(dǎo)致細(xì)胞壞死［21］，本研究中GO 富集分析表明，康復(fù)新液對(duì)胃潰瘍治療的生物學(xué)過(guò)程體現(xiàn)在細(xì)胞對(duì)化學(xué)應(yīng)激的反應(yīng)、氧化應(yīng)激反應(yīng)、對(duì)氧氣水平的反應(yīng)、細(xì)胞對(duì)氧化應(yīng)激的反應(yīng)、對(duì)兒茶酚胺刺激的反應(yīng)上，與上述胃潰瘍的發(fā)生機(jī)制相符合，特別集中于對(duì)氧化應(yīng)激的反應(yīng)。

從PPI 網(wǎng)絡(luò)中分析得到的關(guān)鍵靶點(diǎn)中，MMP-9 與MMP-2 被證實(shí)在酒精或吲哚美辛誘導(dǎo)的胃潰瘍中表達(dá)增加［22-24］，也有隊(duì)列研究證實(shí)，MMPs 基因多態(tài)性與胃潰瘍的進(jìn)展有關(guān)［25-26］，MMPs 對(duì)胃潰瘍的發(fā)病機(jī)制涉及對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）重塑，傷口愈合和血管生成等［27-29］，而MMPs 的激活受活性氧（ROS）影響［30］，因此MMP-9 與MMP-2 可能是康復(fù)新液作用于胃潰瘍的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

3.2 康復(fù)新液通過(guò)減少炎癥反應(yīng)治療胃潰瘍

除上述機(jī)制外，壞死的胃組織壞死釋放吸引白細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，使其吞噬壞死組織并釋放促炎因子（例如TNF-α、IL-6 等），它們介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)又可以加重黏膜損傷和組織壞死。研究表明，PI3K-Akt 信號(hào)通路與MAPK 信號(hào)通路可以通過(guò)調(diào)節(jié)上述促炎細(xì)胞因子來(lái)緩解胃潰瘍，本研究富集分析表明，PI3K-Akt 信號(hào)通路在KEGG 富集分析中被富集，而GO 富集分析則富集了MAPK 的正向調(diào)控。

同時(shí)，本研究KEGG 富集分析也富集到了JAK-STAT 信號(hào)通路及T 輔助細(xì)胞17 細(xì)胞分化，JAK-STAT 通路與炎癥和自身免疫性疾病的發(fā)病機(jī)制有關(guān)［31］，包括胃潰瘍［32］。本文中，PPI 網(wǎng)絡(luò)中的核心靶點(diǎn)STAT3 是上述通路激活的主要轉(zhuǎn)錄因子之一［33-34］，對(duì)上述的T 輔助細(xì)胞17（能分泌關(guān)鍵細(xì)胞因子如IL-17 和IL-22 等［31］）的分化至關(guān)重要，有研究表明STAT3 在疾病的慢性炎癥期也存在過(guò)度表達(dá)［35］，主要通過(guò)多種蛋白酪氨酸激酶磷酸化激活［36-37］。研究表明，抑制STAT3 可隨后抑制COX-2 和一氧化氮合酶（iNOS）的表達(dá)來(lái)對(duì)抗幽門(mén)螺桿菌感染發(fā)揮抗炎作用。本次富集分析同樣提示酪氨酸基肽磷酸化、酪氨酸基肽的修正可能參與此過(guò)程。

3.3 康復(fù)新液通過(guò)細(xì)胞因子的正向調(diào)節(jié)治療胃潰瘍

胃潰瘍的愈合是一個(gè)細(xì)胞再生過(guò)程，受到細(xì)胞因子的調(diào)控，涉及到細(xì)胞增殖、遷移、表皮細(xì)胞再生、肉芽組織形成、血管生成及細(xì)胞和基質(zhì)之間的相互用作等，其中生長(zhǎng)因子在細(xì)胞增殖、遷移、表皮細(xì)胞再生等步驟起到關(guān)鍵作用［38］。本次研究中富集分析表明：細(xì)胞因子產(chǎn)生的正向調(diào)節(jié)是康復(fù)新液對(duì)胃潰瘍治療的關(guān)鍵機(jī)制之一。

綜上所述，本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對(duì)康復(fù)新液治療胃潰瘍的潛在活性成分及潛在機(jī)制進(jìn)行分析。根據(jù)PPI 互作網(wǎng)絡(luò)得出的關(guān)鍵靶點(diǎn)及GO、KEGG 富集分析得到的關(guān)鍵生物過(guò)程及信號(hào)通路進(jìn)行綜合分析，提示康復(fù)新液對(duì)胃潰瘍的治療作用涉及了多種機(jī)制，其中以抗氧化應(yīng)激反應(yīng)及對(duì)JAK-STAT、PI3K-AKT 等信號(hào)通路為代表的炎癥反應(yīng)調(diào)節(jié)最為顯著。但目前仍需進(jìn)一步試驗(yàn)證明上述結(jié)論。