葉面噴施酵母提取物對(duì)赤霞珠葡萄酒香氣物質(zhì)的影響

成池芳，陳新軍，張如意，劉宗昭

（新疆中信國(guó)安葡萄酒業(yè)有限公司，新疆釀酒葡萄與葡萄酒重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆葡萄酒產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新研究院，新疆 瑪納斯 832200）

香氣是葡萄酒重要的品質(zhì)指標(biāo)之一，對(duì)葡萄酒的風(fēng)格和典型性起到至關(guān)重要的作用，在很大程度上決定著葡萄酒產(chǎn)品的市場(chǎng)接受度。隨著氣相色譜（Gas Chromatography，GC）和氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)（Gas Chromatography-Mass Spectrometry，GC-MS）的發(fā)展與應(yīng)用，目前在葡萄酒中已鑒定出數(shù)百種揮發(fā)性香氣物質(zhì)，包括高級(jí)醇類、酯類、脂肪酸類、吡嗪類、萜烯類、降異戊二烯類、揮發(fā)性酚類、內(nèi)酯類和硫化物等，這些化合物之間通過(guò)相互作用影響葡萄酒的風(fēng)味和香氣[1]。釀酒葡萄原料的品質(zhì)在很大程度上決定了其所釀葡萄酒的風(fēng)味和品質(zhì)，通常將這種由釀酒葡萄果實(shí)原料帶來(lái)的香氣稱為“品種香”。發(fā)酵類香氣物質(zhì)來(lái)源于酒精發(fā)酵和蘋果酸乳酸發(fā)酵階段，主要包括高級(jí)醇、乙酸酯、脂肪酸乙酯和脂肪酸類等。通過(guò)栽培措施影響葡萄果實(shí)的代謝進(jìn)而影響所釀葡萄酒的感官是目前研究的熱點(diǎn)。

誘導(dǎo)子是誘導(dǎo)植物生理變化的物質(zhì)。生物型誘導(dǎo)子來(lái)源于生物中，依據(jù)其成分可以分為多糖類（如酵母提取物[2]、殼聚糖、甲殼素和葡聚糖[3]等）、低聚糖類（如半乳糖、甘露聚糖等[2]）、蛋白質(zhì)類（如纖維素酶、糖蛋白、乳鐵蛋白等[2]）。酵母提取物作為一種新型的生物型誘導(dǎo)子已經(jīng)被國(guó)外廣泛使用，用于噴施在葡萄葉面上來(lái)提高葡萄果實(shí)及葡萄酒品質(zhì)。目前關(guān)于酵母提取物在葡萄中的應(yīng)用很多，但是相關(guān)報(bào)道卻較少，大部分研究集中在初級(jí)代謝產(chǎn)物以及類黃酮物質(zhì)上。例如，VILLANGó 等[4]在西拉葡萄葉片上噴施酵母提取物，結(jié)果顯示葡萄果實(shí)的果皮變厚，果實(shí)中可溶性固形物的含量升高，可滴定酸的含量降低，酒中花色苷的含量也明顯升高。國(guó)內(nèi)相關(guān)研究則顯示噴施處理能夠提高美樂(lè)葡萄果實(shí)中類黃酮類物質(zhì)和還原谷胱甘肽的含量[5]。

本研究通過(guò)對(duì)赤霞珠葡萄葉面噴施酵母提取物，測(cè)定果實(shí)采收后所釀葡萄酒中的香氣物質(zhì)，擬為此栽培措施的進(jìn)一步應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)材料為2013 年定植的赤霞珠葡萄。實(shí)驗(yàn)地位于新疆中信國(guó)安葡萄酒業(yè)有限公司自建基地（44°14′N，86°15′E），植株株行距為1 m×3 m。采用VSP 葉幕整形，主干高度約65 cm，自根苗。

2020 年選取試驗(yàn)田中40 行長(zhǎng)勢(shì)良好，且較為一致的葡萄植株作為試驗(yàn)對(duì)象。每20 行為一個(gè)實(shí)驗(yàn)小區(qū)，每個(gè)小區(qū)包含兩種實(shí)驗(yàn)處理，即對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組。實(shí)驗(yàn)組噴施酵母提取物，用量為廠家推薦用量（1 kg 干粉/hm2），使用0.1%（體積分?jǐn)?shù)）吐溫80 水溶液作為葉片表面活性劑；對(duì)照組只噴施0.1%（體積分?jǐn)?shù)）吐溫80 水溶液。分別于果實(shí)轉(zhuǎn)色5%、轉(zhuǎn)色完成進(jìn)行噴施，噴施部位為葉面背面，噴施均勻直至有液滴自然滴落。

1.2 試劑與儀器

酵母D254，法國(guó)拉曼公司；乳酸菌，法國(guó)拉曼公司。氯化鈉，分析純，天津永大化學(xué)試劑有限公司；香氣物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品、4-甲基-2-戊醇（內(nèi)標(biāo)物質(zhì)），Sigma-Aldrich。7890GC-5975B MS 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，Agilent Technologies；CTC CombiPAL autosampler 多功能自動(dòng)進(jìn)樣器；SPME 萃取頭（DVB/CAR/PDMS）；色譜柱HP-INNOWAX（60 m×0.25 mm，0.25 μm）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 大生產(chǎn)發(fā)酵

商業(yè)采收期對(duì)葡萄果穗進(jìn)行手工采收并運(yùn)送至酒廠。采用除梗破碎機(jī)除梗后加入60 mg·L-1SO2，原料入罐后加入0.2 g·L-1商業(yè)酵母以啟動(dòng)酒精發(fā)酵，發(fā)酵溫度為24～26 ℃。酒精發(fā)酵結(jié)束后，人工接種乳酸菌 啟動(dòng)蘋果酸乳酸發(fā)酵，發(fā)酵溫度為18～20 ℃。

1.3.2 葡萄酒香氣物質(zhì)檢測(cè)

利用農(nóng)業(yè)農(nóng)村部葡萄酒加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室已優(yōu)化的頂空固相微萃取方法對(duì)葡萄汁和葡萄酒香氣物質(zhì)進(jìn)行萃取，并利用氣質(zhì)聯(lián)用法分析樣品中的香氣物質(zhì)[6]。

（1）頂空固相微萃取（Head Space-Solid Phase Microextraction，HS-SPME）。20 mL 玻璃樣品瓶中加入5 mL 葡萄酒樣品、1 g NaCl 和10 μL 內(nèi)標(biāo)（4-甲基2-戊醇，1.008 6 g·L-1），然后迅速用帶有聚四氟乙烯隔墊的蓋子擰緊。樣品瓶在40 ℃加熱槽中振蕩30 min（500 r·min-1），然后將已活化的SPME 萃取頭插入樣品瓶的頂空部分，40 ℃繼續(xù)振蕩30 min，取出SPME 萃取頭，立即插入氣相色譜進(jìn)樣口，進(jìn)樣口溫度為250 ℃，熱解析8 min。每個(gè)樣品重復(fù)萃取3 次。

（2）氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用分析條件。色譜柱：HP-INNOWAX（60 m×0.25 mm，0.25 μm）；載 氣為高純氦氣（＞99.999%），流速為1.0 mL·min-1；采用5 ∶1 分流進(jìn)樣，進(jìn)樣口溫度為250 ℃；柱溫箱升溫程序：起始溫度為50 ℃，保持1 min，然后以3 ℃·min-1升溫至220 ℃，保持5 min。質(zhì)譜采用電子轟擊離子源，電離能量為70 eV，離子源溫度為230 ℃，四極桿溫度為150 ℃，輔助加熱器溫度為250 ℃，質(zhì)量掃描范圍為30～350 unit。

1.3.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 22.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

本研究中，通過(guò)氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)共檢測(cè)到63 種香氣物質(zhì)，包括3 種C6 醇類物質(zhì)、9 種芳香族類物質(zhì)、17 種高級(jí)醇類物質(zhì)、2 種降異戊二烯類物質(zhì)、3 種萜烯類物質(zhì)、2 種醛/酮類物質(zhì)、6 種脂肪酸類物質(zhì)、20 種酯類物質(zhì)和1 種其他類物質(zhì)。

2.1 C6 醇類物質(zhì)

與對(duì)照組相比，葉面噴施處理顯著提高了葡萄酒中的1-己醇和(E)-3-己烯-1-醇兩種C6 醇類物質(zhì)的濃度（表1）。一般來(lái)說(shuō)，植物中來(lái)自脂氧合途徑的揮發(fā)性化合物主要有C6 和C9 的醛、醇和酯，這些物質(zhì)來(lái)自亞油酸和亞麻酸的降解。六碳直鏈脂肪族類化合物因具有典型的綠葉香氣而被統(tǒng)稱為“綠葉氣味化合物”[7]。對(duì)于紅葡萄酒來(lái)說(shuō)，C6 醇類物質(zhì)會(huì)給葡萄酒帶來(lái)生青味，從而給人留下不成熟的感官印象。在本研究中，葉面噴施組對(duì)于C6 醇類物質(zhì)的提升會(huì)加重葡萄酒的生青味，因此對(duì)葡萄酒有不利的影響。

表1 噴施酵母提取物對(duì)葡萄酒香氣物質(zhì)的影響表 單位：μg·L-1

2.2 芳香族類物質(zhì)

芳香族類物質(zhì)對(duì)葡萄酒的香氣也具有一定影響。本研究中檢測(cè)到的9 種芳香族類物質(zhì)中，對(duì)照組和噴施組之間沒(méi)有顯著差異（表1）。

2.3 高級(jí)醇類物質(zhì)

高級(jí)醇又稱雜醇，一般指具有兩個(gè)以上的碳原子的一元醇，是酵母代謝中的重要副產(chǎn)物[8]。葡萄酒中低濃度的高級(jí)醇會(huì)增加葡萄酒的香氣復(fù)雜性；高濃度雜醇會(huì)給葡萄酒帶來(lái)異味，容易引起飲酒后“上頭”，甚至給身體健康造成傷害。在檢測(cè)到的17 中高級(jí)醇類物質(zhì)中，僅有2-甲基-1-丁醇受到噴施處理的顯著影響（表1），且在噴施處理葡萄酒中具有較低的濃度。

2.4 萜烯和降異戊二烯類物質(zhì)

萜烯和降異戊二烯是葡萄果實(shí)中的香氣物質(zhì)，二者在釀酒葡萄中的含量相對(duì)較低，均來(lái)源于異戊二烯代謝，閾值較低，主要呈現(xiàn)花果香氣，且多以糖苷結(jié)合態(tài)的形式存在。其糖苷結(jié)合態(tài)可經(jīng)過(guò)酶解或酸解，形成游離態(tài)香氣，對(duì)葡萄果實(shí)及葡萄酒的香氣有著極其重要的作用。在麝香型的葡萄品種中，萜烯類化合物是品種香的主要貢獻(xiàn)者，而在非芳香型的葡萄果實(shí)中，萜烯類化合物的含量通常較低，而降異戊二烯的含量總是遠(yuǎn)高于閾值，主要為β-大馬士酮，為‘赤霞珠’等非芳香型葡萄品種的葡萄酒提供了怡人的“玫瑰花”香。在本研究中，噴施組處理顯著提高了葡萄酒中的香葉基丙酮和香茅醇的濃度，其中香葉基丙酮的含量提升了41%，香茅醇的含量提升了30%（表1）。這表明噴施組對(duì)葡萄酒中的花香和果香具有促進(jìn)作用。

2.5 脂肪酸類物質(zhì)

脂肪酸作為一類重要的植物主代謝產(chǎn)物，在植物的生長(zhǎng)發(fā)育中起主要作用，其合成是植物適應(yīng)外界環(huán)境條件的結(jié)果。一些直鏈脂肪族飽和或不飽和的脂肪醇、脂肪酮、脂肪酸酯類物質(zhì)均來(lái)自果實(shí)中脂肪酸的降解，這類香氣物質(zhì)通過(guò)影響葡萄果實(shí)香氣對(duì)葡萄酒的香氣產(chǎn)生影響。發(fā)酵香氣主要來(lái)源于糖代謝和氨基酸代謝途徑，屬于酵母等微生物代謝組產(chǎn)生的副產(chǎn)物，包括乙醇、高級(jí)醇、脂肪酸等，這類香氣成分在總香味物質(zhì)中一般占有較高的比例。在測(cè)定的6 種脂肪酸物質(zhì)中，噴施組顯著提高了葡萄酒中辛酸和癸酸的含量（表1）。

2.6 酯類物質(zhì)

除以上香氣物質(zhì)，酯類物質(zhì)受噴施處理的影響也較大。本文測(cè)定出的20 種酯類物質(zhì)中，8 種物質(zhì)均受到噴施的顯著影響（表1）。噴施處理后，丁酸乙酯、己酸乙酯、辛酸甲酯、己酸異戊酯、壬酸乙酯、癸酸乙酯、丁二酸二乙酯和9-癸烯酸乙酯的濃度均顯著提升。表明葉面噴施酵母提取物處理能夠提升葡萄酒中的果香，這與之前分析的萜烯和降異戊二烯兩類物質(zhì)的結(jié)果一致。

3 結(jié)論

本研究探究了噴施酵母提取物對(duì)赤霞珠葡萄酒中香氣物質(zhì)的影響，采用頂空固相微萃取-氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法測(cè)定葡萄酒中香氣物質(zhì)，共檢測(cè)出63 種香氣物質(zhì)。從結(jié)果來(lái)看，葉面噴施酵母提取物提高了葡萄酒中的萜烯、降異戊二烯和酯類物質(zhì)的濃度，對(duì)葡萄酒中的花香和果香有顯著的提升作用。但噴施酵母提取物同時(shí)也提高了葡萄酒中C6 醇類物質(zhì)的濃度，增加了葡萄酒的生青味，有一定的負(fù)面影響。