血必凈對腹主動脈阻斷合并膿毒癥大鼠心肌的影響

夏文芳，周青山，徐 潔

(武漢大學(xué)人民醫(yī)院，湖北武漢430060)

腹主動脈阻斷術(shù)(AAC)會造成缺血再灌注損傷(IRI)，影響缺血組織及遠隔臟器的結(jié)構(gòu)與功能，膿毒癥易誘發(fā)膿毒性休克，在外科領(lǐng)域常見缺血再灌注與膿毒癥的聯(lián)合存在，在這種雙重打擊下易誘發(fā)多器官功能不全綜合征(MODS)，是引起死亡的重要原因。心臟是多種應(yīng)激因素作用的首要靶器官［1］，在發(fā)病過程中受影響較大。血必凈注射液具有活血化瘀、疏通經(jīng)絡(luò)、潰散毒邪的作用，其對膿毒癥具有較好的臨床療效。本實驗觀察了血必凈注射液對腹主動脈阻斷術(shù)后合并膿毒癥大鼠心肌的保護作用，現(xiàn)報道如下。

1 實驗資料

1.1 藥品與試劑 血必凈注射液(國藥準字Z20040033)1．5 g/mL，由天津紅日藥業(yè)股份有限公司提供;兔抗大鼠TNF-α抗體、兔抗大鼠β2腎上腺素能受體、SABC試劑盒由武漢博士德生物有限公司提供;DAB顯色劑和脂多糖內(nèi)毒素(LPS)由SIGMA公司提供。

1.2 實驗動物及分組 SPF級Wistar大鼠32只，雌雄不限，體質(zhì)量(250±30)g，由湖北省疾病預(yù)防控制中心提供。實驗前12 h禁食，可自由飲水。將動物隨機分為3組(n為實際造模成功數(shù)目，不計死亡動物):對照組(S組，n=8)僅分離腹主動脈但不夾閉，不應(yīng)用血必凈，不注射內(nèi)毒素，僅于對應(yīng)時點尾靜脈注射及腹腔注射等量生理鹽水。腹主動脈阻斷合并膿毒癥組(I/R+LPS組，n=8)分離腹主動脈前30 min尾靜脈注射8 mL/kg生理鹽水，腹主動脈阻斷20 min后開放進行再灌注，再灌注2 h后腹腔注射LPS 20 mg/kg。血必凈組(XBJ組，n=8)分離腹主動脈前30 min進行血必凈預(yù)處理，尾靜脈注射8 mL/kg血必凈注射液，腹主動脈阻斷20 min后開放進行再灌注，再灌注2 h后腹腔注射LPS 20 mg/kg。

1.3 模型制備 右側(cè)臥位，經(jīng)側(cè)腹切口，腹膜后分離出腹主動脈及左腎動脈，在靠近膈肌處以無創(chuàng)動脈夾夾閉腹主動脈，夾閉即刻，可見大鼠左腎立即由紅色轉(zhuǎn)為蒼白，隨后出現(xiàn)花斑狀改變，松開動脈夾后顏色轉(zhuǎn)紅，證明缺血再灌注造模成功，再灌注后2 h腹腔注射LPS20 mg/kg即制備出雙重打擊模型。

1.4 指標檢測及圖像采集 在腹主動脈阻斷后8 h開胸取心，于4%多聚甲醛溶液中固定，脫水、透明、石蠟包埋，制備4 μm連續(xù)切片，行HE染色，光鏡下對各組進行組織形態(tài)學(xué)對比觀察。免疫組化染色參照博士德公司免疫組化SABC法完成，檢測各組心肌中TNF-α、β2腎上腺素能受體的表達情況，并設(shè)置陰性對照。采用Image-proplus 6．0圖像分析系統(tǒng)，對免疫組織化學(xué)染色結(jié)果進行分析，測量圖片中每個視野的平均積分光密度(MOD)。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS17．0統(tǒng)計軟件處理，計量資料用均數(shù)±標準差(±s)表示，采用F檢驗，單因素ANOVA分析。P＜0．05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 病死率 S組，造模8只，存活8只;I/R+LPS組，造模14只，存活8只，病死率43%;XBJ組，造模10只，存活8只，病死率為20%。

2.2 光鏡下心臟組織病理學(xué)表現(xiàn) S組:染色均勻，心肌組織形態(tài)正常，心肌纖維排列規(guī)則，肌間隙未見明顯炎細胞浸潤及紅細胞漏出，見圖1。I/R+LPS組:心肌細胞明顯腫脹，肌間隙增寬，小血管充血明顯，內(nèi)有大量紅細胞聚集，肌間隙內(nèi)可見大量紅細胞漏出，纖維變性、壞死，肌間隙炎性細胞明顯增多聚集、貼壁，甚至出現(xiàn)結(jié)構(gòu)模糊的溶斷現(xiàn)象，見圖2。XBJ組:心肌組織紊亂，心肌細胞略腫脹或皺縮，部分心肌纖維斷裂，肌間隙內(nèi)可見紅細胞漏出、炎性細胞浸潤，見圖3。

圖1 S組大鼠心臟組織病理學(xué)表現(xiàn)(HE法×200)

圖2 I/R+LPS組大鼠心臟組織病理學(xué)表現(xiàn)(HE法×200)

圖3 XBJ組大鼠心臟組織病理學(xué)表現(xiàn)(HE法×200)

2.3 免疫組織化學(xué)染色檢測結(jié)果 S組心肌TNF-αMOD 0．101 4±0．009 1，I/R+LPS組心肌 TNF- α MOD 0．128 9 ±0．015 3，XBJ組心肌 TNF- α MOD 0．113 7 ±0．016 1。心肌TNF-α表達數(shù)量S組＜XBJ組＜I/R+LPS組，各組間比較均有顯著性差異(P均＜0．05);S組心肌β2-AR MOD 0．110 7±0．007 9，I/R+LPS 組心肌 β2-AR MOD 0．107 2 ± 0．003 4，XBJ組心肌 β2-AR MOD 0．1082 ±0．0039。心肌 β2-AR 表達數(shù)量S組＞XBJ組＞I/R+LPS組，XBJ組與I/R+LPS及S組間比較均無顯著性差異，S組與I/R+LPS組間比較有顯著性差異(P＜0．05)。TNF-α、β2-AR的SABC法染色陰性對照切片均無陽性染色，陽性圖片分別見圖4～9。

圖4 S組大鼠心肌TNF-α的表達(棕黃色為陽性染色，SABC法×200)

圖5 I/R+LPS組大鼠心肌TNF-α的表達(棕黃色為陽性染色，SABC法×200)

圖6 XBJ組大鼠心肌TNF-α的表達(棕黃色為陽性染色，SABC法×200)

圖7 S組大鼠心肌β2-AR受體的表達(棕黃色為陽性染色，SABC法×200)

3 討 論

圖8 I/R+LPS組大鼠心肌β2-AR受體的表達(棕黃色為陽性染色，SABC法×200)

圖9 XBJ組大鼠心肌β2-AR受體的表達(棕黃色為陽性染色，SABC法×200)

腹主動脈阻斷所致缺血再灌注對心臟病理生理改變的影響仍無確切的定論，普遍認為與氧自由基釋放、中性粒細胞激活及炎性細胞因子釋放有重要關(guān)系［2］。膿毒癥時心功能抑制的發(fā)生率達40%，有7%的膿毒癥患者出現(xiàn)心功能衰竭［3］。引起心肌損傷的因素有多種，主要包括心肌抑制物的作用、心肌缺血和微循環(huán)功能障礙、自主神經(jīng)功能不全、心肌線粒體損傷、心肌細胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)失調(diào)、心肌細胞凋亡與心肌冬眠等。

TNF-α是一種具有多種生物學(xué)效應(yīng)的促炎癥細胞因子，在炎癥反應(yīng)中最早釋放，且能誘發(fā)促炎性細胞因子及次級炎癥遞質(zhì)的合成，在細胞和亞細胞水平上激發(fā)一系列級聯(lián)反應(yīng)［4］。心肌既是TNF-α作用的靶器官，又是合成TNF-α的場所。TNF-α導(dǎo)致的心肌功能障礙包括鈣平衡的改變、直接的細胞毒作用、氧化張力、興奮-收縮耦聯(lián)破壞、心肌細胞凋亡等［5-6］。缺血再灌注時，大鼠其他臟器產(chǎn)生的TNF-α進入血液循環(huán)，與心肌細胞本身產(chǎn)生的TNF-α一起對心臟造成損傷。TNF-α也是膿毒癥時最早釋放、起關(guān)鍵始動作用的細胞因子。膿毒癥的發(fā)展過程中，心肌細胞凋亡逐漸增加，凋亡指數(shù)與TNF-α成正相關(guān)［5］。有研究發(fā)現(xiàn)，阻斷TNF-α活性可預(yù)防脂多糖所致動物心功能不全并顯著改善內(nèi)毒素激發(fā)后的生存率［6］。

腎上腺素能受體(AR)是一類膜表面糖蛋白，它的內(nèi)源性激動劑為去甲腎上腺素和腎上腺素，分別由交感神經(jīng)末梢及腎上腺髓質(zhì)釋放，受體通過識別并選擇性地與兒茶酚胺類物質(zhì)特異性結(jié)合，引起細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路激活，從而產(chǎn)生一系列生理生化反應(yīng)，在心血管系統(tǒng)的調(diào)節(jié)如血壓、心率、心肌收縮、物質(zhì)代謝等方面具有十分重要的地位。β-AR分為β1、β2和β33個亞型，正常心肌β1-AR密度多于β2-AR，一般情況下，心肌細胞的收縮主要由β1-AR與Gs蛋白耦聯(lián)產(chǎn)生，β1-AR在正常成年大鼠心肌細胞的收縮中起主導(dǎo)作用，而β2-AR的作用機制較復(fù)雜:既可與Gs耦聯(lián)，引起收縮效應(yīng)，也可與Gi耦聯(lián)，產(chǎn)生抗凋亡效應(yīng)。盡管β2受體介導(dǎo)兒茶酚胺效應(yīng)在生理狀態(tài)下并不十分重要，但在心力衰竭的發(fā)展中起著不可忽視的作用［7］。β2-AR在炎癥反應(yīng)細胞因子網(wǎng)絡(luò)中還具有抗炎作用，可以抑制TNF-α激活、抑制白細胞黏附、降低毛細血管通透性等［8-9］。

在受損心臟中由于β1-AR的選擇性下調(diào)，β2-AR的生理作用可能顯著提高，既往研究表明增加β2-AR的表達可以改善心力衰竭大鼠心肌細胞的收縮功能［10］，刺激β2-AR可逆轉(zhuǎn)某些促心肌細胞凋亡的信號，同時還激活抗心肌細胞凋亡的信號，防止細胞凋亡，促進心肌細胞存活［11］。感染性休克時腎上腺素受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路多個水平發(fā)生改變，以致心血管對兒茶酚胺的敏感性降低，促進全身多器官功能障礙。這與心力衰竭中持續(xù)的高兒茶酚胺刺激可導(dǎo)致β1-AR和β2-AR脫敏有相似之處。有研究證明，感染性休克早期出現(xiàn)大鼠肝臟β2-AR mRNA轉(zhuǎn)錄降低、降解加快，導(dǎo)致β2-AR基因表達下調(diào)，β2-AR的蛋白表達和受體密度下調(diào)［12］。

血必凈注射液主要成分為中藥的提取物紅花黃色素A、赤芍甙等，具有活血化瘀、疏通經(jīng)絡(luò)、潰散毒邪的作用，而血瘀毒結(jié)是膿毒癥的主要病理基礎(chǔ)，故而血必凈的對病對證的應(yīng)用符合中醫(yī)辨治理論。血必凈與西醫(yī)常規(guī)療法并用治療膿毒癥已取得了較好的臨床療效。

目前關(guān)于血必凈注射液對膿毒癥所致心臟功能障礙的保護作用主要有以下幾個方面:①對心肌抑制物的作用和對心肌損傷的保護作用。血必凈有拮抗內(nèi)毒素作用;下調(diào)TNF-α、IL-1β水平，降低TnⅠ、BNP水平，降低心肌組織TLR4的表達、抑制TLR4通路的激活［13-15］。②對血流動力學(xué)和氧代謝的影響。血必凈干預(yù)能迅速逆轉(zhuǎn)膿毒性休克的血流動力學(xué)異常，明顯改善外周血管功能，降低肺血管阻力，改善心功能;使患者的氧供需平衡得到改善，改善膿毒性休克的預(yù)后［16］。③免疫調(diào)節(jié)作用。有研究顯示，膿毒癥大鼠早期Th1/Th2明顯升高，后期明顯下降。血必凈組Th1/Th2僅在72 h才明顯升高，且明顯降低TNF-α和IL-10的水平，使促炎與抗炎達到平衡［16］。說明血必凈能改善膿毒癥的免疫功能狀態(tài)，從而減輕炎癥因子對心臟的影響。

本研究以大鼠腹主動脈阻斷致缺血再灌注損傷后合并內(nèi)毒素致膿毒癥模型及血必凈注射液進行預(yù)處理的模型作為研究對象，觀察大鼠心臟受打擊前后及血必凈預(yù)處理前后的基本病理學(xué)改變及心肌中TNF-α、β2-AR的表達變化。研究發(fā)現(xiàn)I/R+LPS組大鼠的病死率最高，S組無死亡，XBJ組的病死率低于I/R+LPS組，表明血必凈注射液對缺血再灌注復(fù)合膿毒癥大鼠可能具有保護作用。心肌TNF-α表達數(shù)量S組＜XBJ組＜I/R+LPS組，S組心肌TNF-α上升幅度最大，說明TNF-α作為一種至關(guān)重要的前炎性因子，在缺血再灌注復(fù)合膿毒癥早期心肌損傷中發(fā)揮了重要作用。XBJ組TNF-α的表達少于I/R+LPS組，說明血必凈注射液的拮抗內(nèi)毒素作用及下調(diào)TNF-α的作用在缺血再灌注復(fù)合膿毒癥的病理過程中同樣存在。β2-AR受體表達數(shù)量S組＞XBJ組＞I/R+LPS組，XBJ組與I/R+LPS及S組間比較均無顯著性差異，S組與I/R+LPS組間比較有顯著性差異，可能在受到缺血再灌注及膿毒癥的打擊后，心血管對兒茶酚胺的敏感性降低，β2-AR存在脫敏現(xiàn)象，受體密度下調(diào)，而進行血必凈注射液預(yù)處理尚無法有效阻止心血管應(yīng)激現(xiàn)象的發(fā)生，β2-AR對兒茶酚胺的脫敏現(xiàn)象仍然存在。關(guān)于TNF-α和β2-AR在缺血再灌注復(fù)合膿毒癥致心肌損傷中更確切的作用和機制還有待進一步研究。

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