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    青磚茶特色中藥茶飲的減肥作用研究

    2023-12-22 12:50:14解曉敏馬夢(mèng)君韋華琴
    茶葉通訊 2023年4期
    關(guān)鍵詞:青磚模組空白對(duì)照

    解曉敏,馬夢(mèng)君,韋華琴,武 陽(yáng),晏 彪,湯 民,楊 旭,馬 萍*

    1. 湖北科技學(xué)院 藥學(xué)院,湖北 咸寧 437100;2. 湖北省智慧康養(yǎng)產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院,湖北 咸寧 437100;3. 咸寧市農(nóng)業(yè)科學(xué)院,湖北 咸寧 437100;4. 湖北科技學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院/咸寧市健康環(huán)境工程技術(shù)研究中心,湖北 咸寧 437100

    近年來(lái),肥胖癥的發(fā)病率大幅度增加,然而更重要的是肥胖癥患者合并的多種其他疾病如糖尿病、高血壓、心血管疾病及心理健康等危險(xiǎn)程度已超過(guò)肥胖本身,且亞洲人患糖尿病和高血壓的絕對(duì)風(fēng)險(xiǎn)都高于其他人群[1,2]。當(dāng)患有慢性疾病如糖尿病和心血管疾病時(shí),與僅僅患有肥胖癥相比,殘疾率和死亡率都會(huì)顯著提高。因此,肥胖癥及其相關(guān)的代謝性疾病已成為影響人類(lèi)生活質(zhì)量的主要因素。

    氧化應(yīng)激是由體內(nèi)氧化與抗氧化作用之間不平衡引起的,最近越來(lái)越多的研究集中在中藥對(duì)抗氧化應(yīng)激的作用上[3]。據(jù)報(bào)道,決明子的各種提取物具有很強(qiáng)的抗氧化潛力。一種從決明子中分離出來(lái)的蒽醌衍生物Obtusin 具有顯著的抗氧化活性[4]。有研究報(bào)道,決明子在小鼠巨噬細(xì)胞中表現(xiàn)出抗炎和抗氧化作用[5]。有研究確定荷葉潛在的黃酮類(lèi)生物活性成分并通過(guò)細(xì)胞和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)其抗氧化和抗炎作用,為荷葉的食用和藥用價(jià)值提供參考[6]。茯苓是一種重要的真菌,具有很高的藥用和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[7]。有報(bào)道,茯苓激活肝FXR,可激活PPARa,抑制SREBP-1c,減少脂質(zhì)沉積[8]。絞股藍(lán),也被稱(chēng)為“絞股蘭”,是亞洲國(guó)家的傳統(tǒng)藥物和涼茶[9]。決明子、荷葉、茯苓和絞股藍(lán)都具有一定的調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝與降血脂的作用,并且決明子、荷葉及茯苓等都具有抗炎作用。

    茶作為天然飲料,具有多種藥理與保健功效[10,11]。青磚茶的減肥效果已被證明[12]。青磚茶中茶多酚、茶多糖含量較多,是青磚茶發(fā)揮藥理功效的主要化學(xué)物質(zhì)組分。有許多研究證明,茶多酚和茶多糖具有抗氧化及抗炎作用[13]。有研究表明,貯存年限會(huì)影響黑茶的品質(zhì),黑茶越陳越好[14]。本試驗(yàn)通過(guò)將十年青磚陳茶與一年新茶作對(duì)照,研究?jī)?chǔ)存年限對(duì)青磚茶品質(zhì)的影響。同時(shí)將青磚茶與決明子、荷葉、絞股藍(lán)和茯苓按3 ∶2 ∶2 ∶1 ∶2(質(zhì)量比)比例混勻制成青磚茶特色中藥減肥茶飲,探究青磚茶中藥特色茶飲緩解氧化應(yīng)激和炎癥效果,為中藥茶飲的開(kāi)發(fā)利用提供思路與參考。

    1 材料與方法

    1.1 試驗(yàn)動(dòng)物與試劑

    1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

    5 周齡SPF 級(jí)雄性C57BL/6J 小鼠48 只,批號(hào)SCXK(遼)20200001,購(gòu)自遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)股份有限公司,飼養(yǎng)于湖北科技學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物房。小鼠購(gòu)入后先適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周,試驗(yàn)期間小鼠均在室溫(24 ± 2)℃、相對(duì)濕度(50 ± 5)%、光/暗周期12 h/12 h 的環(huán)境下喂養(yǎng),并按試驗(yàn)動(dòng)物使用的3 R原則給予人道關(guān)懷。

    1.1.2 藥品與試劑

    2012 年青磚茶(執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)GB/T 9833.9—2002)、2022 年青磚茶(執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)GB/T 9833.9—2002)、茯苓(執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)《中國(guó)藥典》2020 年版第一部)、決明子(執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)《中國(guó)藥典》2020 年版)、荷葉(執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)《中國(guó)藥典》2020 年版)、絞股藍(lán)(執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)《中國(guó)藥典》2020 年版)及高脂飼料[許可證號(hào)SCXK(京)2008—0006,小黍有泰(北京)生物科技有限公司]。硫代巴比妥酸(批號(hào)20160226)、三氯乙酸(批號(hào)20180112)、氫氧化鈉(批號(hào)C14465746)等,均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;LDL 試劑盒(批號(hào)202203)、HDL試劑盒(批號(hào)202203)、TG 試劑盒(批號(hào)202203)、TC 試劑盒(批號(hào)202203)、8-OHdG 試劑盒(批號(hào)202203)、IL-6 試劑盒(批號(hào)202203)、IL-1β 試劑盒(批號(hào)202203),均購(gòu)自上海酶聯(lián)生物科技有限公司;活性氧ROS檢測(cè)試劑盒(批號(hào)22192211),北京普利萊基因技術(shù)有限公司。

    1.1.3 儀器設(shè)備

    電子天平(奧豪斯,常州);5424R 低溫冷凍離心機(jī)(Eppendorf,德國(guó));Power wave XS 酶標(biāo)儀、ELx800 熒光酶標(biāo)儀(美國(guó)Bio-Tek儀器有限公司);HH-42 三用電熱恒溫水箱(北京長(zhǎng)源實(shí)驗(yàn)儀器廠)。

    1.2 試驗(yàn)方法

    1.2.1 小鼠分組及處理

    適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后,將48 只5 周齡C57BL/6J雄性小鼠隨機(jī)分為4 組:空白對(duì)照組(Control)、肥胖模型組(Obesity)、新茶減肥組(New Tea,NT)和陳茶減肥組(Old Tea,OT),每組12 只。前5 周單純?cè)炷#o予空白對(duì)照組普通飼料喂養(yǎng),其他組均給予高脂飼料喂養(yǎng),期間每周測(cè)量身長(zhǎng)和體重。從第6 周開(kāi)始,NT 組給予灌胃2022 年青磚茶特色中藥茶飲(新茶),OT 組給予灌胃2012 年青磚茶特色中藥茶飲(十年陳茶)。Control 組和Obesity 組給予灌胃生理鹽水為對(duì)照,期間每天監(jiān)測(cè)小鼠體重,每周監(jiān)測(cè)小鼠體長(zhǎng)。第17 周結(jié)束給藥,肥胖模型組體重達(dá)正常對(duì)照組體重的120%,小鼠肥胖模型建立成功(圖1)。

    圖1 實(shí)驗(yàn)流程圖Figure 1 Experimental flow chart

    1.2.2 青磚茶特色中藥茶飲的配制

    分別將2022 年青磚茶、2012 年青磚茶、決明子、荷葉、絞股藍(lán)和茯苓用研磨打粉機(jī)磨成粉末,按照青磚茶、決明子、荷葉、絞股藍(lán)、茯苓的質(zhì)量比3 ∶2 ∶2 ∶1 ∶2 混勻制作成青磚茶特色中藥茶飲配方粉末。根據(jù)人體每天能夠承受的適宜飲茶量,依據(jù)《動(dòng)物與人體的每千克體重劑量折算系數(shù)表》(表1)轉(zhuǎn)換成小鼠每天最大飲茶量。具體方法為已知A 種動(dòng)物每千克體重用藥量,預(yù)估算B 種動(dòng)物每千克體重用藥劑量時(shí)可先通過(guò)表1 找出折算系數(shù)(W),再按下式計(jì)算:B種動(dòng)物的劑量(mg/kg)=W×A 種動(dòng)物的劑量(mg/kg)。已知人體可承受的青磚茶飲用量為17 g/d,需折算為小鼠量。查A 種動(dòng)物為成人,B 種動(dòng)物為小鼠,交叉點(diǎn)為折算系數(shù)W= 9.01,故小鼠每日灌胃青磚茶量應(yīng)為2.56 mg/g。

    表1 動(dòng)物與人體體重劑量折算系數(shù)(W)表Table 1 Conversion coefficients (W) of dose per kilogram of body weight for animals and humans

    1.2.3 肥胖生化指標(biāo)測(cè)定

    造模成功后,將小鼠放入代謝籠中,12 h后將收集的尿液1500 r/min 離心10 min,取上清液分裝放置于-80℃冰箱。留取尿液后用10%水合氯醛麻醉小鼠,剪去小鼠頸部下方皮膚,露出小鼠胸骨柄及肋間,于左側(cè)第二肋間與第三肋間且靠近胸骨柄處用1 mL 注射器緩慢抽取心臟血液0.8 ~ 1.0 mL,再緩慢放入1.5 mL 的EP 管中,室溫下靜置30 min 后,25℃、3 000 r/min 條件下離心15 min,取上清液于新的EP管中放入-80℃冰箱,備用。

    小鼠心臟取血結(jié)束后,取完整的肝組織,用PBS(pH 7.5)洗凈,濾紙上吸干水分,稱(chēng)重,冰浴條件下根據(jù)肝組織凈重:PBS = 1 ∶9的體積比制成10%的肝組織勻漿。隨后在4℃、10 000 r/min 的條件下離心15 min,取上清液分裝放置于-80℃冰箱。使用ELISA 試劑盒檢測(cè)TG、TC、LDL 及HDL。操作步驟嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

    1.2.4 8-OH-dG 的測(cè)定

    使用ELISA 試劑盒檢測(cè)8-OH-dG。操作步驟嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

    1.2.5 炎癥因子的測(cè)定

    使用ELISA 試劑盒檢測(cè)IL-6 和IL-1β。操作步驟嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

    1.2.6 ROS 的測(cè)定

    使用DCFH-DA(2,7-dichlorofluorescin diacetate)探針?lè)椒?。用PBS : 肝勻漿上清 =9 ∶1 的體積比稀釋肝勻漿上清,并將熒光染料DCFA-DA 按1 ∶1 000 000 稀釋。之后再1 ∶1 加入稀釋勻漿液和稀釋后的DCFA-DA 熒光染料于酶標(biāo)板中,輕微搖勻,室溫下避光靜置5 min,置于酶標(biāo)儀中檢測(cè)吸光度。

    1.2.7 MDA 的測(cè)定

    取50 μL 肝勻漿上清及200 μL 0.6%TBA 至1.5 mL的EP管中,沸水浴煮15 min,冷水中降溫,10 000 r/min、4℃條件下離心5 min,取上清液100 μL 至酶標(biāo)板上,用全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀分別測(cè)量450 nm、532 nm 及600 nm 波長(zhǎng)下的吸光度。MDA濃度(mol·L-1)= 6.45(A532-A600)-0.56×A450。

    1.2.8 HE 及油紅O 染色肝臟組織病理學(xué)觀測(cè)

    將小鼠肝臟組織分離,切大小合適的塊狀組織,用4%多聚甲醛緩沖液固定48 h,制作病理切片,進(jìn)行蘇木精-伊紅(HE)和油紅O 染色,光學(xué)顯微鏡下觀察各組小鼠肝臟組織病理學(xué)變化情況。

    1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

    所有數(shù)據(jù)均以平均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)誤差(SEM)表示。日期分析和圖表生成使用GraphPad Prism 9.0 軟件(Origin Lab,Berkeley,CA,USA)進(jìn)行。方差比較后進(jìn)行Tukey-Kramer 檢驗(yàn)。p< 0.05被認(rèn)為具有顯著性差異。

    2 結(jié)果

    2.1 小鼠體重及身長(zhǎng)

    表2 和圖2 分別顯示各組小鼠最后一天體重及Lee’s 指數(shù)情況。與空白對(duì)照組相比,肥胖造模組的體重及Lee’s 指數(shù)明顯升高;與肥胖造模組相比,NT 組和OT 組的體重及Lee’s 指數(shù)均明顯下降。

    表2 青磚茶特色中藥茶飲對(duì)肥胖小鼠體重的影響Table 2 Effect of Qing brick tea special Chinese herbal tea on the body weight of obese mice

    圖2 不同處理組小鼠最后一天Lee’s 指數(shù)Figure 2 Lee’s index on the last day of mice in different treatment groups

    2.2 小鼠血清中TC、TG 含量及勻漿中TC、TG、HDL、LDL 含量

    圖3A 顯示各處理組小鼠血清中肥胖指標(biāo)TC、TG 含量的測(cè)定結(jié)果。與空白對(duì)照組相比,肥胖造模組TC 和TG 含量明顯升高;與肥胖造模組相比,NT 組和OT 組的TC 和TG 含量均明顯下降,且OT 組下降更為顯著;與NT 組比較,OT 組血清中TG 含量下降且有顯著性差異。

    圖3 小鼠TC、TG、HDL、LDL 含量Figure 3 TC, TG, HDL, LDL content in mice

    圖3B 顯示各處理組勻漿中肥胖指標(biāo)TC、TG、HDL 及LDL 含量的測(cè)定結(jié)果。與空白對(duì)照組相比,肥胖造模組TC、TG 及LDL 含量明顯升高;與肥胖造模組相比,NT 組和OT 組的TC、TG 及LDL 含量均明顯下降,且OT 組TC、TG 含量下降更為顯著;與NT 組比較,OT 組勻漿中TC 含量下降且有顯著性差異。

    圖3C 為各處理組小鼠肥胖指標(biāo)TC、TG、HDL 及LDL 的氣泡圖,圓圈大小及顏色深淺代表指標(biāo)含量的多少。與空白對(duì)照組相比,肥胖造模組TC、TG 及LDL 的圓圈更大且顏色更深;與肥胖造模組相比,NT 組和OT 組TC、TG 及LDL 的圓圈更小且顏色更淺,且OT 組比NT 組更為顯著。

    2.3 小鼠肝組織HE 染色及油紅O 染色

    與空白對(duì)照組比較,Obesity 組、NT 及OT組小鼠肝細(xì)胞內(nèi)存在大量脂質(zhì)空泡、氣球樣變性(圖4A,HE 染色),且Obesity 組最為明顯,NT 組次之。

    圖4 小鼠肝組織病理切片F(xiàn)igure 4 Histopathological section of mouse liver

    與空白對(duì)照組比較,Obesity 組、NT 及OT組小鼠肝細(xì)胞內(nèi)脂滴增多(圖4B,油紅O 染色)。NT 和OT 治療后,油紅染色均顯示肝細(xì)胞內(nèi)脂滴顯著減少且OT 組更為明顯。

    2.4 氧化應(yīng)激指標(biāo)

    與空白對(duì)照組相比,肥胖造模組ROS 和MDA 含量升高,具有顯著性差異;與肥胖造模組相比,NT 組和OT 組ROS、MDA 及8-OH-dG含量均明顯下降,且OT 組ROS 和MDA 含量下降更為顯著(圖5)。

    圖5 氧化應(yīng)激指標(biāo)的測(cè)定結(jié)果Figure 5 Measurement results of oxidative stress indicators

    2.5 炎癥因子變化

    如圖6 所示。與空白對(duì)照組相比,肥胖造模組IL-6 及IL-1β 均升高,且具顯著性差異;與肥胖造模組相比,NT 組和OT 組IL-6 含量明顯下降,且OT 組ROS 和MDA 含量下降更為顯著。

    圖6 炎癥因子測(cè)定結(jié)果Figure 6 Measurement results of inflammatory factors

    3 討論

    本研究所建立的肥胖癥模型是指體內(nèi)儲(chǔ)存的脂肪超過(guò)理想體重的20%以上[15],是一種由遺傳因素、環(huán)境因素等多種原因相互作用引起的慢性代謝性疾病,其發(fā)生機(jī)制是因?yàn)槟芰繑z入超過(guò)能量消耗導(dǎo)致體內(nèi)脂肪過(guò)度蓄積和體重超常。有研究表明,晝夜節(jié)律改變和腸道微生物對(duì)肥胖及其復(fù)雜的相關(guān)性代謝性疾病有關(guān)[14]。在控制肥胖和肥胖相關(guān)的代謝疾病漸漸成為一種全球流行病的趨勢(shì)下,我們主要從飲食方面入手探討青磚茶特色中藥茶飲的減肥效果及機(jī)制。

    小鼠日常標(biāo)準(zhǔn)食物的脂肪含量一般在17%左右[16]。為了建立肥胖模型,本試驗(yàn)使用的高脂食物脂肪含量達(dá)60%,幾乎是正常的三倍多。對(duì)野生型小鼠來(lái)說(shuō),長(zhǎng)期食用高脂食物會(huì)使體重快速增加,導(dǎo)致脂肪肝。目前,肥胖癥的表觀檢測(cè)指標(biāo)主要是體重和體長(zhǎng),處理組超過(guò)對(duì)照組20%視為肥胖,體長(zhǎng)以L(fǎng)ee’s 指數(shù)判斷。Lee’s[17]越大,則肥胖程度越高。本試驗(yàn)結(jié)果表明,Obesity 組的體重均超過(guò)了空白對(duì)照組平均體重的20%,即造模成功。與Obesity 組相比,NT 組和OT 組的體重及Lee’s 指數(shù)明顯下降,即均具有一定的減肥效果。

    進(jìn)一步的試驗(yàn)結(jié)果表明,HE 染色后肝組織的細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)分別被染色為藍(lán)色和紅色。與空白對(duì)照組相比,Obesity 模型組的肝臟出現(xiàn)脂肪變性、肝細(xì)胞腫大和細(xì)胞質(zhì)中大量脂肪滴空泡。顯然,NT 和OT 干預(yù)小鼠的肝臟腫大在一定程度上減輕了,細(xì)胞質(zhì)中的脂肪滴液泡減少了。與空白對(duì)照組比較,油紅O 染色后Obesity 組小鼠肝細(xì)胞內(nèi)脂滴增多,同時(shí)NT 組和OT 組相對(duì)不明顯,表明NT 和OT 顯著減輕了高脂飼料誘導(dǎo)的肝組織形態(tài)學(xué)變化且OT 組更明顯。以上病理切片表明,NT 和OT 組的中藥配方可減輕肥胖癥,且十年陳茶的效果更好。

    有文獻(xiàn)報(bào)道,在基線(xiàn)時(shí)肥胖與甘油三酯、總膽固醇和高密度脂蛋白膽固醇呈正相關(guān),與低密度脂蛋白呈負(fù)相關(guān)[18]。研究表明,多項(xiàng)肥胖指標(biāo)顯示出正相關(guān)的HDL-C 濃度,有文獻(xiàn)則表明當(dāng)脂肪攝入量增加時(shí)HDL-C 濃度會(huì)相應(yīng)下降,從而增加患者患上心臟病的危險(xiǎn)性[19]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示,Obesity 組小鼠甘油三酯、總膽固醇及低密度脂蛋白顯著升高,NT 和OT 組相對(duì)Obesity 組發(fā)生明顯的下降。

    從中醫(yī)的角度來(lái)看,中醫(yī)身體成分在人體成分分類(lèi)中起著核心作用[20]。根據(jù)中醫(yī)理論,肥胖屬于“濁證”范疇,主要是脾臟“升降失調(diào)”所致[21]。磚茶中的茶多酚促進(jìn)脂肪分解和減肥的生物活性受到了較廣泛的關(guān)注[22]。決明子、荷葉、茯苓和絞股藍(lán)等其具有的健脾、益氣、利濕作用,對(duì)于減肥有很大功效[23-26]。

    在肥胖癥中,脂肪量與人類(lèi)和動(dòng)物的全身氧化應(yīng)激有關(guān)[27]。在哺乳動(dòng)物中,肥胖和肥胖相關(guān)并發(fā)癥會(huì)影響線(xiàn)粒體代謝,從而有利于ROS 的產(chǎn)生和氧化應(yīng)激的發(fā)展[28]。8-羥基脫氧鳥(niǎo)苷(8-OH-dG)是一種氧化性DNA 損傷副產(chǎn)物,也是氧化應(yīng)激普遍存在的標(biāo)志物[29]。丙二醛(MDA)是脂質(zhì)過(guò)氧化過(guò)程的終產(chǎn)物之一,也是最常見(jiàn)的氧化應(yīng)激生物標(biāo)志物之一[30]。肥胖會(huì)增加氧化應(yīng)激引起的脂質(zhì)過(guò)氧化水平[31]。本研究探討了小鼠灌胃青磚茶特色中藥茶飲降脂是否會(huì)伴隨著氧化應(yīng)激的緩解,結(jié)果表明僅進(jìn)行高脂飼料喂養(yǎng)的小鼠ROS、MDA 及8-OHdG 含量均明顯增強(qiáng)。與Obesity 組相比,NT 組和OT 組的ROS、MDA 及8-OH-dG 含量顯著降低,表明小鼠灌胃青磚茶特色中藥茶飲降脂過(guò)程中伴隨著氧化應(yīng)激的緩解。有研究表明,炎癥是肥胖中氧化應(yīng)激升高的一種表現(xiàn)[32],同時(shí),也是另一個(gè)重要來(lái)源[33]。本試驗(yàn)同時(shí)探討了小鼠灌胃青磚茶特色中藥茶飲在降脂過(guò)程中是否伴隨著炎癥因子的產(chǎn)生。試驗(yàn)結(jié)果表明,與空白對(duì)照組比,Obesity 組、NT 組和OT 組的IL-6 含量顯著升高,且NT 組和OT 組相對(duì)于Obesity 組含量有明顯下降趨勢(shì)。說(shuō)明小鼠灌胃青磚茶特色中藥茶飲可以抑制氧化應(yīng)激因子的產(chǎn)生,促進(jìn)炎癥因子的釋放,達(dá)到減肥的效果,且陳茶比新茶更加明顯。

    綜上,青磚茶特色中藥配方可通過(guò)促進(jìn)炎癥因子的釋放,抑制氧化應(yīng)激因子的產(chǎn)生,達(dá)到減肥的效果,且陳茶比新茶更加明顯。

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