雙峰駝TLR1原核表達體系構建、抗體制備及組織表達分析

謝東旭 張睿 索南吉 劉柯江 王亭瑋 王雯慧

（甘肅農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，蘭州 730070）

Toll 樣受體 (Toll-like receptors, TLRs) 是天然免疫系統(tǒng)受體家族的代表，也是最早研究的一個模式識別受體 (Vijay, 2018)。1997 年，人類TLRs家族的發(fā)現(xiàn)是免疫學領域的重大突破 (孔偉梁等，2021)，迄今已在哺乳動物中發(fā)現(xiàn)了13 種不同類型的TLRs (TLR1 ～ TLR13) (尹淑園，2020)。目前已知，TLR1 是一種非催化性Ⅰ型跨膜糖蛋白，其受體間有著相似的結(jié)構。同時TLR1 可以和TLR2 通過螺線管結(jié)合形成異質(zhì)二聚體，此異質(zhì)二聚體能識別多種微生物配體和具有不同脂質(zhì)部分的脂蛋白，以此增加了對病原相關分子模式 (Pathogen-Associated Molecular Patterns, PAMPs) 的識別譜(Barre-Sinoussiet al., 1983; Qiuet al., 2021)。

TLR1 進化十分保守，從蛋白質(zhì)的C 端至N 端依次由胞內(nèi)區(qū)、跨膜區(qū)和膜外區(qū)構成 (Markset al., 2021)。胞內(nèi)區(qū)含有保守的TIR 結(jié)構域，用于與下游接頭分子的TIR 功能域特異性相互作用，起始下游信號級聯(lián)反應；跨膜區(qū)中跨膜結(jié)構域決定了TLR1 的亞細胞定位；膜外區(qū)中病原結(jié)合結(jié)構域與病原相關分子模式 (PAMPs) 的識別有關。TLR1 能夠識別三?；?(Guanet al., 2010)，識別后可激活MyD88 依賴的NF-кB 信號級聯(lián)反應，導致樹突狀細胞的成熟和遷移以及T 細胞的激活，從而促進炎癥因子的生成，參與病原體的殺傷(Masonet al., 2016)。因此，TLR1 在抗細菌、病毒、寄生蟲感染方面發(fā)揮著至關重要的作用。研究表明，TLR1 參與結(jié)核病、結(jié)腸炎、類風濕性關節(jié)炎、前列腺癌等多種疾病的調(diào)控 (Meli?et al.,2019)。

隨著對TLR1 研究的不斷深入，針對TLR1及其配體在預防和治療與天然免疫相關疾病方面的研究成為熱點 (Luchneret al., 2021)，對于TLR1 在天然免疫中作用機制的研究必不可少。此外雙峰駝對各種復雜氣候條件和病原體的耐受力極為獨特，其天然免疫力的作用不容忽視。一方面國內(nèi)外關于雙峰駝TLR1 在天然免疫中的研究匱乏，市場上也缺乏駝源性的TLR1 商品化抗體來支持研究；另一方面TLR1 在不同器官組織中的表達分布具有物種特異性 (唐娜等，2020)。因此，本研究試通過原核表達系統(tǒng)誘導蛋白表達，并制備兔抗雙峰駝TLR1 多克隆抗體，通過HE 染色和SABC 免疫組化法檢測其在雙峰駝心臟、肝臟、脾臟、肺臟和腎臟中的表達，以期為雙峰駝天然免疫機理研究提供抗體支撐的同時，為今后雙峰駝黏膜免疫系統(tǒng)和天然免疫機理研究積累材料。

1 研究方法

1.1 雙峰駝TLR1重組質(zhì)粒的構建

首先參照NCBI 數(shù)據(jù)庫，選擇雙峰駝TLR1基因序列 (XM_010962675.1)，選取編碼區(qū) (CDs)，通過DNAstar軟件將編碼區(qū)核苷酸序列翻譯為對應的氨基酸片段。隨后通過Protean 分析雙峰駝TLR1基因的抗原表位和親水性，選擇膜外區(qū)不含信號肽的氨基酸區(qū)域作為主要抗原位。通過SignaiP 4.1 Server 和TMHMM Server 2.0 分別進行信號肽和跨膜區(qū)分析，將高親水性信號肽和蛋白跨膜區(qū)截除，并截取蛋白膜外區(qū)抗原指數(shù)較高的序列 (預測分子質(zhì)量62 kDa)。通過Primer 5.0 進行酶切位點預測，添加酶切位點BamHI 和XhoI；最后將序列經(jīng)堿基優(yōu)化后送至金開瑞生物科技有限公司產(chǎn)品合成，后將基因序列連接到pET-B2M 載體上，隨后進行雙酶切驗證，并將酶切驗證后的重組質(zhì)粒凍干粉轉(zhuǎn)化進BL21 (DE3) 感受態(tài)細胞，提取質(zhì)粒測序分析，將測序正確的陽性重組質(zhì)粒命名為pET-B2M-TLR1。

1.2 重組蛋白TLR1的誘導表達及表達形式鑒定

將pET-B2M-TLR1 重組質(zhì)粒利用熱應激法轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細胞BL21 (DE3) 中，將重組菌命為pET-B2M-TLR1-BL21 (DE3)，挑選形態(tài)正常的單個菌落接種于LB固體培養(yǎng)基 (Kan+) 培養(yǎng)，放于恒溫搖床中37 ℃、220 r/min培養(yǎng)7 h；取該新鮮培養(yǎng)菌液50 μL 加入到5 mL LB 液體培養(yǎng)基 (Kan+) 中，恒溫搖床37 ℃、220 r/min 培養(yǎng)約2 h 至OD600值為0.6 ～ 0.8；在無菌條件下取出1 mL 菌液制樣，作為誘導前對照，剩余部分加入0.2 mmol/L 的IPTG 4 μL，恒溫搖床37 ℃、220 r/min培養(yǎng)6 h后收集菌體，進行SDS-PAGE檢測。為確定目的蛋白的表達形式，將菌體用超聲破碎并離心，分別取其上清液和沉淀制樣，進行SDS-PAGE檢測。

1.3 重組蛋白TLR1的純化

以最佳表達條件誘導重組蛋白TLR1 大量表達，使用PBS 磷酸鹽緩沖液將收集的菌體沉淀，經(jīng)離心混勻洗滌3次后，加入蛋白裂解抑制劑，并使用超聲破碎 (180 W破碎3 s，暫停4 s，直至菌液清亮)，用PBS 溶液將破碎的菌體洗滌2 次。用含鹽酸胍的Binding buffer 溶解液重懸沉淀，加入β-巰基乙醇使沉淀溶解、蛋白變性，經(jīng)過離心收集上清。將上清 (變性后的蛋白) 與Ni-NTA 鎳柱填料冰浴結(jié)合4 h，靜置后洗脫，參考康為世紀生物科技有限公司生產(chǎn)的His 標簽蛋白純化試劑盒中的操作說明，使用Washing Buffer 洗去雜蛋白，使用Elution Buffer 洗脫目的蛋白。之后用20 mmol/L 咪唑的洗脫液，洗去吸附力低的雜蛋白，500 mmol/L咪唑的洗脫液洗脫目的蛋白；之后測定洗脫后目的蛋白含量，進行SDS-PAGE分析檢測，分析純化效果。

1.4 動物免疫及多抗制備

健康的成年雄性日本大耳兔 (購自蘭州獸醫(yī)研究所實驗動物中心) 適應性飼喂1 周，觀察飲食及精神狀態(tài)，若無不良反應，則開始每隔1 周進行1 次免疫，共免疫4 次。將純化蛋白與弗氏完全佐劑1∶1混合乳化，通過腘淋巴結(jié)注射及背部皮下多點注射的方式免疫。首次免疫劑量為800 μg/mL 純化蛋白。1 周后進行第2 次免疫，將純化蛋白與等體積的弗氏不完全佐劑1∶1 混合乳化，使免疫劑量減半，第3 次免疫同第2 次，第4 次免疫取200 μL 的500 μg/mL 純化蛋白連續(xù)3 d 耳緣靜脈注射。待第4 次免疫結(jié)束1 周后，進行心臟采血，4 ℃、3 000 r/min 離心8 min 待血液分層后，分離血清，分裝放入超低溫冰箱保存。

1.5 TLR1多克隆抗體效價的檢測

將純化后的重組蛋白TLR1 作為抗原，置于96 孔酶標板每孔5 μg 于 4 ℃包被12 ～ 16 h，經(jīng)TBST 洗滌，脫脂奶粉封閉、TBST 洗滌后，加入按1∶2 000、1∶4 000、1∶8 000、1∶16 000、 1∶32 000、1∶64 000、1∶128 000 比例稀釋的兔血清，37 ℃孵育1 h，TBST 洗滌后加Abmart 生物醫(yī)藥有限公司生產(chǎn)的HRP 標記的山羊抗兔IgG 二抗(1∶8 000 稀釋)，37 ℃孵育1 h，TBST 洗滌后加TMB 顯色液 (現(xiàn)用現(xiàn)配)，置于暗室顯色10 min，顯出藍色時，加入2 mol/L 的H2SO4(每孔50 μL) 終止顯色，用酶標儀測波長450 nm下的OD450值。

1.6 TLR1多克隆抗體特異性的檢測

將純化的重組蛋白TLR1 經(jīng)常規(guī)電泳后，通過濕轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)印至PVDF 膜上，取出PVDF 膜放到封閉液中，37 ℃封閉1.5 h，倒出封閉液，加TBST 溶液37 ℃震蕩5 min，重復4 次。將一抗 (兔抗血清) 用封閉液按比例稀釋 (1∶1 000 稀釋)，37 ℃孵育1 h后，4 ℃孵育過夜；棄去一抗液體，經(jīng)TBST 溶液 ，37 ℃震蕩洗膜15 min，洗5 次，加HRP 標記的山羊抗兔IgG 二抗 (1∶8 000 稀釋) 37 ℃震蕩孵育2 h，后用TBST 溶液洗膜5 次，滴加ECL 化學發(fā)光液顯色，用蛋白發(fā)光印記儀曝光并拍照。

1.7 HE 染色和SABC 免疫組化法檢測TLR1 在雙峰駝組織中的表達

將本實驗室制好的雙峰駝心臟、肝臟、脾臟、肺臟和腎臟石蠟切片，進行HE 和SABC 免疫組化染色。使用BOSTER 生物工程有限公司生產(chǎn)的SABC-免疫組化試劑盒，將切片依次使用3% H2O2溶液、0.1%胰蛋白酶、BSA 封閉液分別作用15 min、30 min、40 min；兔抗血清一抗 (1∶1 000稀釋) 4 ℃孵育18 ～ 22 h；山羊抗兔IgG 二抗37 ℃孵育30 min；顯色、復染、脫水、透明、封片；使用光學顯微鏡觀察并拍照。

2 結(jié)果

2.1 TLR1重組質(zhì)粒的構建

預測分析雙峰駝TLR1 蛋白親水性和抗原表位(圖1A)，發(fā)現(xiàn)該蛋白為抗原指數(shù)較高的親水蛋白，預測信號肽發(fā)現(xiàn)該蛋白無信號肽 (圖1B)，預測其跨膜結(jié)構發(fā)現(xiàn)該蛋白共有796個氨基酸，其中氨基酸1 ～ 585 組成其膜外區(qū) (圖1C)，用Editseq (DNASTAR 7.0) 截取膜外區(qū)抗原指數(shù)較高的一段序列(區(qū)段：29 ～ 441aa，預測分子質(zhì)量62 kDa)，在序列兩端添加起始密碼子ATG 和終止密碼子TAG，最后將獲得的重組質(zhì)粒進行雙酶切驗證，最終預測該重組蛋白TLR1大小為62 kDa。

圖1 雙峰駝TLR1 蛋白生物學信息預測.A：雙峰駝TLR1 蛋白親水性與抗原指數(shù)的預測；B：雙峰駝TLR1 蛋白信號肽預測；C：雙峰駝TLR1蛋白跨膜區(qū)預測Fig.1 Prediction of biological information on the bactrian camel TLR1 protein. A: Prediction of the hydrophilicity and epitope of TLR1 protein in bactrian camel; B: Prediction of TLR1 protein signal peptide in bactrian camel; C: Prediction of TLR1 protein transmembrane in bactrian camel

2.2 重組質(zhì)粒pET-B2M-TLR1的表達及表達形式

將pET-B2M-TLR1- BL21 (DE3) 37 ℃培養(yǎng)至OD600為0.6 ～ 0.8 時，用0.2 mmol/L 的 IPTG 誘導7 h，收集菌體，SDS-PAGE 檢測，重組菌誘導后產(chǎn)物中有清晰的目的條帶；超聲破碎離心后的沉淀中蛋白的表達量更多一些，表明重組蛋白TLR1 在BL21 中成功表達，且主要以包涵體形式表達，大小約為62 kDa (圖2A)，與預測結(jié)果相符。

圖2 雙峰駝重組蛋白TLR1 的表達與純化. A：雙峰駝重組蛋白TLR1 表達的SDS-PAGE 檢測，M，蛋白分子質(zhì)量標準；1，未誘導重組蛋白；2，誘導后重組蛋白；3，上清；4，沉淀. B：雙峰駝重組蛋白TLR1 純化，M，蛋白分子質(zhì)量標準；1，純化后的蛋白Fig.2 Expression and purification of the recombinant protein TLR1 from the bactrian camel. A: SDS-PAGE detection of bactrian camel TLR1 recombinant protein expression, M, Protein marker; 1, Uninduced recombinant protein; 2, Induced recombinant protein; 3, Supernatant; 4, Precipitation. B: Purification of bactrian camel TLR1 recombinant protein, M, Protein marker; 1, Purified protein

2.3 TLR1蛋白的純化結(jié)果

將表達的重組蛋白TLR1 進行純化，從鎳柱上洗脫下來的純化蛋白，經(jīng)測定其最高蛋白含量大于2.5 mg/mL，SDS-PAGE 驗證，純化的蛋白純度良好，無雜蛋白，大小為62 kDa (圖2B)。

2.4 TLR1抗體血清效價的檢測結(jié)果

ELISA 結(jié)果顯示，兔抗TLR1 蛋白血清能與重組蛋白特異性結(jié)合，即具有免疫原性?？寡錚/N值OD450(平均值-空白) / OD450(陰性-空白) ≥ 2.1，視為血清呈陽性的有效稀釋 (表1)。血清抗體效價為對應的陽性最高稀釋度，即該血清抗體效價為1∶64 000。

表1 ELISA測定抗體血清效價Table1 Serum potency of antibodies determined by ELISA

2.5 TLR1抗體血清的Western blot鑒定結(jié)果

Western blot 測試結(jié)果顯示，在PVDF 膜上約62 kDa處有清晰的蛋白印跡條帶存在 (圖3)，表明該抗體能與重組蛋白TLR1 特異性結(jié)合，即雙峰駝重組蛋白TLR1具有良好的反應原性。

圖3 雙峰駝重組蛋白TLR1的Western blot 鑒定結(jié)果. M：蛋白分子質(zhì)量標準；1：陰性對照；2：多克隆抗體血清Fig.3 Western blotting identification results of recombinant protein of bactrian camel. M: Protein marker; 1: Negative control; 2: Purified serums

2.6 TLR1 抗體血清在雙峰駝組織器官中的表達分析

免疫組化結(jié)果顯示，TLR1 在雙峰駝心臟、肝臟、脾臟、肺臟和腎臟中均有表達，但在不同組織器官中的表達有所差異。

2.6.1 TLR1在雙峰駝心臟的表達

根據(jù)TLR1 在雙峰駝心臟組織中HE 和SABC免疫組化的染色結(jié)果觀察可見，心肌纖維在心肌膜中呈螺旋狀排列，心肌細胞的細胞核位于心肌纖維中央，較大并呈圓形或橢圓形，且著色明顯(圖4A)；在雙峰駝心肌纖維的心肌細胞中，TLR1陽性反應廣泛發(fā)生 (圖4C)；未加一抗的陰性對照組細胞核著色明顯，未見陽性反應物 (圖4B)。

圖4 TLR1在雙峰駝不同組織器官中的表達. A： 心臟蘇木精-伊紅染色 1 000 ×；B： 心臟陰性對照 1 000 ×；C：心臟免疫組化染色1 000 ×；D：肝臟蘇木精-伊紅染色 1 000 ×；E：肝臟陰性對照 1 000 ×；F：肝臟免疫組化染色 1 000 × (“?”指示的為枯否細胞，“?”指示的為肝細胞)；G：脾臟蘇木精-伊紅染色 1 000 ×；H：脾臟陰性對照 1 000 ×；I：脾臟免疫組化染色 1 000 × (“?”指示的為單核/巨噬細胞)；J：肺臟蘇木精-伊紅染色 1 000 ×；K：肺臟陰性對照 1 000 ×；L：肺臟免疫組化染色 1 000 × (“→”指示的為呼吸性細支氣管上皮細胞)；M：肺臟蘇木精-伊紅染色 1 000 ×；N：肺臟陰性對照 1 000 ×；O：肺臟免疫組化染色 1 000 × (“?”指示的為Ⅰ型肺泡細胞，“?”指示的為Ⅱ型肺泡細胞)；P：腎臟蘇木精-伊紅染色 1 000 ×；Q：腎臟陰性對照 1 000 ×；R：腎臟免疫組化染色 1 000 ×；S：腎小管蘇木精-伊紅染色 1 000 ×；T：腎小管陰性對照 1 000 ×；U：腎小管免疫組化染色 1 000 × (“?”指示為遠曲小管上皮細胞)Fig.4 TLR1 expression in different tissues and organs of bactrian camels. A: Heart hematoxylin-eosin staining 1 000 ×; B: Heart negative control 1 000 ×; C: Immunohistochemical staining of heart 1 000 ×; D: Liver hematoxylin-eosin staining 1 000 ×; E: Liver negative control 1 000 ×; F: Immunohistochemical staining of liver 1 000 × (‘?’indicates kwashiorkor cells and ‘?’indicates hepatocytes); G: Spleen hematoxylin-eosin staining 1 000 ×; H: Spleen negative control 1 000 ×; I: Immunohistochemical staining of spleen 1 000 × (‘?’indicate monocytes/macrophages);J: Lung hematoxylin-eosin staining 1 000 ×; K: Lung negative control 1 000 ×; L: Immunohistochemical staining of lung 1 000 × (‘→’indicates bronchial epithelial cells); M: Lung hematoxylin-eosin staining 1 000 ×; N: Lung negative control 1 000 ×; O: Immunohistochemical staining of lung 1 000× (‘?’ indicates typeⅠalveolar cells and‘?’indicates type Ⅱ alveolar cells); P: Kidney hematoxylin-eosin staining 1 000 ×; Q: Kidney negative control 1 000 ×; R: Immunohistochemical staining of kidney 1 000 ×; S: Kidney tubules hematoxylin-eosin staining 1 000 ×; T: Kidney tubules negative control 1 000 ×; U: Immunohistochemical staining of kidney tubules 1 000 × (‘?’indicate proximal tubule epithelial cells)

2.6.2 TLR1在雙峰駝肝臟的表達

根據(jù)染色結(jié)果觀察可見，在肝小葉中觀察到呈板狀排列，且細胞體積較大，呈多邊形排列，核仁明顯的細胞，初步判斷為肝細胞。在肝竇中，觀察到呈星形的細胞，附著在內(nèi)皮細胞表面，初步判斷為枯否細胞 (圖4D)；TLR1在肝竇的枯否細胞中陽性反應強烈，呈深棕色 (圖4F)；陰性對照組中細胞核著色明顯，未見陽性反應物 (圖4E)。

2.6.3 TLR1在雙峰駝脾臟的表達

根據(jù)染色結(jié)果觀察可見，在脾臟組織的白髓區(qū)，呈現(xiàn)大量深藍色輪廓清晰的細胞，初步判斷為T 細胞或者單核/巨噬細胞 (圖4G)；經(jīng)免疫組化染色后觀察到，在白髓區(qū)呈現(xiàn)圓形或不規(guī)則形、胞漿豐富、胞體巨大、卵圓形核的陽性細胞，判斷其為單核/巨噬細胞，表現(xiàn)強陽性反應 (圖4I)；陰性對照組中細胞核著色明顯，未見陽性反應物(圖4H)。

2.6.4 TLR1在雙峰駝肺臟的表達

根據(jù)染色結(jié)果觀察可見，在呼吸性細支氣管中，腔面起伏不平，被覆一層上皮細胞，初步判斷為單層纖毛柱狀上皮細胞，上皮下方散在分布少量的平滑肌細胞 (圖4J)；TLR1 在呼吸性細支氣管管壁的上皮細胞中陽性反應強烈，呈深棕色 (圖4L)；陰性對照組中上皮細胞與平滑肌細胞細胞核著色明顯，且未見陽性反應物 (圖4K)。

在肺泡的肺泡上皮中，可見胞核扁圓、胞體扁平的細胞與胞核較大、圓形、胞體略呈立方形的細胞連接緊密，初步判斷其分別為Ⅰ型肺泡細胞和Ⅱ型肺泡細胞 (圖4M)；TLR1 在肺泡上皮的Ⅰ型肺泡細胞和Ⅱ型肺泡細胞中呈陽性反應(圖4O)；陰性對照組中細胞核著色明顯，未見陽性反應物 (圖4N)。

2.6.5 TLR1在雙峰駝腎臟的表達

根據(jù)染色結(jié)果觀察可見，在雙峰駝腎臟的皮質(zhì)迷路的腎小體中分布有形態(tài)特殊、胞體大、形似足靴且緊貼于毛細血管基膜的細胞，初步判斷為足細胞 (圖4P)，在皮質(zhì)迷路的腎小體周圍分布有管腔大而規(guī)則的遠曲小管，且其上皮細胞細胞核呈圓形位于細胞中央，初步判斷為單層立方細胞 (圖4S)；經(jīng)免疫組化染色后觀察到，TLR1 在腎小體中無明顯的陽性反應，但在遠曲小管上皮細胞中出現(xiàn)強陽性反應 (圖4R、U)；陰性對照組中細胞核著色明顯，未見陽性反應物 (圖4Q、T)。

3 討論

雙峰駝作為我國荒漠地區(qū)特有畜種，在生物學特性上具有諸多優(yōu)勢，如耐鹽堿、耐高溫差、耐渴等，對復雜的氣候條件和病原體也具有獨特的耐受力，因此對其天然免疫作用的研究不容忽視。TLR1 是表達于天然免疫細胞、上皮細胞和內(nèi)皮細胞等細胞表面的重要模式識別受體，通過自身的富含亮氨酸的重復單位 (leucine-rich repeats,LRRs) 結(jié)構域識別PAMPs，刺激炎癥因子的生成，參與病原體的殺傷 (Rameshet al., 2015)。TLR1 的分子結(jié)構在不同物種間存在較大的差異，而且對于配體的識別具有種屬特異性 (Zhouet al., 2021)，因此對于不同物種間TLRs 的基因蛋白結(jié)構以及識別配體的種屬特異性研究，可進一步為疾病病原的識別，安全高效疫苗和藥物的研究提供理論依據(jù)。此外對TLR1基因多態(tài)性的研究結(jié)果顯示，TLR1基因的多態(tài)性與機體疾病的遺傳易感性密切相關。例如TLR1 的多態(tài)性位點248S 和S602I 能增加對結(jié)核病的易感性 (Noreen and Arshad, 2015)，rs5743611 與結(jié)腸炎的發(fā)生呈正相關。因此，可在相關疾病研究中將TLR1 作為研究的候選分子?；陔p峰駝TLR1 對配體識別的種屬特異性以及其基因多態(tài)性與疾病的相關性，為深入研究雙峰駝TLR1 在天然免疫抗病機制中發(fā)揮的作用及功能，以及進一步為病原識別、疫苗和藥物的研究提供物質(zhì)基礎，對TLR1 進行相應抗體的研究是必要的。

原核表達系統(tǒng)因其具有目的基因培養(yǎng)周期短、表達水平高、操作簡單、遺傳背景明確、經(jīng)濟、快速等特點，而成為制備抗體的最佳選擇。因此，本研究采用原核表達系統(tǒng)對雙峰駝TLR1 進行表達。另外，有研究表明，在原核表達系統(tǒng)中，密碼子優(yōu)化是增加目的蛋白表達量的一種途徑，且該方法已被廣泛應用于相關研究中 (陳徵婷等，2022)。因此，本研究對截取的基因序列進行了密碼子優(yōu)化，并成功構建了pET-B2M-TLR1 重組質(zhì)粒。有研究發(fā)現(xiàn)，在同等條件下，未去除信號肽的重組蛋白始終無法表達，去除信號肽的重組蛋白卻能成功表達 (Liuet al., 2019)，因此本研究對高親水性信號肽進行了截除，且通過原核表達系統(tǒng)高效地表達了雙峰駝重組蛋白TLR1。該重組蛋白通過經(jīng)典免疫法免疫日本大耳兔，制備了兔抗雙峰駝TLR1 多克隆抗體，通過間接ELISA 檢測抗體效價為1∶64 000，通過Western blot 檢測原核表達的重組蛋白TLR1 能與對應抗體特異性識別。本研究利用制備的兔抗雙峰駝TLR1 多克隆抗體，通過HE 染色和SABC 免疫組化技術，證明了雙峰駝TLR1 在其心臟的心肌細胞上呈陽性表達，推測TLR1 可能在維持心肌細胞正常電生理活動中發(fā)揮作用。TLR1 在肝臟的枯否細胞上呈陽性表達，枯否細胞是位于肝臟中的特殊巨噬細胞，是單核巨噬細胞系統(tǒng)的一部分，TLR1 可能參與枯否細胞清除血液中的外來抗原過程中相關抗原的識別過程。TLR1 在脾臟的單核巨噬細胞中呈陽性表達，脾臟作為機體重要的免疫器官，具有免疫防御性，TLR1 可能參與脾臟單核巨噬細胞吞噬含鐵血黃素、酸性磷酸酶等物質(zhì)的過程。TLR1 在肺臟的呼吸性細支氣管上皮細胞、Ⅰ型肺泡細胞和Ⅱ型肺泡細胞均呈陽性表達。肺臟作為機體與外界氣體交換的主要場所和病原體侵入機體的主要途徑，TLR1 作為重要的模式識別受體，可能參與肺臟天然免疫防御的過程。TLR1 在腎小管上皮細胞呈陽性表達，而腎小管上皮細胞作為非專職的抗原呈遞細胞，推測TLR1 可能在其中參與調(diào)節(jié)固有免疫和獲得性免疫，以及局部免疫微環(huán)境的形成過程。綜上所述，本研究利用原核表達系統(tǒng)成功制備出效價高、特異性良好的兔抗雙峰駝TLR1 多克隆抗體，且操作簡便、經(jīng)濟，為其商品化抗體的研發(fā)提供了物質(zhì)基礎。此外，利用HE 染色和SABC 免疫組化技術分析研究了TLR1 在雙峰駝心臟、肝臟、脾臟、肺臟和腎臟中的表達，表明抗體有良好的特異性，能夠用于實踐中對于TLR1 的識別與檢測，為進一步探究TLR1 在雙峰駝心臟、肝臟、脾臟、肺臟和腎臟中所扮演的角色奠定了基礎，為今后雙峰駝天然免疫機理的研究積累了材料。