高溫暴露對(duì)黑線倉(cāng)鼠能量代謝和組織氧化應(yīng)激的影響

張銳涵 羅丹 羅欣欣 胡陳曉 林瓏 陳倩 曹靜 趙志軍

（溫州大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，浙江省水環(huán)境與海洋生物資源保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，溫州 325035）

小型哺乳動(dòng)物能量代謝的適應(yīng)性調(diào)節(jié)是其應(yīng)對(duì)環(huán)境的重要生理學(xué)和行為學(xué)策略之一，對(duì)增強(qiáng)其適應(yīng)能力，提高生存機(jī)會(huì)具有重要意義 (王德華，2011; Liuet al., 2013; Zhanget al., 2018)。動(dòng)物的代謝水平影響其地理分布、生長(zhǎng)、發(fā)育、繁殖、衰老等很多生活史特征。生命的速度假說(shuō)(the rate of living theory, ROL) 認(rèn)為，壽命的長(zhǎng)短與代謝率的高低有關(guān)，代謝率越低的動(dòng)物壽命越長(zhǎng)。例如與體型較小的物種相比，體型較大的物種通常代謝率較低 (單位體重的代謝率)，壽命較長(zhǎng)。但是鳥(niǎo)類在靜止和活動(dòng)時(shí)均具有較高的代謝率，飛翔時(shí)機(jī)體最耗能 (Wardet al., 2004)，然而壽命卻長(zhǎng)于相同體型的哺乳動(dòng)物 (Holmeset al., 2001; Furness and Speakman, 2008)。在哺乳動(dòng)物中，蝙蝠的代謝水平較高，壽命較長(zhǎng) (Brunet-Rossinni and Austad, 2004)，而有袋類動(dòng)物的代謝率較低，壽命卻低于真哺乳亞綱類動(dòng)物 (Speakman and Selman,2011)。這些研究結(jié)果不支持ROL 假說(shuō)。而自由基假說(shuō) (the freeradical hypothesis) 認(rèn)為，不同代謝水平條件下，組織產(chǎn)生的自由基水平不同，造成的氧化損傷存在差異，是影響衰老和壽命的關(guān)鍵，例如雖然鳥(niǎo)類的代謝水平較高，但機(jī)體產(chǎn)生的自由基水平較低，因此壽命較長(zhǎng) (Barja and Herrero,1998; Pamplonaet al., 2005)，故此自由基假說(shuō)解釋了ROL假說(shuō)不能解釋的現(xiàn)象。

自由基是細(xì)胞代謝過(guò)程中產(chǎn)生的活性物質(zhì)，能夠誘發(fā)一系列的氧化反應(yīng)，被認(rèn)為是細(xì)胞內(nèi)能量代謝的副產(chǎn)物，其水平與代謝率的變化有關(guān)(Speakman and Selman, 2011)。正常情況下組織中抗氧化酶組成的機(jī)體抗氧化防御系統(tǒng)包括超氧化物歧化酶 (superoxide dismutase, SOD)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶 (glutathione peroxidase, GSH-Px)、過(guò)氧化氫酶等會(huì)及時(shí)清除自由基。但在代謝率發(fā)生顯著變化時(shí)，自由基產(chǎn)生的速率可能大于抗氧化防御能力，導(dǎo)致氧化應(yīng)激，造成組織脂質(zhì)、蛋白乃至核酸的氧化損傷 (Sohal, 2002; Speakmanet al.,2004; Selmanet al., 2013)。組織的自由基水平和氧化損傷與線粒體呼吸鏈的氧化磷酸化偶聯(lián)程度有關(guān)，例如對(duì)果蠅 (Drosophila melanogaster) 研究發(fā)現(xiàn)，增加線粒體呼吸率和解偶聯(lián)蛋白 (uncoupling protein, UCP) 的表達(dá)水平，顯著降低了自由基生成速率，果蠅的壽命延長(zhǎng) (Fridellet al., 2005)。適度增加線粒體氧化磷酸化解偶聯(lián)，可以降低自由基水平 (Echtayet al., 2002; Padalko, 2005)。對(duì)小鼠的研究發(fā)現(xiàn)，具有較高代謝率的個(gè)體，壽命較長(zhǎng)，肌肉解偶聯(lián)蛋白介導(dǎo)線粒體質(zhì)子漏也較高，自由基水平較低 (Speakmanet al., 2004)。然而低溫暴露大鼠 (Rattus norvegicus) 的代謝率顯著增加，但與此同時(shí)，肝臟、心臟和骨骼肌的自由基水平升高，氧化損傷顯著增加 (Vendittiet al., 2004)。由此可見(jiàn)，機(jī)體代謝率、組織線粒體呼吸率與氧化磷酸化偶聯(lián)程度都是影響自由基生成速率的重要因素 (Balabanet al., 2005)，但上述研究結(jié)果并不完全一致。

在自然環(huán)境因子中，溫度對(duì)能量代謝的影響尤為突出。動(dòng)物一般通過(guò)增加能量攝入和代謝產(chǎn)熱以應(yīng)對(duì)低溫環(huán)境 (王德華，2011; Xinget al.,2015, 2016; Xuet al., 2019a, 2019b)。隨全球氣候變暖，高溫?zé)崂税l(fā)生的頻率日益增加。季節(jié)性環(huán)境溫度升高，特別是在環(huán)境溫度接近甚至高于體溫的條件下，動(dòng)物體溫和環(huán)境溫度差距變小，機(jī)體的熱傳導(dǎo)率降低，散熱愈加困難 (Zhaoet al.,2020)。在高溫環(huán)境下，小型哺乳動(dòng)物增加散熱以維持恒定體溫，與此同時(shí)代謝率也顯著升高。然而動(dòng)物在低溫和高溫的環(huán)境下，代謝率均顯著增加，線粒體氧化磷酸化解偶聯(lián)程度的變化卻不盡相同。低溫下動(dòng)物褐色脂肪組織 (brown adipose tissue, BAT)、肝臟、骨骼肌等組織線粒體呼吸率顯著增加，解偶聯(lián)蛋白基因和蛋白表達(dá)水平顯著上調(diào)，氧化磷酸化解偶聯(lián)程度顯著增加 (Jastrochet al., 2007; Zhanget al., 2012)，而高溫下代謝率顯著增加，組織解偶聯(lián)蛋白表達(dá)水平卻顯著降低，氧化磷酸化解偶聯(lián)程度顯著降低 (Trayhurnet al.,1987; Hulbertet al., 2002)。因此在高溫馴化 (暴露) 條件下研究動(dòng)物代謝率、組織呼吸率及自由基水平的關(guān)系，可進(jìn)一步檢驗(yàn)自由基假說(shuō)，但相關(guān)研究尚未見(jiàn)報(bào)道。

黑線倉(cāng)鼠 (Cricetulus barabensis)，屬嚙齒目倉(cāng)鼠科倉(cāng)鼠亞科倉(cāng)鼠屬，廣泛分布于我國(guó)東北和華北地區(qū)的農(nóng)田和草原，棲息地氣候具有顯著季節(jié)性變化 (霍達(dá)亮等，2022)。黑線倉(cāng)鼠不冬眠，冬季低溫環(huán)境下代謝率顯著增加 (Zhaoet al., 2010；畢中強(qiáng)等，2018)。低溫暴露影響黑線倉(cāng)鼠肝臟、心臟、腎臟和肌肉等主要組織器官的自由基水平；不同器官或組織自由基水平不同 (Chenet al.,2014；陳可新等，2015)；代謝率與BAT 自由基水平可能存在負(fù)相關(guān)關(guān)系，BAT 的UCP1 可能在降低自由基生成方面發(fā)揮重要作用。為了探討高溫環(huán)境下能量代謝及主要代謝活性器官組織呼吸率、自由基水平和抗氧化能力的內(nèi)在聯(lián)系，研究機(jī)體在代謝率降低的條件下，肝臟、心臟、肺臟、腎臟、腦及肌肉氧化應(yīng)激和氧化損傷的變化，我們將室溫 (21 ℃) 和暖溫 (32.5 ℃) 馴化的黑線倉(cāng)鼠分別急性高溫暴露 (37 ℃)，測(cè)定代謝率，以及BAT、肝臟和肌肉的線粒體呼吸率，ucp基因表達(dá)，蛋白羰基和丙二醛 (malondialdehyde, MDA) 水平，以及SOD 和GSH-Px活性。我們假設(shè)急性高溫暴露使黑線倉(cāng)鼠代謝率顯著增加，但是線粒體呼吸率、解偶聯(lián)蛋白基因表達(dá)降低可能導(dǎo)致自由基水平升高，研究結(jié)果支持自由基假說(shuō)。

1 研究方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

實(shí)驗(yàn)用黑線倉(cāng)鼠為野生個(gè)體的繁殖后代，飼養(yǎng)于溫州大學(xué)動(dòng)物氣候室，溫度為 (21 ± 1) ℃，光照為12L∶12D (08: 00—20: 00 光照)，喂以標(biāo)準(zhǔn)鼠飼料 (北京科奧協(xié)力飼料有限公司，熱值為17.6 kJ/g)。動(dòng)物自由取食和飲水。選擇30 只3.5 ～ 4.0 月齡雌性黑線倉(cāng)鼠，單籠飼養(yǎng)適應(yīng)2周后，隨機(jī)分為4組：21℃組 (21 ℃,n= 7) 和21 ℃急性高溫暴露組(21℃-H,n= 7)，動(dòng)物在室溫條件下 (21 ℃) 飼養(yǎng)4 周；32.5℃組 (32.5 ℃,n= 8) 和32.5 ℃急性高溫暴露組 (32.5℃-H,n= 8)，動(dòng)物轉(zhuǎn)移至暖溫條件下 (32.5 ℃) 馴化4 周。期間動(dòng)物自由取食和飲水。此后21℃-H 組和32.5℃-H 組動(dòng)物分別轉(zhuǎn)入高溫環(huán)境 (37 ℃)，21℃-H 組動(dòng)物在46 h 和48 h 后各死亡1只，因此在48 h后終止急性高溫暴露。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物處理通過(guò)溫州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利和倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 攝入能和消化率的測(cè)定

在急性高溫暴露期間，以食物平衡法測(cè)定攝入能和消化率。稱量添加飼料的重量，48 h后再次稱量剩余食物重量，以前后兩次食物重量差值，再扣除飼養(yǎng)籠內(nèi)飼料殘?jiān)亓?，?jì)算攝食量。收集食物殘?jiān)|料和糞便置于恒溫干燥箱60 ℃烘至恒重，手工分離食物殘?jiān)图S便并稱量干重 (精確到0.001 g)。用氧彈熱量?jī)x (IKA C 2000，德國(guó))測(cè)定烘干后食物和糞便的熱值。攝入能、消化能及消化率按以下公式計(jì)算 (Grodzinski and Wunder,1975; Liuet al., 2013)：

1.3 體溫

在急性高溫暴露期間，連續(xù)測(cè)定動(dòng)物腹腔體溫 (body temperature, Tb)，在測(cè)定開(kāi)始前，將體溫傳感器植入動(dòng)物腹腔 (直徑2 mm 和長(zhǎng)度14 mm,Destron Fearing, South St Paul, USA)，使用Pocket Reader 接近飼養(yǎng)籠接收體溫信號(hào)并自動(dòng)存儲(chǔ)，在不干擾黑線倉(cāng)鼠活動(dòng)行為的情況下，獲取體溫?cái)?shù)據(jù)。每3 h 測(cè)定1 次體溫，連續(xù)測(cè)定48 h，測(cè)定結(jié)束后導(dǎo)出體溫?cái)?shù)據(jù)。

1.4 靜止代謝率 (resting metabolic rate, RMR) 和非顫抖性產(chǎn)熱 (nonshivering thermogenesis, NST)

急性高溫暴露48 h 后，立即測(cè)定動(dòng)物RMR和NST。RMR 和NST 以開(kāi)放式氧氣呼吸代謝儀(TSE, Germany) 測(cè)定。氣體經(jīng)氣泵送達(dá)呼吸室內(nèi)(1 000 mL/min)，呼吸室由生化培養(yǎng)箱控溫 (± 0.5 ℃)，呼吸室內(nèi)的氣體通過(guò)干燥后以380 mL/min 速率輸送至氧分析儀 (TSE system)，抽樣測(cè)定氧氣濃度。氧分析儀每10 s 記錄1 次數(shù)據(jù)，由標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)分析軟件 (TSE, Germany) 計(jì)算分析代謝率。RMR 測(cè)定溫度為 (30 ± 0.5) ℃ (屬于黑線倉(cāng)鼠的熱中性區(qū))，動(dòng)物放入呼吸室適應(yīng)1 h，RMR 連續(xù)測(cè)定2 h，以10 min 內(nèi)連續(xù)穩(wěn)定的最低值計(jì)算RMR。NST 以皮下注射重酒石酸去甲腎上腺素誘導(dǎo)的最大耗氧量來(lái)計(jì)算 (王建梅和王德華，2006; Zhaoet al.,2010)，劑量計(jì)算公式為：

NST 在 (25 ± 0.5) ℃下測(cè)定60 min。取10 min內(nèi)連續(xù)最大耗氧率的平均值計(jì)算NSTmax，以NSTmax和RMR 的差值計(jì)算NST，RMR、NSTmax和NST均校正至標(biāo)準(zhǔn)溫度和空氣壓力條件，表示為mLO2/h。

1.5 組織線粒體狀態(tài)4呼吸率和COX活性

組織線粒體狀態(tài)4 呼吸率是指在無(wú)ADP 供應(yīng)的條件下 (無(wú)ATP 生成)，線粒體內(nèi)膜的最大耗氧率，該耗氧主要用于質(zhì)子漏消耗的質(zhì)子勢(shì)能梯度，而非生成ATP (Iossaet al., 2004)。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后斷頸處死動(dòng)物。迅速分離腦、肩胛間BAT、心臟、肝臟、肺臟和腎臟和后腿部骨骼肌，置于液氮中速凍，轉(zhuǎn)移至-80 ℃冰柜保存?zhèn)溆谩Ｌ崛AT、肝臟、肌肉線粒體蛋白 (Zhao and Wang,2005)。狀態(tài)4 呼吸率使用液相氧電極 (Hansatech Instruments, DW-1, England) 測(cè)定，測(cè)定溫度為30 ℃，基質(zhì)液為225.0 mmol/L 蔗糖、50.0 mmol/L Tris、5.0 mmol/L MgCl2·6H2O、1.0 mmol/L EDTA和5.0 mmol/L KH2PO4(pH = 7.4)，以5.0 mmol/L琥珀酸和3.75 mol/L 魚(yú)藤酮為底物 (Macklin Biochemical Technology Co., Ltd.，上海)。COX活性也在30 ℃下測(cè)定，基質(zhì)液為7.5 mmol/L KH2PO4、3.75 mmol/L 抗壞血酸和0.3 mmol/L TMPD (pH =7.4)， 底物為細(xì)胞色素C (5 μL, 0.5 mg/mL,CAS9007-43-6, Macklin Co., Ltd.) (Zhao and Wang,2005)。

1.6 解偶聯(lián)蛋白實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析

用TRIzol 試劑 (TAKARA, China) 提取BAT、肝臟、肌肉總RNA，以RNA 為模板反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，然后使用羅氏實(shí)時(shí)熒光480 進(jìn)行熒光定量(Forrentrasse CH-6343 Rotkreuz, Switzerland)，反應(yīng)體系組成：模版cDNA 2 μL，SYBR Premix EX Tag TM (2 ×) 10 μL，引物序列見(jiàn)表1 (Zhaoet al., 2014)。

表1 引物序列Table 1 Gene specific primer sequence used for real-time RT-PCR analysis

1.7 器官組織MDA 和蛋白羰基水平，及SOD 和GSH-Px活性

取出肝臟、心臟、肺臟、腎臟、腦和骨骼肌，以預(yù)冷的0.9% NaCl 溶液將組織勻漿，勻漿液3 000 r/min離心15 min，取上清液。SOD以黃嘌呤氧化酶法 (羥胺法) 測(cè)定，取樣量為10%的勻漿液0.1 mL，在波長(zhǎng)550 nm 處測(cè)定光吸收值，SOD 活性表示為U/mg 蛋白。GSH-Px 活性以比色法測(cè)定(南京建成生物工程研究所) 在波長(zhǎng)420 nm 處的吸光度值，以每毫克蛋白每分鐘 (扣除非酶反應(yīng)的作用) 將反應(yīng)體系中GSH濃度降低1 μmol/L為一個(gè)酶活力單位，表示為U/mg。MDA 的測(cè)定體系為4.2 mL，取樣量為10%的勻漿液0.1 mL，532 nm處測(cè)定光吸收值，MDA 水平表示為nmol/mg 蛋白(南京建成生物工程研究所)。組織蛋白羰基含量以2, 4-二硝基苯肼 (DNPH) 比色法測(cè)定，被氧化后的蛋白質(zhì)羰基含量增多，羰基可與DNPH 反應(yīng)生成紅棕色2, 4-二硝基苯腙沉淀，將沉淀用鹽酸胍溶解后即可在分光光度計(jì)上讀取370 nm 下的吸光度值，羰基濃度用摩爾消光系數(shù)22 (mmol/L cm) 計(jì)算，羰基含量用每毫克蛋白含有多少納摩爾羰基表示 (Dubeyet al., 1996；段麗菊等，2005；陳可新等，2015)。用福林酚法測(cè)定勻漿上清液的蛋白濃度，以牛血清蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白。

1.8 統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)處理采用SPSS 13.0 軟件包。攝入能和消化率、體溫、RMR 和NST 以雙因素方差分析法(two way ANOVA) 或者協(xié)方差分析法 (ANCOVA)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以體重為協(xié)變量。組織狀態(tài)4呼吸率和COX 活性、ucp基因表達(dá)、組織MDA 和蛋白羰基水平、SOD 和GSH-Px活性采用雙因素方差分析法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。組間差異以Tukey post-hoc tests 多重比較進(jìn)行分析。文中數(shù)據(jù)以平均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)誤 (mean ± SE) 表示，P＜ 0.05 為差異顯著，P＜0.01為差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 攝入能和消化率

暖溫馴化對(duì)攝入能、糞能、消化能和消化率影響顯著，與21℃組相比，32.5℃組攝入能降低了25.2% (Ftem= 22.79，P＜ 0.01，圖1A)，糞能減少了51.6% (Ftem= 24.84，P＜ 0.01，圖1B)，消化能減少了18.2% (Ftem= 16.42，P＜ 0.01，圖1C)，而消化率顯著增加 (Ftem= 5.26，P＜ 0.05，圖1D)。攝入能、糞能和消化能受急性高溫暴露的顯著影響，21℃-H 組較21℃組分別降低了23.2%、40.5%和18.6% (攝入能，F(xiàn)h= 17.64，P＜ 0.01；糞能，F(xiàn)h= 6.74，P＜ 0.05；消化能，F(xiàn)h= 17.26，P＜ 0.01)；但32.5℃-H 組與32.5℃組相比未發(fā)現(xiàn)顯著變化 (post hoc,P＞ 0.05)。

2.2 體重、RMR和NST

暖溫馴化和急性高溫暴露對(duì)體重的影響不顯著 (Ftem= 0.21，P＞ 0.05，F(xiàn)h= 2.49，P＞ 0.05，圖1E)。RMR受暖溫馴化影響顯著，但未受急性高溫暴露的顯著影響 (Ftem= 15.05，P＜ 0.01，F(xiàn)h=1.56，P＞ 0.05，圖1F)。NSTmax和NST 受暖溫馴化的顯著影響，32.5℃組比21℃組分別降低了47.1%和53.0% (NSTmax，F(xiàn)tem= 45.98，P＜ 0.01；NST，F(xiàn)tem= 29.99，P＜ 0.01)，急性高溫暴露顯著降低了NSTmax和NST，21℃-H 組比21℃組分別降低了21.3% 和27.4% (NSTmax，F(xiàn)h= 6.14，P＜0.05，圖1G；NST，F(xiàn)h= 5.39，P＜ 0.05，圖1H)，32.5℃-H 組比32.5℃組分別降低了16.1% 和21.7%，但組間差異未達(dá)到顯著水平。

2.3 晝夜代謝率

晝夜代謝率受暖溫馴化和急性高溫暴露的影響顯著，暖溫馴化使夜間代謝率降低了34.6%，使晝間代謝率降低了49.3%；急性高溫暴露使21℃組夜間和晝間代謝率分別降低了47.6%和29.8%，但急性高溫暴露對(duì)32.5℃組代謝率的影響未達(dá)到顯著水平 (夜間代謝率，F(xiàn)tem= 47.55，P＜ 0.01，F(xiàn)h= 64.90，P＜ 0.01；晝間代謝率，F(xiàn)tem= 49.15，P＜ 0.01，F(xiàn)h= 4.16，P＜ 0.05，圖2A、B、E、F)。

圖2 高溫暴露對(duì)黑線倉(cāng)鼠代謝率和體溫的影響.21℃和32.5℃，動(dòng)物分別馴化于室溫 (21 ℃) 和暖溫 (32.5 ℃)；21℃-H 和32.5℃-H，馴化于室溫和暖溫的動(dòng)物分別急性暴露于高溫 (37 ℃)；數(shù)據(jù)為平均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)誤，Ph：高溫暴露的影響；*P ＜ 0.05, **P ＜ 0.01. 不同字母 (a、b、c) 表示組間差異顯著 (P ＜ 0.05)Fig. 2 Effect of high temperature on metabolic rate and body temperature of striped hamsters. 21℃ and 32.5℃, animals were kept at 21 ℃ or 32.5 ℃; 21℃-H and 32.5℃-H, animals that were kept at 21 ℃ or 32.5 ℃ were acutely exposed to hot temperature (37 ℃) for 48 hours. Data are mean ± SE. Ph: effect of acute hot exposure; *P ＜ 0.05, **P ＜ 0.01. Different letters (a, b, c) above the columns indicate significant difference between the groups (P ＜ 0.05)

2.4 體溫

暖溫馴化對(duì)體溫的影響未達(dá)到顯著水平 (Ftem=0.34,P＞ 0.05)，但急性高溫暴露顯著影響體溫，21℃-H 組顯著高于21℃組 (Fh=16.67，P＜ 0.01，repeated measures ANOVA，圖2C、D)。暖溫馴化對(duì)夜間平均體溫 (Ftem= 2.52,P＞ 0.05) 和晝間平均體溫 (Ftem= 0.09,P＞ 0.05) 的影響不顯著，但急性高溫暴露使夜間和晝間平均體溫顯著增加 (夜間，F(xiàn)h= 27.95，P＜ 0.01，圖2G；晝間，F(xiàn)h= 13.29，P＜ 0.01，圖2H)。

2.5 BAT、肝臟和肌肉的COX 活性和狀態(tài)4 呼吸率

暖溫馴化對(duì)BAT、肝臟和肌肉的COX 活性影響顯著，與21℃組相比，32.5℃組分別降低了84.2%、50.0%和56.6% (BAT，F(xiàn)tem= 22.35，P＜0.01，圖3A；肝臟，F(xiàn)tem= 19.16，P＜ 0.01，圖3B；肌肉，F(xiàn)tem= 42.93，P＜ 0.01，圖3C)。急性高溫暴露顯著抑制了肝臟的COX活性，21℃-H組比21℃組降低了23.3% (Fh= 4.48,P＜ 0.05; S-N-K post hoc,P＜ 0.05)，但對(duì)BAT 和肌肉COX 活性的影響未達(dá)到顯著水平 (BAT，F(xiàn)h= 3.51，P＞ 0.05；肌肉，F(xiàn)h= 0.09，P＞ 0.05)。BAT 狀態(tài)4 呼吸率受暖溫馴化和急性高溫暴露的顯著影響，與21℃組相比，21℃-H、32.5℃、32.5℃-H 組分別降低了53.0%、44.0%和56.2% (Ftem= 7.03，P＜ 0.05；Fh= 13.45，P＜ 0.01；S-N-K post hoc，P＜ 0.05，圖3D)。然而肝臟和肌肉的狀態(tài)4 呼吸率未受暖溫馴化和急性高溫暴露的顯著影響 (圖3E、F)。

圖3 高溫暴露對(duì)黑線倉(cāng)鼠線粒體COX 活性、狀態(tài)4 呼吸率和解偶聯(lián)蛋白表達(dá)的影響. 21℃和32.5℃，動(dòng)物分別馴化于室溫 (21 ℃) 和暖溫 (32.5 ℃)；21℃-H 和32.5℃-H，馴化于室溫和暖溫的動(dòng)物分別急性暴露于高溫 (37 ℃)；數(shù)據(jù)為平均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)誤，Ptem：溫度的影響，Ph：高溫暴露的影響；*P ＜ 0.05，**P ＜ 0.01. 不同字母 (a、b、c) 表示組間差異顯著 (P ＜ 0.05)Fig. 3 Effect of high temperature on cox activity, state 4 respiratory and uncoupling protein expression of striped hamsters. 21℃ and 32.5℃, animals were kept at 21℃ or 32.5 ℃; 21℃-H and 32.5℃-H, animals that were kept at 21 ℃ or 32.5 ℃ were acutely exposed to hot temperature(37 ℃) for 48 hours. Data are mean ± SE. Ptem: effect of temperature, Ph: effect of acute hot exposure; *P ＜ 0.05, **P ＜ 0.01. Different letters (a,b, c) above the columns indicate significant difference between the groups (P ＜ 0.05)

2.6 BAT、肝臟和肌肉的ucp基因表達(dá)

BAT的ucp1基因表達(dá)受暖溫馴化和急性高溫暴露的顯著影響，與21℃組相比，21℃-H、32.5℃、32.5℃-H 組分別降低了89.5%、80.1%和85.1%(Ftem= 51.09，P＜ 0.01；Fh= 80.07，P＜ 0.01；SN-K post hoc，P＜ 0.05，圖3G)。暖溫馴化和急性高溫暴露對(duì)肝臟ucp2基因表達(dá)的影響均未達(dá)到顯著水平 (Ftem= 3.58，P= 0.06；Fh= 3.07，P= 0.09，圖3H)，但二者的交互作用的影響顯著 (Ftem×h=5.44,P ＜0.05)。暖溫馴化對(duì)肌肉ucp3基因表達(dá)的影響未達(dá)到顯著水平 (Ftem= 0.88,P＞ 0.05)，急性高溫暴露顯著抑制了ucp3基因表達(dá)，21℃-H 組比21℃組降低了58.8% (Fh= 12.44，P＜ 0.01；S-NK post hoc，P＜ 0.05，圖3I)。

2.7 MDA和蛋白羰基水平

肝臟MDA 水平未受暖溫馴化和急性高溫暴露的顯著影響 (圖4A)。心臟、肺臟、腎臟和肌肉的MDA 水平均受暖溫馴化的顯著影響，32.5℃組比21℃組分別降低了11.4%、34.4%、24.5% 和44.0% (心臟，F(xiàn)tem= 8.36，P＜ 0.01，圖4B；肺臟，F(xiàn)tem= 11.07，P＜ 0.01，圖4C；腎臟，F(xiàn)tem=20.06，P＜ 0.01，圖4D；肌肉，F(xiàn)tem= 11.42，P＜0.01，圖4E)，但急性高溫暴露對(duì)這些組織MDA水平的影響未達(dá)到顯著水平 (心臟，F(xiàn)h= 0.26，P＞ 0.05；肺臟，F(xiàn)h= 0.02，P＞ 0.05；腎臟，F(xiàn)h=0.03，P＞ 0.05；肌肉，F(xiàn)h= 2.19，P＞ 0.05)。暖溫馴化和急性高溫暴露對(duì)腦組織MDA 水平的影響未達(dá)到顯著水平 (圖4F)。

圖4 高溫暴露對(duì)黑線倉(cāng)鼠肝臟、心臟、肺臟、腎臟、肌肉和腦的丙二醛、蛋白羰基、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶的影響.21℃和32.5℃，動(dòng)物分別馴化于室溫 (21 ℃) 和暖溫 (32.5 ℃)；21℃-H 和32.5℃-H，馴化于室溫和暖溫的動(dòng)物分別急性暴露于高溫(37 ℃)；數(shù)據(jù)為平均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)誤，Ptem：溫度的影響，Ph：高溫暴露的影響；*P ＜ 0.05，**P ＜ 0.01Fig. 4 Effect of high temperature on malondialdehyde (MDA), protein carbonyl, superoxide dismutase (SOD) and glutathione peroxidase (GSH-Px)in liver, heart, lung, kidney, muscle, and brain of striped hamsters. 21℃ and 32.5℃, animals were kept at 21 ℃ or 32.5 ℃; 21℃-H and 32.5℃-H,animals that were kept at 21 ℃ or 32.5 ℃ were acutely exposed to hot temperature (37 ℃) for 48 hours. Data are mean ± SE. Ptem: effect of temperature, Ph: effect of acute hot exposure; *P ＜ 0.05, **P ＜ 0.01

肝臟和心臟的蛋白羰基水平未受暖溫馴化的顯著影響 (肝臟，F(xiàn)tem= 0.20，P＞ 0.05，圖4G；心臟，F(xiàn)tem= 0.06，P＞ 0.05，圖4H)，但受急性高溫暴露的影響顯著，急性高溫暴露降低了蛋白羰基水平 (肝臟，F(xiàn)h= 19.84，P＜ 0.01；心臟，F(xiàn)h=4.95，P＜ 0.05)。暖溫馴化和急性高溫暴露對(duì)肺臟蛋白羰基水平的影響未達(dá)到顯著水平 (圖4I)。溫度對(duì)腎臟蛋白羰基水平的影響顯著 (Ftem= 6.71，P＜ 0.05，圖4J)，但急性高溫暴露的影響未達(dá)到顯著水平 (Fh= 1.46,P＞ 0.05)。暖溫馴化和急性高溫暴露對(duì)肌肉和腦組織蛋白羰基水平的影響均未達(dá)到顯著水平 (圖4K、L)。

2.8 SOD和GSH-Px活性

肝臟SOD 活性受暖溫馴化的影響顯著，32.5℃組比21℃組降低了33.7% (Ftem= 97.93，P＜ 0.01，圖4M)，但急性高溫暴露后肝臟SOD 活性未發(fā)生顯著變化 (Fh= 0.18,P＞ 0.05)。暖溫馴化和急性高溫暴露未顯著影響心臟 (圖4N)、肺臟 (圖4O) 和腎臟 (圖4P) 的SOD 活性。肌肉和腦組織SOD 活性受暖溫馴化的影響顯著，但急性高溫暴露后未發(fā)生顯著變化 (肌肉，F(xiàn)tem= 5.50，P＜0.05，F(xiàn)h= 1.53，P＞ 0.05，圖4Q；腦，F(xiàn)tem=4.88，P＜ 0.05，F(xiàn)h= 1.54，P＞ 0.05，圖4R)。

肝臟GSH-Px 活性在不同溫度組間未出現(xiàn)顯著差異，急性高溫暴露后也未發(fā)生顯著變化 (圖4S)。心臟、肺臟和腎臟GSH-Px 活性受暖溫馴化的影響顯著，32.5℃組比21℃組分別降低了20.6%、42.9%和24.0% (心臟，F(xiàn)tem= 25.91，P＜ 0.01，圖4T；肺臟，F(xiàn)tem= 48.98，P＜ 0.01，圖4U；腎臟，F(xiàn)tem= 20.68，P＜ 0.01，圖4V)，但急性高溫暴露后均未發(fā)現(xiàn)顯著變化。與上述組織不同，肌肉GSH-Px 活性受暖溫馴化和急性高溫暴露的影響顯著， 21℃-H 組比21℃組升高了25.6%，32.5℃-H 組比32.5℃組升高了10.4% (Ftem= 9.14，P＜ 0.01，F(xiàn)h= 8.87，P＜ 0.01，圖4W)。腦組織GSH-Px 活性未受暖溫馴化和急性高溫暴露的顯著影響 (圖4X)。

3 討論

溫度是自然界中最主要的環(huán)境因子之一，對(duì)動(dòng)物的生理和行為均具有顯著影響 (Zhang and Wang, 2007；王德華，2011; Zhanget al., 2018)。許多小型哺乳動(dòng)物通過(guò)能量代謝適應(yīng)性調(diào)節(jié)以應(yīng)對(duì)環(huán)境溫度的變化，其能量攝入和代謝產(chǎn)熱在低溫下顯著升高，而當(dāng)環(huán)境溫度升高時(shí)則顯著降低，從而維持穩(wěn)定的體溫調(diào)節(jié) (王德華，2011)。本研究發(fā)現(xiàn)，黑線倉(cāng)鼠在暖溫下攝入能、消化能和糞能顯著降低。這與其他嚙齒類動(dòng)物對(duì)溫度的反應(yīng)相似，如布氏田鼠 (Lasiopodomys brandtii)、長(zhǎng)爪沙鼠 (Meriones unguiculatus)、黑線毛足鼠 (Phodopus sungorus)、 白足鼠 (Peromyscus maniculatus sonoriensis) 等 (Hammondet al., 2001; Kauffmanet al., 2001; Song and Wang, 2006; Li and Wang,2007)，這些研究結(jié)果表明，降低能量攝入是小型哺乳動(dòng)物應(yīng)對(duì)暖溫環(huán)境的重要能量學(xué)對(duì)策。本研究還發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)期馴化于32.5 ℃的黑線倉(cāng)鼠在經(jīng)歷急性高溫 (37 ℃) 暴露后，其攝入能、消化能和糞能未發(fā)生顯著變化，暗示急性高溫對(duì)動(dòng)物能量攝入的影響可能與動(dòng)物生存的環(huán)境溫度有關(guān)，動(dòng)物生存的環(huán)境溫度越低，其能量攝入受急性高溫的影響越大。

動(dòng)物能量攝入的變化與能量支出有關(guān) (Kauffmanet al., 2001)。本研究發(fā)現(xiàn)暖溫下的黑線倉(cāng)鼠RMR 和NST 均顯著降低。隨著環(huán)境溫度升高，動(dòng)物的適應(yīng)性產(chǎn)熱速率一般會(huì)顯著降低，從而導(dǎo)致能量攝入降低，以此維持能量攝入與支出的平衡，進(jìn)而維持穩(wěn)定的體溫調(diào)節(jié) (Hammondet al., 2001;Kauffmanet al., 2001; Song and Wang, 2006; Li and Wang, 2007；王德華，2011)。許多小型哺乳動(dòng)物的研究結(jié)果與本文相似，反映了動(dòng)物應(yīng)對(duì)暖溫環(huán)境的一般適應(yīng)對(duì)策 (Hammondet al., 2001; Kauffmanet al., 2001)。本研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，生活在暖溫環(huán)境下的黑線倉(cāng)鼠適應(yīng)性產(chǎn)熱沒(méi)有受到急性高溫暴露的顯著影響，而生活在室溫下的黑線倉(cāng)鼠NSTmax和NST 在急性高溫暴露后分別降低了21.3%和27.4%，晝間和夜間平均體溫分別升高了1.4 ℃和2.0 ℃，暗示動(dòng)物生存的環(huán)境溫度越低，對(duì)極端高溫天氣的敏感性越高。

BAT、肝臟和肌肉是機(jī)體主要的代謝產(chǎn)熱器官，其線粒體呼吸率受溫度的顯著影響 (Hulbertet al., 2002; Zhang and Wang, 2007; Li and Wang,2007)。在低溫下，許多動(dòng)物的BAT、肝臟和肌肉線粒體呼吸率顯著升高，與其整體水平上代謝率和適應(yīng)性產(chǎn)熱的變化一致，是增加代謝產(chǎn)熱、維持穩(wěn)定體溫調(diào)節(jié)的重要機(jī)制之一 (Trayhurnet al.,1987; Hulbertet al., 2002; Zhang and Wang, 2007;Li and Wang, 2007; Jastrochet al., 2007; Zhanget al., 2012)。本研究發(fā)現(xiàn)，暖溫下黑線倉(cāng)鼠BAT、肝臟和肌肉COX 活性，以及BAT 狀態(tài)4 呼吸率均顯著降低。與此相似，暖溫環(huán)境下布氏田鼠、長(zhǎng)爪沙鼠、坎氏毛足鼠 (Phodopus campbelli) 和小鼠(Mus musculus) 等的COX 活性或者狀態(tài)4 呼吸率也顯著降低 (Heldmaier and Buchberger, 1985; Zhang and Wang, 2007; Li and Wang, 2007; Yanget al.,2013; Zhaoet al., 2022a)。本研究還發(fā)現(xiàn)，急性高溫暴露后肝臟COX 活性，以及BAT、肝臟和肌肉解偶聯(lián)蛋白表達(dá)顯著降低。這些研究結(jié)果再次證實(shí)，線粒體呼吸率和解偶聯(lián)率是適應(yīng)性產(chǎn)熱的分子機(jī)制 (Parkeret al., 2009)。本研究表明，溫度對(duì)代謝活性器官線粒體呼吸率的影響具有組織差異，BAT 對(duì)溫度的反應(yīng)較肝臟和骨骼肌更敏感；急性高溫暴露對(duì)線粒體呼吸率的影響與動(dòng)物生存的環(huán)境溫度有關(guān)，生存的環(huán)境溫度越低，受極端高溫的影響越大。

動(dòng)物的代謝水平與其生長(zhǎng)、發(fā)育、衰老和壽命等很多生活史特征相關(guān)，受環(huán)境溫度的影響 (Simonset al., 2011; Baoet al., 2020; Zhaoet al.,2022b)。自由基是代謝過(guò)程中產(chǎn)生的活性物質(zhì)，被認(rèn)為是細(xì)胞內(nèi)能量代謝的副產(chǎn)物，能夠誘發(fā)一系列的氧化反應(yīng)。組織自由基水平與代謝有關(guān)，自由基生成過(guò)量，會(huì)造成組織核酸損傷、蛋白損傷和脂質(zhì)損傷，或影響細(xì)胞的正常生理功能 (Sohal,2002; Speakmanet al., 2004; Speakman and Selman,2011; Selmanet al., 2013)。近年來(lái)，關(guān)于代謝率與壽命的關(guān)系，及其與組織自由基水平，或者氧化損傷的關(guān)系進(jìn)行了較為廣泛的研究。其中，自由基假說(shuō)是當(dāng)前闡述上述關(guān)系的主流假說(shuō)之一，該假說(shuō)認(rèn)為影響衰老和壽命的關(guān)鍵機(jī)制是組織產(chǎn)生的自由基水平，及其造成的氧化損傷，并與不同代謝水平密切相關(guān) (Echtayet al., 2002; Vendittiet al., 2004; Fridellet al., 2005; Padalko, 2005)。盡管自由基假說(shuō)解釋了ROL 假說(shuō)不能解釋的現(xiàn)象，但小鼠、大鼠、果蠅等模式生物的研究結(jié)果不盡相同 (Speakmanet al., 2004; Vendittiet al., 2004; Balabanet al., 2005; Fridellet al., 2005)。而本研究發(fā)現(xiàn)，馴化于暖溫環(huán)境的野生黑線倉(cāng)鼠肝臟和腦的MDA 水平未發(fā)生顯著變化，而心臟、肺臟、腎臟和肌肉的MDA 水平均顯著降低。自由基作用于脂質(zhì)發(fā)生過(guò)氧化反應(yīng)，氧化終產(chǎn)物為MDA，所以MDA 是反映組織脂質(zhì)氧化損傷程度的重要指標(biāo)之一 (Osorioet al., 2003)。蛋白羰基是衡量蛋白質(zhì)氧化損傷的最主要指標(biāo)之一，組織中蛋白羰基水平高低反映了蛋白質(zhì)氧化損傷程度的大小 (Haucket al., 2019)。本研究發(fā)現(xiàn)，馴化于暖溫環(huán)境的野生黑線倉(cāng)鼠肝臟、心臟、肺臟、肌肉和腦組織的蛋白羰基水平未發(fā)生顯著變化，而腎臟的蛋白羰基水平顯著升高。與本研究類似，不同溫度或不同繁殖狀態(tài)條件下的黑線倉(cāng)鼠、堤岸田鼠 (Myodes glareolus)、布氏田鼠、長(zhǎng)爪沙鼠等組織的氧化損傷程度不同 ( Sohalet al., 1995; Xuet al., 2014;Zhaoet al., 2015；陳可新等，2015；O?dakowski and Taylor, 2018; Khakisahnehet al., 2019)。這些研究結(jié)果雖然沒(méi)有涉及衰老和壽命等生活史特征，但也表明了機(jī)體的組織氧化應(yīng)激和氧化損傷具有組織差異。鑒于此，自由基假說(shuō)應(yīng)該考慮組織特異性的氧化應(yīng)激和損傷程度與代謝率的關(guān)系。

此外，本研究發(fā)現(xiàn)急性高溫暴露沒(méi)有顯著增加黑線倉(cāng)鼠肝臟、心臟、肺臟、腎臟、肌肉、腦組織MDA 和蛋白羰基水平。急性高溫暴露下的巖鼠 (Micaelamys namaquensis) 肝臟的MDA 水平顯著升高，而腎臟和腦組織沒(méi)有發(fā)生顯著變化 (Jacobset al., 2021)。紋鼠 (Rhabdomys dilectus) 的腦組織在急性高溫暴露后MDA 和蛋白羰基水平顯著升高，而肝臟和腎臟沒(méi)有發(fā)生顯著變化 (Jacobset al., 2020)。這些研究結(jié)果表明，急性高溫暴露對(duì)氧化應(yīng)激和損傷的影響也具有組織差異。機(jī)體內(nèi)存在對(duì)抗自由基的抗氧化防御系統(tǒng)，包括各種抗氧化酶，例如SOD 和GSH-Px，二者都是機(jī)體抗氧化酶系的重要組成成員 (Kankofer, 2001)。本研究表明，暖溫馴化使黑線倉(cāng)鼠肝臟、肌肉的SOD 活性顯著降低，但對(duì)心臟、肺臟、腎臟和腦影響未達(dá)到顯著水平，暖溫馴化使心臟、肺臟、腎臟GSH-Px 活性顯著降低，使肌肉的GSH-Px 活性顯著升高，而對(duì)肝臟無(wú)顯著影響。對(duì)紋鼠的研究發(fā)現(xiàn)高溫使肝臟的SOD 活性顯著升高，對(duì)腎臟、肌肉和腦等無(wú)顯著影響 (Jacobset al., 2020)。急性高溫暴露下巖鼠腎臟的SOD 活性顯著降低，對(duì)肝臟、腦等其他器官和組織無(wú)顯著影響 (Jacobset al.,2021)。這些研究再次表明，抗氧化能力和自由基水平在不同器官或組織間存在顯著差異，引起差異的原因以及這種差異在主要器官和組織之間是否普遍存在，尚需進(jìn)一步研究 (Davidovi?, 1999;Selmanet al., 2002)。

機(jī)體代謝率、組織線粒體呼吸率與氧化磷酸化偶聯(lián)程度都是影響線粒體氧自由基生成速率的重要因素，與組織自由基水平和氧化損傷的程度密切相關(guān) (Balabanet al., 2005)。本研究利用暖溫長(zhǎng)期馴化或高溫急性暴露的環(huán)境條件處理黑線倉(cāng)鼠，發(fā)現(xiàn)其適應(yīng)性產(chǎn)熱顯著降低，以利于維持穩(wěn)定的體溫調(diào)節(jié)。與動(dòng)物整體水平適應(yīng)性產(chǎn)熱的變化相似，暖溫長(zhǎng)期馴化或高溫急性暴露使呼吸率顯著降低，線粒體氧化和磷酸化偶聯(lián)程度顯著增加。然而在此環(huán)境下，機(jī)體主要組織器官 (肝臟、心臟、肺臟、腎臟、肌肉、腦) 的氧化應(yīng)激與氧化損傷未出現(xiàn)一致的反應(yīng)。對(duì)實(shí)驗(yàn)小鼠的研究發(fā)現(xiàn)，代謝率高的個(gè)體，肌肉組織呼吸率、線粒體氧化磷酸化解偶聯(lián)率較高，自由基水平較低 (Speakmanet al., 2004; Speakman and Selman, 2011)。然而低溫暴露大鼠的代謝率顯著增加，但與此同時(shí)肝臟、心臟和骨骼肌的自由基水平升高，氧化損傷顯著增加 (Vendittiet al., 2004)。不同環(huán)境溫度(高溫或者低溫) 長(zhǎng)期馴化或短期急性暴露對(duì)布氏田鼠、長(zhǎng)爪沙鼠、實(shí)驗(yàn)大鼠和小鼠等的主要組織器官線粒體呼吸率和氧化應(yīng)激與氧化損傷也具有差異，這些研究結(jié)果與本研究結(jié)果相似。本研究結(jié)果不支持自由基假說(shuō)。這些研究結(jié)果暗示，機(jī)體代謝率、主要組織器官線粒體呼吸率、解偶聯(lián)和氧化應(yīng)激與氧化損傷可能具有物種特異性，以及組織器官特異性，這對(duì)深入理解野生小型哺乳動(dòng)物應(yīng)對(duì)高溫環(huán)境的適應(yīng)策略具有生理學(xué)和生態(tài)學(xué)意義。

致謝：溫州大學(xué)動(dòng)物生理生態(tài)學(xué)研究組碩士研究生楊瑞、張開(kāi)元、趙真協(xié)助動(dòng)物代謝率測(cè)定，特此致謝。