楊梅苷對(duì)細(xì)菌性骨髓炎大鼠骨缺損的改善作用

阮峻，李炫瑩，陳國材

骨髓炎（osteomyelitis，OM）是由病原微生物感染引起的骨組織壞死性疾病，金黃色葡萄球菌是其最常見的致病菌［1］。OM 的治療包括長療程的抗生素治療和壞死感染組織的手術(shù)清創(chuàng)。近年來，抗生素的過度使用導(dǎo)致耐藥菌株的出現(xiàn)，逐漸降低了抗生素的療效，且長期全身使用大劑量抗生素會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的不良反應(yīng)［2］。有研究報(bào)道，金黃色葡萄球菌毒力蛋白SpA 可直接與成骨細(xì)胞結(jié)合，抑制成骨細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)其凋亡，進(jìn)而抑制其礦化，并通過促進(jìn)破骨細(xì)胞活化誘導(dǎo)骨吸收，導(dǎo)致病理性骨質(zhì)流失［3］。因此，研究細(xì)菌性O(shè)M 骨質(zhì)流失的分子機(jī)制對(duì)于治療OM 具有重要意義。楊梅苷是一種類黃酮化合物，廣泛存在于多種天然植物中，具有抗炎、抗腫瘤、抗菌、抗病毒等生物活性［4］。楊梅苷還可通過促進(jìn)血管生成來治療骨骼相關(guān)疾?。?］。Xi等［6］發(fā)現(xiàn)楊梅苷可以通過抑制破骨細(xì)胞生成來減少大鼠卵巢切除術(shù)誘導(dǎo)的骨質(zhì)流失。然而，楊梅苷能否改善細(xì)菌性O(shè)M引起的骨質(zhì)流失還鮮見報(bào)道。有研究報(bào)道，促進(jìn)骨形成和血管生成是加速骨修復(fù)的重要方式［7］。血管內(nèi)皮生長因子A（vascular endothelial growth factor A，VEGFA）/基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1（stromal cellderived factor，SDF-1）/C-X-C 型趨化因子受體4（CX-C chemokine receptor 4，CXCR4）通路是重要的血管生成相關(guān)通路。Xiang 等［8］發(fā)現(xiàn)，激活VEGFA/SDF-1/CXCR4 通路可促進(jìn)血管生成。Huang 等［9］發(fā)現(xiàn)，激活VEGFA/SDF-1/CXCR4 信號(hào)通路可促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞血管生成，進(jìn)而加速糖尿病足小鼠傷口愈合。本研究旨在探討楊梅苷可否通過激活VEGFA/SDF-1/CXCR4 信號(hào)通路促進(jìn)血管生成及骨形成，進(jìn)而改善細(xì)菌性O(shè)M大鼠骨缺損。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 90 只SPF 級(jí)雄性SD 大鼠，體質(zhì)量（200±20）g，7周齡，購自貴州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（黔）2018-0001。所有大鼠飼養(yǎng)在廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK（粵）2022-0002；飼養(yǎng)條件為每日光照、黑暗12 h 交替進(jìn)行，溫度23～25 ℃，濕度（50±5）%。本實(shí)驗(yàn)符合動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的3R原則。

1.2 主要試劑與儀器 楊梅苷購自北京凱詩源生物科技有限公司；VEGFA/SDF-1/CXCR4信號(hào)通路抑制劑PX-478購自MedChemExpress LLC；金黃色葡萄球菌ATCC 25923 懸液購自中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心；白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-6、IL-1β、IL-17 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒購自上海酶研生物科技有限公司；骨堿性磷酸酶（bone alkaline phasphatase，BALP）、骨鈣素（osteocalcin，BGP）、Ⅰ型膠原C 端肽（Cterminal telopeptide of typeⅠcollagen，CTX-Ⅰ）ELISA 試劑盒購自上海富雨生物科技有限公司；巧克力培養(yǎng)基購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；蘇木精伊紅（hematoxylin eosin，HE）染色試劑盒購自北京Solarbio 公司；兔抗大鼠CD31 抗體、VEGFA抗體、SDF-1抗體、CXCR4抗體、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG 二抗和山羊抗兔IgG H&L 二抗（Alexa Fluor?647）購自英國Abcam。TG16G臺(tái)式高速離心機(jī)（湖南凱達(dá)科學(xué)儀器有限公司）；BX51 熒光顯微鏡（日本Olympus 公司）；iMark680 多功能酶標(biāo)儀、ChemiDoc?XRS凝膠成像分析儀（美國Bio-Rad公司）。

1.3 方法

1.3.1 分組、造模與干預(yù) 將大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組、OM組、楊梅苷組、PX-478組、楊梅苷+PX-478組，每組18只。除假手術(shù)組外，其余大鼠參照文獻(xiàn)［10］通過雙側(cè)脛骨近端骨缺損來制備細(xì)菌性O(shè)M 大鼠模型（72 只）。將大鼠麻醉，使其仰臥在手術(shù)臺(tái)上，隨后用剪刀在膝關(guān)節(jié)下沿脛骨內(nèi)側(cè)切一小口，剝開骨膜，使脛骨上端暴露，在膝關(guān)節(jié)下方2 mm 處取骨前內(nèi)側(cè)面骨皮質(zhì)形成骨缺損，最后插入含有金黃色葡萄球菌懸液的棉條。假手術(shù)組除不插入含有金黃色葡萄球菌懸液的棉條外，其余操作步驟相同。大鼠均用骨蠟封閉殘腔，縫合創(chuàng)口。

楊梅苷組按照50 mg/（kg·d）［11］的劑量通過腹腔注射楊梅苷；PX-478組腹腔注射25 mg/（kg·d）PX-478［12］；楊梅苷+PX-478組通過腹腔注射50 mg/（kg·d）楊梅苷及25 mg/（kg·d）PX-478；均連續(xù)治療12 周。OM 組、假手術(shù)組通過腹腔注射等體積生理鹽水。

1.3.2 指標(biāo)觀察以及樣本采集 藥物治療結(jié)束24 h后，觀察并計(jì)數(shù)達(dá)到甲級(jí)創(chuàng)口愈合程度的大鼠數(shù)量［10］；麻醉后測量各組大鼠肛溫，用采血針從腹主動(dòng)脈采血3 mL 用于ELISA；采血完成后，處死大鼠，采用隨機(jī)數(shù)字表法每組抽取6只大鼠病灶周圍骨組織用于細(xì)菌負(fù)荷測定，另隨機(jī)每組抽取6只大鼠病灶周圍骨組織用于病理切片觀察和免疫熒光染色，每組剩余6 只大鼠病灶周圍骨組織保存在-80 ℃冰箱中，用于Western blot實(shí)驗(yàn)。

1.3.3 ELISA 法檢測血清炎性因子以及骨代謝指標(biāo) 采用ELISA 試劑盒檢測血清IL-6、IL-1β、IL-17 以及BALP、BGP、CTX-Ⅰ水平。

1.3.4 細(xì)菌負(fù)荷檢測 將病灶周圍組織用研磨儀進(jìn)行勻漿后，用巧克力培養(yǎng)基置于37 ℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，最后計(jì)數(shù)細(xì)菌菌落。

1.3.5 HE染色檢測大鼠病灶周圍骨組織病理變化 取大鼠病灶周圍組織固定于4%多聚甲醛中，用10% EDTA（pH=7.4）脫鈣21 d，經(jīng)脫水、包埋、切成5 μm 橫切面的石蠟切片，HE染色后在光學(xué)顯微鏡下觀察病灶周圍組織病理變化。

1.3.6 免疫熒光染色檢測病灶周圍骨組織CD31 陽性表達(dá)情況 取病灶周圍組織石蠟切片，將石蠟包埋的切片裝在載玻片上經(jīng)脫蠟、脫水、洗滌后，與CD31 一抗在4 ℃下孵育過夜。用PBS 洗滌后，將切片與山羊抗兔IgG H&L 二抗（Alexa Fluor?647）在37 ℃下孵育1 h，用DAPI染核。用含抗熒光淬滅劑的封片液封片，最后隨機(jī)讀取6 個(gè)區(qū)域觀察CD31 陽性表達(dá)，Image J 軟件分析CD31 陽性表達(dá)區(qū)域的面積和區(qū)域總面積，計(jì)算CD31陽性區(qū)域面積百分比。CD31陽性區(qū)域面積百分比（%）=CD31陽性區(qū)域面積/區(qū)域總面積×100%。

1.3.7 Western blot 檢測病灶周圍骨組織VEGFA/SDF-1/CXCR4 信號(hào)通路蛋白表達(dá) 取-80 ℃保存的病灶周圍組織研磨后加入RIPA 裂解液獲取總蛋白，將蛋白質(zhì)定量后進(jìn)行SDS-PAGE 電泳，4 ℃下以100 V 轉(zhuǎn)到PVDF 膜上，然后用5%脫脂奶粉封閉膜1 h，將膜與一抗VEGFA（1∶2 000）、SDF-1（1∶1 000）、CXCR4（1∶1 000）和GAPDH抗體（1∶1 000）在4 ℃下孵育過夜，TBST 洗滌后加入二抗（1∶2 000），加ECL 顯色劑，凝膠成像系統(tǒng)分析目的蛋白，Image J 軟件計(jì)算蛋白灰度值，以目的蛋白與內(nèi)參蛋白灰度值比值作為蛋白相對(duì)表達(dá)水平。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 25.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量數(shù)據(jù)在進(jìn)行正態(tài)性和方差齊性檢驗(yàn)后以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用SNK-q檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。計(jì)數(shù)資料用頻數(shù)表示，各組間比較用χ2檢驗(yàn)，采用Bonferroni方法進(jìn)行多重比較，校正后的檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05/10=0.005。

2 結(jié)果

2.1 楊梅苷對(duì)大鼠創(chuàng)口愈合、細(xì)菌負(fù)荷以及肛溫的影響 OM 組較假手術(shù)組達(dá)到甲級(jí)創(chuàng)口愈合程度的大鼠數(shù)量減少（P＜0.005），肛溫、細(xì)菌負(fù)荷升高（P＜0.05）；楊梅苷組較OM 組達(dá)到甲級(jí)創(chuàng)口愈合程度的大鼠數(shù)量增加，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.005），肛溫、細(xì)菌負(fù)荷下降（P＜0.05），PX-478 組較OM 組達(dá)到甲級(jí)創(chuàng)口愈合程度的大鼠數(shù)量減少，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.005），肛溫、細(xì)菌負(fù)荷升高（P＜0.05）；楊梅苷+PX-478組較楊梅苷組達(dá)到甲級(jí)創(chuàng)口愈合程度的大鼠數(shù)量減少，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.005），細(xì)菌負(fù)荷、肛溫升高（P＜0.05），見表1。

Tab.1 Comparison of wound healing and anal temperature between the five groups of rats表1 各組大鼠創(chuàng)口愈合以及肛溫比較

2.2 各組大鼠血清炎性因子水平比較 與假手術(shù)組比較，OM 組大鼠血清IL-6、IL-1β、IL-17 水平升高（P＜0.05）；與OM 組比較，楊梅苷組大鼠血清IL-6、IL-1β、IL-17水平下降（P＜0.05），PX-478組大鼠血清IL-6、IL-1β、IL-17水平升高（P＜0.05）；與楊梅苷組相比，楊梅苷+PX-478組大鼠血清IL-6、IL-1β、IL-17水平升高（P＜0.05），見表2。

Tab.2 Comparison of serum levels of IL-6,IL-1β and IL-17 between the five groups of rats表2 各組大鼠血清IL-6、IL-1β、IL-17的比較（n=18，ng/L，±s）

Tab.2 Comparison of serum levels of IL-6,IL-1β and IL-17 between the five groups of rats表2 各組大鼠血清IL-6、IL-1β、IL-17的比較（n=18，ng/L，±s）

＊＊P＜0.01；a與假手術(shù)組比較，b與OM組比較，c與梅苷組比較，P＜0.05；表3、4同。

組別假手術(shù)組OM組楊梅苷組PX-478組楊梅苷+PX-478組F IL-6 47.32±6.34 73.84±9.56a 53.43±6.13b 97.87±11.32b 69.65±8.43c 95.779＊＊IL-1β 34.23±8.87 69.43±16.98a 44.97±6.56b 93.86±14.87b 57.56±6.57c 71.118＊＊IL-17 1.89±0.25 4.38±0.52a 2.15±0.36b 5.98±0.65b 3.91±0.45c 235.371＊＊

2.3 各組大鼠血清骨代謝指標(biāo)變化 OM組較假手術(shù)組BALP、BGP 均降低，CTX-Ⅰ水平增高（P＜0.05）；與OM組相比較，楊梅苷組BALP、BGP水平均增高，CTX-Ⅰ水平降低（P＜0.05），而PX-478 組BALP、BGP 水平降低，CTX-Ⅰ水平增高（P＜0.05）；楊梅苷+PX-478組較楊梅苷組BALP、BGP水平均降低，CTX-Ⅰ水平升高（P＜0.05），見表3。

Tab.3 Comparison of serum bone metabolism indexes between the five groups of rats表3 各組大鼠血清骨代謝指標(biāo)的比較（n=18，μg/L，±s）

Tab.3 Comparison of serum bone metabolism indexes between the five groups of rats表3 各組大鼠血清骨代謝指標(biāo)的比較（n=18，μg/L，±s）

組別假手術(shù)組OM組楊梅苷組PX-478組楊梅苷+PX-478組F BALP 8.47±0.94 5.68±0.68a 7.94±0.84b 3.31±0.25b 5.98±0.78c 139.029＊＊BGP 15.86±1.69 9.57±0.94a 14.86±1.57b 6.43±0.72b 10.53±1.76c 138.927＊＊CTX-Ⅰ0.55±0.04 1.39±0.15a 0.65±0.07b 1.97±0.23b 1.22±0.13c 306.237＊＊

2.4 各組大鼠病灶周圍骨組織病理改變以及CD31陽性表達(dá)變化 假手術(shù)組無骨壞死，無急性或慢性骨內(nèi)和骨膜炎癥；OM組存在嚴(yán)重骨壞死以及大量炎性細(xì)胞浸潤；楊梅苷組炎性細(xì)胞浸潤以及骨壞死明顯減輕；PX-478組表現(xiàn)出嚴(yán)重的骨內(nèi)炎癥伴髓內(nèi)膿腫，炎性細(xì)胞浸潤加重；楊梅苷+PX-478組與OM 組結(jié)果相似，見圖1。假手術(shù)組、OM組、楊梅苷組、PX-478 組、楊梅苷+PX-478 組CD31 陽性區(qū)域面積百分比（%）分別為6.54±0.69、4.23±0.47、6.23±0.67、2.35±0.26、4.67±0.48，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（n=6，F(xiàn)=59.302，P＜0.05），OM 組較假手術(shù)組下降（P＜0.05）；與OM組相比較，楊梅苷組升高，而PX-478 組降低（P＜0.05）；楊梅苷+PX-478 組較楊梅苷組CD31 陽性區(qū)域面積降低（P＜0.05），見圖2。

Fig.1 Pathological changes of bone tissue around lesion in rats of each group(HE staining,×100)圖1 各組大鼠病灶周圍骨組織病理變化（HE染色，×100）

Fig.2 Positive expression of CD31 in bone tissue around lesion of rats in each group(immunofluorescence staining,×200)圖2 各組大鼠病灶周圍骨組織CD31陽性表達(dá)（免疫熒光染色，×200）

2.5 各組大鼠VEGFA/SDF-1/CXCR4信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)變化 OM 組較假手術(shù)組VEGFA、SDF-1、CXCR4 蛋白水平均下調(diào)（P＜0.05）；與OM 組比較，楊梅苷組VEGFA、SDF-1、CXCR4 蛋白水平均上調(diào)（P＜0.05），而PX-478 組VEGFA、SDF-1、CXCR 蛋白水平下調(diào)（P＜0.05）；楊梅苷+PX-478組較楊梅苷組VEGFA、SDF-1、HEY蛋白水平均降低（P＜0.05），見圖3、表4。

Fig.3 Expressions of VEGFA,SDF-1 and CXCR4 proteins in bone tissue around lesion of rats in each group圖3 各組大鼠病灶周圍骨組織中VEGFA、SDF-1、CXCR4蛋白表達(dá)

Tab.4 Comparison of VEGFA,SDF-1 and CXCR4 protein expression in bone tissue around lesion of rats between the five groups表4 各組大鼠病灶周圍骨組織中VEGFA、SDF-1、CXCR4蛋白表達(dá)的比較（n=6，±s）

Tab.4 Comparison of VEGFA,SDF-1 and CXCR4 protein expression in bone tissue around lesion of rats between the five groups表4 各組大鼠病灶周圍骨組織中VEGFA、SDF-1、CXCR4蛋白表達(dá)的比較（n=6，±s）

組別假手術(shù)組OM組楊梅苷組PX-478組楊梅苷+PX-478組F VEGFA 1.69±0.19 0.91±0.10a 1.52±0.13b 0.60±0.06b 0.97±0.09c 82.357＊＊SDF-1 1.22±0.14 0.68±0.07a 1.13±0.11b 0.33±0.03b 0.75±0.07c 92.101＊＊CXCR4 1.47±0.15 0.86±0.09a 1.37±0.13b 0.39±0.04b 0.90±0.09c 135.945＊＊

3 討論

金黃色葡萄球菌是引起人類慢性感染的常見病原體，OM是該病原體引起的原發(fā)性慢性感染疾病之一［13］。OM 可發(fā)展為骨壞死和骨破壞［14］，改善骨缺損可以緩解金黃色葡萄球菌誘發(fā)的OM，而促進(jìn)血管生成和骨形成是修復(fù)骨缺損的重要途徑［3，7］。楊梅苷是一種黃酮類化合物。Ying等［11］發(fā)現(xiàn)楊梅苷對(duì)糖尿病骨質(zhì)疏松癥大鼠具有骨保護(hù)作用。Xi 等［6］發(fā)現(xiàn)，楊梅苷可通過抑制破骨細(xì)胞形成，減少骨質(zhì)流失，緩解大鼠骨質(zhì)疏松癥。在本研究中，OM 大鼠病灶周圍骨組織存在嚴(yán)重的骨壞死和大量炎性細(xì)胞浸潤現(xiàn)象，且OM 大鼠較假手術(shù)組達(dá)到甲級(jí)創(chuàng)口愈合程度的大鼠數(shù)量減少，細(xì)菌負(fù)荷、肛溫升高，表明OM模型構(gòu)建成功；楊梅苷治療后，OM 大鼠病灶周圍骨組織炎性細(xì)胞浸潤以及骨壞死現(xiàn)象改善，達(dá)到甲級(jí)創(chuàng)口愈合程度的大鼠數(shù)量呈增加趨勢，細(xì)菌負(fù)荷、肛溫下降，提示楊梅苷對(duì)OM大鼠起到積極影響。

既往研究表明，促炎細(xì)胞因子和趨化因子在細(xì)菌感染期間通過募集和激活浸潤的免疫細(xì)胞來維持骨吸收和骨形成之間的平衡［15］。IL-1β、IL-6和IL-17是病理?xiàng)l件下骨代謝的重要標(biāo)志物［16］。IL-1β是一種有效的促炎細(xì)胞因子，通過在骨感染期間誘導(dǎo)炎癥部位的破骨細(xì)胞分化來參與骨吸收［17］。IL-6和IL-17已被證明在慢性脛骨骨髓炎患者血清中呈高表達(dá)，下調(diào)IL-6、IL-17 水平可降低機(jī)體炎癥反應(yīng)，恢復(fù)關(guān)節(jié)功能，提高機(jī)體免疫力［13］。BALP、BGP是骨形成常見指標(biāo)，在促進(jìn)骨形成方面起關(guān)鍵作用；CTX-Ⅰ是常見的骨吸收指標(biāo)，升高BALP、BGP水平以及降低CTX-Ⅰ水平可修復(fù)骨損傷［18］。CD31是內(nèi)皮細(xì)胞的特異性標(biāo)志物，可用于評(píng)估血管生成［19］。有研究報(bào)道，升高CD31 水平可促進(jìn)血管生成，進(jìn)而促進(jìn)成骨，修復(fù)骨缺損［7］。本研究結(jié)果與上述研究結(jié)果一致。在本研究中，OM大鼠血清中BALP、BGP水平降低，病灶周圍骨組織CD31 陽性表達(dá)下降，且IL-6、IL-1β、IL-17 水平和CTX-Ⅰ水平升高，表明OM 大鼠病灶周圍骨形成受損；而楊梅苷處理后，血清炎性因子水平和CTX-Ⅰ水平降低，BALP、BGP水平升高，CD31 陽性表達(dá)增加，提示楊梅苷可促進(jìn)骨形成以及血管生成，改善細(xì)菌性O(shè)M大鼠骨缺損。

VEGFA、SDF-1、CXCR4 是血管生成的關(guān)鍵基因。Shen等［20］發(fā)現(xiàn)抑制VEGFA/SDF-1/CXCR4信號(hào)通路的活化可以抑制血管生成。Huang 等［9］發(fā)現(xiàn)激活VEGFA/SDF-1/CXCR4信號(hào)通路可以促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞血管生成，進(jìn)而加速傷口愈合。Ding 等［21］也發(fā)現(xiàn)激活VEGFA/SDF-1/CXCR4信號(hào)軸可以促進(jìn)血管生成，加速老年小鼠骨折愈合。在本研究中，OM 大鼠病灶周圍骨組織中VEGFA、SDF-1、CXCR4 蛋白水平下降，表明VEGFA/SDF-1/CXCR4 信號(hào)通路被抑制；而楊梅苷可上調(diào)VEGFA、SDF-1、CXCR4蛋白水平，提示楊梅苷可能通過激活VEGFA/SDF-1/CXCR4信號(hào)軸來改善細(xì)菌性O(shè)M大鼠骨缺損。為了進(jìn)一步證明以上推測，本研究用VEGFA/SDF-1/CXCR4信號(hào)通路抑制劑PX-478處理OM大鼠，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PX-478 逆轉(zhuǎn)了楊梅苷對(duì)細(xì)菌性O(shè)M 大鼠骨缺損的改善作用。

綜上所述，楊梅苷可能通過激活VEGFA/SDF-1/CXCR4信號(hào)通路，促進(jìn)骨形成以及血管生成，進(jìn)而改善細(xì)菌性O(shè)M 大鼠骨缺損。然而，楊梅苷治療是否呈現(xiàn)劑量相關(guān)性，是否可以通過調(diào)節(jié)其他血管生成通路產(chǎn)生同等積極作用，需要進(jìn)一步探索。