補(bǔ)脾益腸丸重塑CD4+T細(xì)胞亞群穩(wěn)態(tài)緩解潰瘍性結(jié)腸炎的機(jī)制研究

肖秋萍，趙暢，劉端勇，李?yuàn)檴?，施旻，陳麗玲，鐘友寶，△

潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis，UC）是一種由多種病因引起、異常免疫介導(dǎo)的慢性非特異性腸道炎癥，其發(fā)病機(jī)制不明，多反復(fù)發(fā)作，甚至癌變［1］。近20年全球UC發(fā)病率和患病率呈明顯增長(zhǎng)趨勢(shì)［2］；其治療藥物能迅速緩解UC 癥狀，但仍難以徹底治愈，同時(shí)伴有一些不良反應(yīng)，因此亟需尋找更加有效的策略來(lái)控制UC 的發(fā)生與發(fā)展。補(bǔ)脾益腸丸（Bupi Yichang pill，BPYCP）具有益氣養(yǎng)血、溫陽(yáng)行氣、澀腸止瀉之功，治療結(jié)腸炎的有效率超過(guò)90%，且復(fù)發(fā)率低、不良反應(yīng)少［3］；然而B(niǎo)PYCP的作用機(jī)制鮮有報(bào)道。近期研究發(fā)現(xiàn)，CD4+T 細(xì)胞分化失衡是UC的重要發(fā)病機(jī)制，腸道組織炎性CD4+T細(xì)胞大量浸潤(rùn)是UC患者常見(jiàn)的病理特征，嚴(yán)格控制調(diào)節(jié)性和炎性CD4+T細(xì)胞數(shù)量之間的平衡有助于防止失控的CD4+T細(xì)胞反應(yīng)和隨后的腸道組織損傷［4］。基于此，本研究旨在探討B(tài)PYCP 對(duì)UC 小鼠CD4+T 細(xì)胞亞群分化的影響，為明確BPYCP 臨床治療UC 的作用機(jī)制和靶點(diǎn)提供實(shí)驗(yàn)證據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 7～8周齡雄性SPF 級(jí)C57BL/6小鼠48只，體質(zhì)量19～22 g，購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（湘）2019-0004。所有小鼠飼養(yǎng)于SPF屏障環(huán)境內(nèi)，自由飲水和進(jìn)食，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK（贛）2022-0002；本研究方案得到江西中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)（許可號(hào)：JZLLSC2020-334）。

1.2 試劑及儀器 BPYCP購(gòu)自白云山陳李濟(jì)藥廠有限公司（批號(hào)：K05190）；葡聚糖硫酸鈉（DSS，分子質(zhì)量：36～50 ku；批號(hào)：160110）購(gòu)自美國(guó)MP Biomedicals 公司；美沙拉嗪（5-ASA）購(gòu)自Sigma-Aldrich 公司。4%多聚甲醛、切片石蠟、蘇木素伊紅染色液、BCA 檢測(cè)試劑盒（北京索萊寶）；實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）試劑盒（北京聚合美）；流式細(xì)胞CD4、趨化因子受體3（CXC chemokine receptor 3，CXCR3）、白細(xì)胞介素（IL）-33 受體（IL-33R）、趨化因子受體6（CC chemokine receptor 6，CCR6）、CD25、叉頭狀轉(zhuǎn)錄因子P3（transcription factor forkhead box protein P3, Foxp3）、趨化因子受體5（CXCR5）抗體（美國(guó)BD Biosciences）；小鼠干擾素-γ（INFγ）、IL-4、IL-17A、IL-21、IL-10酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）試劑盒（美國(guó)Thermo）。EG1150H 型石蠟包埋機(jī)、RM2255 型石蠟切片機(jī)（德國(guó)Leica 公司），BX43 型光學(xué)顯微鏡（日本Olympus 公司），F(xiàn)ACSCanto Ⅱ流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD 公司），VCX150 型組織超聲勻漿機(jī)（美國(guó)Sonics 公司），Varios-kan Flash型多功能酶標(biāo)儀（美國(guó)Thermo Fisher公司）。

1.3 動(dòng)物分組及UC 模型建立 小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d 后，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為對(duì)照組（Control 組，n=10）、模型組（DSS組，n=13）、模型+補(bǔ)脾益腸丸組（DSS+BPYCP 組，n=13）、模型+5-ASA組（DSS+5-ASA組，n=12），實(shí)驗(yàn)為期3周。復(fù)發(fā)性UC 模型建立方法：Control 組連續(xù)3 周自由飲水；其他3 組于第1 周和第3 周自由飲用2.5%（w/v）DSS 溶液，第2 周自由飲水。藥物干預(yù)方法：從第2 周開(kāi)始至實(shí)驗(yàn)結(jié)束，DSS+BPYCP組、DSS+5-ASA 組小鼠分別灌胃3.0 g/kg BPYCP 和0.3 g/kg 5-ASA，每日1次，1 mL/次，Control 組和DSS組以相同體積生理鹽水灌胃。

1.4 結(jié)腸長(zhǎng)度、質(zhì)量及指數(shù)測(cè)定 每天同一時(shí)間對(duì)小鼠稱質(zhì)量，觀察小鼠精神及進(jìn)食狀態(tài)，并統(tǒng)計(jì)糞便黏稠度及便血情況。于實(shí)驗(yàn)第21天2%戊巴比妥鈉深度麻醉安樂(lè)死小鼠，迅速分離結(jié)腸并測(cè)量結(jié)腸長(zhǎng)度；清洗腸腔，濾紙吸干，結(jié)腸稱質(zhì)量并計(jì)算相應(yīng)指數(shù)。每組小鼠檢測(cè)10只，結(jié)腸質(zhì)量指數(shù)=結(jié)腸質(zhì)量（g）/體質(zhì)量（g）×100%，單位結(jié)腸質(zhì)量指數(shù)=結(jié)腸質(zhì)量（g）/結(jié)腸長(zhǎng)度（cm）×100%。

1.5 結(jié)腸組織病理變化觀察 近端結(jié)腸組織經(jīng)固定、脫水、透明、包埋、切片，蘇木素-伊紅（HE）染色，光學(xué)顯微鏡采集圖片，由2位病理學(xué)老師隨機(jī)、盲法對(duì)各組結(jié)腸病理圖片進(jìn)行病理?yè)p傷評(píng)分（n=6）。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)分為炎細(xì)胞浸潤(rùn)程度、組織損傷程度兩個(gè)維度，分別為0～3分［5］。

1.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD4+T 細(xì)胞亞群水平 小鼠腸系膜淋巴結(jié)經(jīng)碾磨、過(guò)濾、洗滌，制備單細(xì)胞懸液；CD16/CD32 抗體封閉15 min；流式抗體（CD4、CXCR3、IL-33R、CCR6、CD25、CXCR5）室溫避光孵育30 min；Stain buffer洗滌2次，F(xiàn)ix/Perm溶液孵育30 min；Stain buffer 重懸，Perm/Wash 溶液孵育15 min 破核；流式抗體Foxp3 室溫孵育30 min 胞內(nèi)染色；Perm/Wash 溶液重懸，Stain buffer 洗滌2 次；Stain buffer 定容500 μL，經(jīng)流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測(cè)；采用Flowjo 7.6.1 軟件分析流式結(jié)果（n=6）。 采用CD4+CXCR3+標(biāo)記Th1 細(xì)胞，CD4+IL-33R+標(biāo)記Th2 細(xì)胞，CD4+CCR6+標(biāo)記Th17 細(xì)胞，CD4+CD25+、CD4+CD25+Foxp3+標(biāo)記Treg 細(xì)胞，CD4+CXCR5+標(biāo)記Tfh細(xì)胞。

1.7 ELISA 檢測(cè)細(xì)胞因子表達(dá)水平 結(jié)腸組織經(jīng)裂解、勻漿、離心，BCA法檢測(cè)總蛋白水平，PBS標(biāo)準(zhǔn)化至2 000 μg/L。根據(jù)ELISA 檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)，檢測(cè)結(jié)腸組織中CD4+T細(xì)胞亞群分泌的炎性細(xì)胞因子INF-γ、IL-4、IL-17A、IL-10及IL-21水平（n=6）。

1.8 qPCR檢測(cè)CD4+T細(xì)胞亞群核轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)水平 結(jié)腸組織經(jīng)裂解、勻漿、離心、提取，檢測(cè)總RNA濃度及RNA完整性。將RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)，反應(yīng)體系共20 μL：cDNA 模板2 μL，上、下游引物各0.5 μL，ddH2O 7 μL，SYBRgreen qPCR mix 10 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性60 s；95 ℃變性15 s，55～65 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，共計(jì)40個(gè)循環(huán)。引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，見(jiàn)表1。以β-actin為內(nèi)參，根據(jù)2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因表達(dá)水平（n=6）。目的基因包括：Th1 細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄因子T-框蛋白21（T-box 21，T-bet）、Th2 細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄因子GATA 結(jié)合蛋白3（GATA binding protein 3，GATA-3）、Th17 核轉(zhuǎn)錄因子維甲酸相關(guān)核孤兒受體γt（retinoicr acid-related orphanreceptor γt，RORγt）、Tfh 細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄因子B 細(xì)胞淋巴瘤-6（B cell lymphoma 6，Bcl-6）及Treg細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄因子大鼠叉頭蛋白P3（rat forkhead protein P3，F(xiàn)oxp3）的mRNA。

Tab.1 Primer sequence for qPCR表1 qPCR引物序列

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以±s表示，組間比較采用單因素方差分析，多重比較采用Tukey法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 BPYCP 對(duì)UC 小鼠的體質(zhì)量及結(jié)腸質(zhì)量的影響 實(shí)驗(yàn)期間Control 組小鼠采食、活動(dòng)狀態(tài)正常。第3 天，DSS 組、DSS+BPYCP 組及DSS+5-ASA 組多數(shù)小鼠糞便隱血檢測(cè)呈陽(yáng)性，隨著造模時(shí)間推移，其陽(yáng)性增強(qiáng)；第6 天，除Control 組外，其他組小鼠均表現(xiàn)出蜷縮、少進(jìn)食、精神倦怠、體質(zhì)量下降，并伴隨不同程度腹瀉、便血。第16天，DSS+BPYCP及DSS+5-ASA組的小鼠活動(dòng)及體質(zhì)量逐漸恢復(fù)，腹瀉、便血癥狀逐漸好轉(zhuǎn)，但DSS組小鼠的癥狀未見(jiàn)改善。

與Control 組比較，DSS 組小鼠的體質(zhì)量及結(jié)腸長(zhǎng)度減小，而結(jié)腸質(zhì)量、結(jié)腸質(zhì)量指數(shù)及單位結(jié)腸質(zhì)量指數(shù)均增加（P＜0.05）；與DSS 組比較，DSS+BPYCP 組和DSS+5-ASA 組小鼠體質(zhì)量及結(jié)腸長(zhǎng)度均增加，且結(jié)腸質(zhì)量、結(jié)腸質(zhì)量指數(shù)及單位結(jié)腸質(zhì)量指數(shù)均減?。≒＜0.05），見(jiàn)表2。

Tab.2 Changes of body weight and colon weight in mice of each group表2 各組小鼠的體質(zhì)量及結(jié)腸質(zhì)量的變化（n=10，±s）

Tab.2 Changes of body weight and colon weight in mice of each group表2 各組小鼠的體質(zhì)量及結(jié)腸質(zhì)量的變化（n=10，±s）

＊＊P＜0.01；a與Control組比較，b與DSS組比較，P＜0.05。

組別Control組DSS組DSS+BPYCP組DSS+5-ASA組F體質(zhì)量/g 25.00±1.10 20.90±1.14a 24.00±1.34b 23.19±1.35ab 19.893＊＊結(jié)腸質(zhì)量/g 0.22±0.02 0.34±0.05a 0.24±0.03b 0.28±0.05ab 20.206＊＊結(jié)腸質(zhì)量指數(shù)/%0.90±0.09 1.64±0.20a 0.98±0.13b 1.19±0.23ab 36.325＊＊結(jié)腸長(zhǎng)度/cm 8.70±0.70 7.16±0.65a 8.33±0.66b 8.01±0.70ab 9.216＊＊單位結(jié)腸質(zhì)量指數(shù)/%2.58±0.18 4.82±0.70a 2.85±0.49b 3.45±0.60ab 34.355＊＊

2.2 BPYCP 對(duì)UC 小鼠結(jié)腸黏膜組織損傷的影響 HE染色顯示，Control組結(jié)腸的上皮及腺體結(jié)構(gòu)完整，黏膜下無(wú)潰瘍，亦無(wú)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；DSS 組腸壁增厚、固有層腺體排列紊亂，黏膜下存在明顯的潰瘍，黏膜層和黏膜下層有大量的淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞等炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；DSS+BPYCP 組和DSS+5-ASA 組的黏膜上皮較DSS組更為完整，腺體排列更規(guī)整，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)更少，見(jiàn)圖1。Control 組、DSS 組、DSS+BPYCP 組和DSS+5-ASA 組的結(jié)腸病理?yè)p傷評(píng)分依次為（0.17±0.41）、（4.67±1.03）、（2.33±1.03）、（2.50±1.05）分（n=6，F(xiàn)=23.856，P＜0.01）。DSS組評(píng)分高于Control 組；而與DSS 組比較，DSS+BPYCP 組和DSS+5-ASA組的結(jié)腸病理?yè)p傷評(píng)分降低（P＜0.05）。

Fig.1 Changes of colonic mucosal injury in mice of each group(HE stanining)圖1 各組小鼠結(jié)腸黏膜損傷的變化（HE染色）

2.3 BPYCP對(duì)UC小鼠CD4+T細(xì)胞亞群的影響

2.3.1 Th1細(xì)胞 與Control組比較，DSS組Th1細(xì)胞比例升高，且結(jié)腸組織中IFN-γ 水平增加（P＜0.05）；與DSS 組比較，DSS+BPYCP 組的Th1 細(xì)胞比例降低（P＜0.05），但I(xiàn)FN-γ 水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；DSS+5-ASA 組的Th1 細(xì)胞比例及IFN-γ 水平較DSS組降低（P＜0.05），見(jiàn)圖2、表3。

Fig.2 Changes of Th1 cell ratio in mice of each group圖2 各組小鼠Th1細(xì)胞比例的變化

Tab.3 Changes of Th1 cell proportion and IFN-γ inmice of each group表3 各組小鼠Th1細(xì)胞比例及IFN-γ的變化（n=6，±s）

Tab.3 Changes of Th1 cell proportion and IFN-γ inmice of each group表3 各組小鼠Th1細(xì)胞比例及IFN-γ的變化（n=6，±s）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；a 與Control 組比較，b 與DSS 組比較，P＜0.05，表4—8同。

IFN-γ/（ng/L）472.00±81.82 714.67±181.52a 517.83±107.22 467.33±103.84b 5.280＊組別Control組DSS組DSS+BPYCP組DSS+5-ASA組F CD4+CXCR3+Th1/%1.08±0.55 2.37±0.62a 1.22±0.42b 1.12±0.37b 9.056＊＊

2.3.2 Th2細(xì)胞 與Control組比較，DSS組Th2細(xì)胞比例升高，IL-4水平增加（P＜0.05）；與DSS組比較，DSS+BPYCP 組及DSS+5-ASA 組Th2 細(xì)胞比例降低（P＜0.05），但I(xiàn)L-4 水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)圖3、表4。

Fig.3 Changes of Th2 cell ratio in mice of each group圖3 各組小鼠Th2細(xì)胞比例的變化

Tab.4 Changes of Th2 cell proportion and IL-4 level in mice of each group表4 各組小鼠Th2細(xì)胞比例及IL-4的變化（n=6，±s）

組別Control組DSS組DSS+BPYCP組DSS+5-ASA組F CD4+IL-33R+Th2/%0.44±0.17 2.02±0.52a 0.52±0.13b 1.14±0.54ab 21.051＊＊IL-4/（ng/L）360.17±97.07 530.00±110.16a 394.83±88.43 463.83±84.08 3.742＊

2.3.3 Th17 與Control 組相比，DSS組Th17細(xì)胞比例及IL-17A 水平均升高（P＜0.01）；與DSS 組比較，DSS+BPYCP組和DSS+5-ASA組的Th17細(xì)胞比例及IL-17A水平降低（P＜0.01），見(jiàn)圖4、表5。

Fig.4 Changes of Th17 cell ratio in mice of each group圖4 各組小鼠Th17細(xì)胞比例的變化

Tab.5 Changes of Th17 cell proportion and IL-17A level in mice of each group表5 各組小鼠Th17細(xì)胞比例及IL-17A的變化（n=6，±s）

Tab.5 Changes of Th17 cell proportion and IL-17A level in mice of each group表5 各組小鼠Th17細(xì)胞比例及IL-17A的變化（n=6，±s）

組別Control組DSS組DSS+BPYCP組DSS+5-ASA組F CD4+CCR6+Th17/%0.99±0.26 3.59±0.91a 1.15±0.27b 1.42±0.33b 33.020＊＊IL-17A/（ng/L）50.55±16.53 161.50±44.18a 65.75±21.19b 80.23±19.13b 19.347＊＊

2.3.4 Treg 與Control組比較，DSS組CD4+CD25+Treg、CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞比例及IL-10水平均降低（P＜0.01）；與DSS 組比較，DSS+BPYCP 組的CD4+CD25+Treg、CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞比例及IL-10 水平均升高（P＜0.05），DSS+5-ASA 組的CD4+CD25+Treg、CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞比例及IL-10水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)圖5、表6。

Fig.5 Changes of Treg cell ratio in mice of each group圖5 各組小鼠Treg細(xì)胞比例的變化

Tab.6 Changes of Treg cell proportion and IL-10 level in mice of each group表6 各組小鼠Treg細(xì)胞比例及IL-10的變化（n=6，±s）

Tab.6 Changes of Treg cell proportion and IL-10 level in mice of each group表6 各組小鼠Treg細(xì)胞比例及IL-10的變化（n=6，±s）

組別Control組DSS組DSS+BPYCP組DSS+5-ASA組F CD4+CD25+Treg/%13.19±3.52 4.16±1.88a 15.37±3.76b 7.94±2.89a 16.072＊＊CD4+CD25+Foxp3+Treg/%18.73±4.58 8.60±2.87a 19.10±5.16b 12.42±2.90 9.715＊＊IL-10/（ng/L）1 138.50±230.64 651.33±139.71a 1 455.67±288.92b 828.33±137.10 17.212＊＊

2.3.5 Tfh 與Control 組比較，DSS 組Tfh 細(xì)胞比例及IL-21 水平均升高（P＜0.05）；與DSS 組比較，DSS+BPYCP 組Tfh 細(xì)胞比例和IL-21 水平降低（P＜0.05），而DSS+5-ASA 組的Tfh 細(xì)胞比例降低，IL-21水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)圖6、表7。

Fig.6 Changes of Tfh cell ratio in mice of each group圖6 各組小鼠Tfh細(xì)胞比例的變化

Tab.7 Changes of Tfh cell proportion and IL-21 level in mice of each group表7 各組小鼠Tfh細(xì)胞比例及IL-21的變化（n=6，±s）

Tab.7 Changes of Tfh cell proportion and IL-21 level in mice of each group表7 各組小鼠Tfh細(xì)胞比例及IL-21的變化（n=6，±s）

組別Control組DSS組DSS+BPYCP組DSS+5-ASA組F CD4+CXCR5+Tfh/%4.81±1.46 21.65±6.22a 6.19±2.08b 5.95±2.45b 30.210＊＊IL-21/（ng/L）294.67±98.06 602.67±122.60a 391.83±92.46b 448.83±86.15 9.820＊＊

2.4 BPYCP調(diào)節(jié)UC小鼠CD4+T細(xì)胞亞群核轉(zhuǎn)錄因子表達(dá) 與Control 組比較，DSS 組T-bet、GATA-3、RORγt 及Bcl-6 mRNA 表達(dá)水平均升高，而Foxp3 mRNA 表達(dá)水平下降（P＜0.01）。與DSS 組比較，DSS+BPYCP 組和DSS+5-ASA 組的T-bet、GATA-3、RORγt、Bcl-6 mRNA 水平降低，DSS+BPYCP 組的Foxp3 mRNA 水平升高（P＜0.05），而DSS+5-ASA 組的Foxp3 mRNA水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)表8。

Tab.8 Changes of the expression of nuclear transcription factors in CD4+T cell subsets in mice of each group表8 各組小鼠CD4+T細(xì)胞亞群核轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)的變化（n=6，±s）

Tab.8 Changes of the expression of nuclear transcription factors in CD4+T cell subsets in mice of each group表8 各組小鼠CD4+T細(xì)胞亞群核轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)的變化（n=6，±s）

組別Control組DSS組DSS+BPYCP組DSS+5-ASA組F T-bet 0.91±0.44 3.15±1.05a 1.80±0.57b 1.59±0.54b 11.174＊＊GATA-3 1.09±0.42 5.10±1.67a 2.30±0.69b 3.19±0.62ab 17.970＊＊RORγt 1.22±0.53 12.16±3.61a 5.38±1.92ab 7.71±2.20ab 22.917＊＊Bcl-6 0.83±0.27 20.27±6.30a 8.69±2.80ab 13.49±3.72ab 26.148＊＊Foxp3 1.01±0.34 0.20±0.11a 0.55±0.18ab 0.35±0.15a 16.252＊＊

3 討論

基于補(bǔ)脾、澀腸、止瀉等多種功效，中藥復(fù)方BPYCP 治療UC 具有良好療效［6］。中醫(yī)將UC 歸為“久痢”、“痢疾”范疇，病因?yàn)樾笆⒄摗嬍巢粷?、情志不調(diào)，以致脾腎虧虛；應(yīng)以養(yǎng)血生肌、補(bǔ)脾益腸、涼血止痢為治療原則［7］。BPYCP 具有補(bǔ)中益氣、健脾和胃、托毒排膿和澀腸止瀉等功效，臨床報(bào)道BPYCP 可提高UC 患者的臨床總有效率、改善黏膜癥狀和臨床癥狀積分，且不良反應(yīng)少［3］。目前，BPYCP 臨床常用于慢性結(jié)腸炎、UC 等疾病的治療。本研究結(jié)果亦顯示出了BPYCP緩解小鼠UC癥狀及結(jié)腸組織損傷的良好療效，表現(xiàn)為便血、腹瀉等癥狀的緩解，小鼠體質(zhì)量、結(jié)腸長(zhǎng)度增加，結(jié)腸質(zhì)量、結(jié)腸質(zhì)量指數(shù)減小，結(jié)腸組織黏膜上皮，腺體排列更規(guī)整。5-ASA是臨床治療輕中度UC的首選藥物，對(duì)于實(shí)驗(yàn)性UC 小鼠亦具有良好療效，因此本研究選擇5-ASA 作為陽(yáng)性對(duì)照藥，發(fā)現(xiàn)BPYCP 改善UC 的臨床癥狀及結(jié)腸相關(guān)指數(shù)的療效與5-ASA 相當(dāng)，這進(jìn)一步表明BPYCP有臨床治療UC的潛力。

UC 的發(fā)病涉及遺傳、環(huán)境、免疫失調(diào)等多因素及其相互作用的影響。輔助性CD4+T細(xì)胞在穩(wěn)態(tài)下可調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)，抵御病原體侵襲，失調(diào)時(shí)可導(dǎo)致過(guò)敏和自身免疫疾病（包括UC）［8］。腸道組織炎性CD4+T細(xì)胞大量浸潤(rùn)是UC患者常見(jiàn)的病理特征，表現(xiàn)為腸道組織中記憶表型CD4+T細(xì)胞數(shù)量顯著高于健康人，而Treg 數(shù)量卻顯著減少［9］。在識(shí)別抗原主要組織相容性復(fù)合物分子和適當(dāng)?shù)墓泊碳ず?，靜止?fàn)顟B(tài)的naive CD4+T 細(xì)胞將增殖并分化為多種功能不同的效應(yīng)細(xì)胞，這些效應(yīng)細(xì)胞根據(jù)其功能、轉(zhuǎn)錄因子和標(biāo)志性細(xì)胞因子被分類為不同的亞群，如Th1、Th2、Th9、Th17、Th22、Treg 和Tfh［8］。機(jī)體處于穩(wěn)態(tài)時(shí)，T 細(xì)胞主要表現(xiàn)為調(diào)節(jié)性表型，而在UC 病理生理過(guò)程中Th1、Th2、Th9、Th17反應(yīng)增強(qiáng)，而Treg反應(yīng)降低，表現(xiàn)為T(mén)細(xì)胞失衡狀態(tài)［10-11］。與健康者相比，活動(dòng)期UC患者結(jié)腸內(nèi)存在更高比例的CD4+T細(xì)胞，其亞群分化存在明顯的紊亂［9］，表現(xiàn)為T(mén)h1、Th2、Th17 及Tfh 的細(xì)胞數(shù)量增加［12］，Treg 細(xì)胞數(shù)量下降［13］；且Th1、Th2、Th17 細(xì)胞分泌的INF-γ、IL-4、IL-17A 等炎性因子水平升高，而其核轉(zhuǎn)錄因子Tbet、GATA-3、RORγt 表達(dá)水平亦上升［12，14-15］；Tfh 細(xì)胞高表達(dá)Bcl-6［16］；然而，Treg 分泌的IL-10 抗炎因子水平及其選擇性表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子Foxp3 水平下降［17］。與既往研究相同，本研究中UC小鼠的CD4+T細(xì)胞亞群分化失調(diào)，顯示為T(mén)h1、Th2、Th17、Tfh細(xì)胞數(shù)量明顯增多，并高表達(dá)核轉(zhuǎn)錄因子T-bet、GATA-3、RORγt、Bcl-6以及炎性細(xì)胞因子INF-γ、IL-4、IL-17A、IL-21，而Treg 細(xì)胞數(shù)量減少且Foxp3 和IL-10水平明顯下降。

越來(lái)越多成功的T 細(xì)胞治療方法（如誘導(dǎo)T 細(xì)胞凋亡、干擾Th1/Th17平衡）表明失調(diào)的T淋巴細(xì)胞是慢性炎癥的關(guān)鍵中介因子［9，13，18］。藥物干預(yù)可拮抗CD4+T細(xì)胞亞群異常分化并達(dá)到治療UC的療效，如烏梅湯抑制Th1/Th17 細(xì)胞分化和促炎細(xì)胞因子分泌緩解UC［14］。筆者推測(cè)BPYCP 或可通過(guò)重塑CD4+T 細(xì)胞亞群分化平衡發(fā)揮治療UC 的療效。本研究發(fā)現(xiàn)，BPYCP可拮抗DSS導(dǎo)致的UC小鼠CD4+T細(xì)胞亞群分化失衡現(xiàn)象，如下調(diào)結(jié)腸炎小鼠腸系膜淋巴結(jié)的Th1、Th2、Th17 及Tfh 細(xì)胞比例，降低促炎因子INF-γ、IL-4、IL-17A 及IL-21 的分泌及核轉(zhuǎn)錄因子T-bet、GATA-3、RORγt 及Bcl-6 的mRNA 水平，而上調(diào)Treg細(xì)胞比例、IL-10水平及Foxp3表達(dá)。

綜上所述，本研究表明BPYCP 可有效緩解DSS誘導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)性UC，其潛在作用機(jī)制與調(diào)節(jié)腸道組織CD4+T 細(xì)胞亞群分化失衡相關(guān)，這為后續(xù)BPYCP 抗UC 作用機(jī)制研究奠定了良好基礎(chǔ)。課題組后期將通過(guò)藥代動(dòng)力學(xué)及高效液相色譜技術(shù)解析BPYCP抗UC的關(guān)鍵物質(zhì)基礎(chǔ)；通過(guò)單細(xì)胞測(cè)序、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)進(jìn)一步解析BPYCP 調(diào)控CD4+T 細(xì)胞分化的信號(hào)網(wǎng)絡(luò)，進(jìn)而明確BPYCP 抗UC 的物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機(jī)制，豐富中醫(yī)藥治療疾病的理論內(nèi)涵。