沉默Sp5對mEPMCs中Wnt信號通路相關(guān)因子及增殖能力的影響

柏宇，蘭雪嬌，唐璟，文雨，呂明敏，宋慶高

腭裂是常見的先天性出生缺陷之一，是一種基因與環(huán)境相互作用引起的多基因遺傳?。?-2］。其易感基因包括干擾素調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子6（IRF6）、亞甲基四氫葉酸還原酶（MTHFR）、骨形態(tài)發(fā)生蛋白4（BMP4）等［3-4］。研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)錄因子特異蛋白5（Sp5）與胚胎發(fā)育相關(guān)，Sp5基因敲除會引起非洲爪蟾色素沉著、顱面軟骨、背鰭等嚴(yán)重缺損［5-6］。本課題組前期研究微量元素鋅與C57BL/6J 小鼠腭裂的關(guān)系時，利用基因芯片檢測腭突組織中鋅指蛋白Sp家族成員，發(fā)現(xiàn)在胚胎14.5 d 時缺鋅組腭突組織中Sp5mRNA表達(dá)高于常鋅組和富鋅組，故推測鋅指蛋白Sp5基因可能是腭裂候選基因［7］。進(jìn)一步采用不同濃度鋅飼料喂養(yǎng)孕鼠，發(fā)現(xiàn)在腭突融合期缺鋅導(dǎo)致腭裂的發(fā)生，并使其子代Sp5基因表達(dá)水平升高，推測Sp5 在調(diào)控腭的發(fā)育過程中起到負(fù)性調(diào)節(jié)作用［8］。利用免疫組織化學(xué)染色檢測胎鼠腭胚突中Sp5表達(dá)變化，發(fā)現(xiàn)腭發(fā)育期間Sp5在腭突間充質(zhì)及上皮細(xì)胞中表達(dá)均為陽性［9］。Wnt 信號通路在多項研究中被證明參與調(diào)控腭的發(fā)育［10-11］。然而，目前關(guān)于Sp5、Wnt信號通路是否參與小鼠腭發(fā)育過程的研究尚少見。本研究利用慢病毒載體沉默小鼠胚胎腭突間充質(zhì)細(xì)胞（mouse embryo palatal mesenchymal cells，mEPMCs）中的Sp5基因，探討Sp5 表達(dá)變化對Wnt信號通路及體外mEPMCs增殖的影響。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 DMEM/F12 培養(yǎng)基、胰酶均購自美國Gibco公司；BI胎牛血清購自北京沃卡威生物技術(shù)有限公司；中性蛋白酶粉購自北京索萊寶科技有限公司；Sp5 沉默慢病毒、聚凝胺Polybrene 購自漢恒生物科技（上海）有限公司；高效RIPA 裂解液、BCA 蛋白含量檢測試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；超敏化學(xué)發(fā)光底物（ECL）試劑盒購自美國Millipore 公司；Sp5 兔多克隆抗體購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；廣譜細(xì)胞角蛋白（Pan-Cytokeratin，P-CK）兔單克隆抗體、絲氨酸/蘇氨酸激酶（GSK-3β）兔單克隆抗體、Wnt家族成員3a（Wnt3a）兔單克隆抗體、特異性周期蛋白D1（CyclinD1）兔單克隆抗體購自美國CST 公司；波形蛋白（Vimentin）兔單克隆抗體、β-連環(huán)蛋白（β-catenin）兔單克隆抗體購自英國Abcam公司；微管蛋白（β-tubulin）兔單克隆抗體購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；PCR引物購自上海生工生物工程股份有限公司/擎科生物有限公司；TRIzol購自美國Thermo 公司；SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ購自日本TaKaRa；細(xì)胞計數(shù)（CCK-8）試劑盒購自日本同仁化學(xué)研究所；5-乙炔基-2'脫氧尿嘧啶核苷（EdU）試劑盒購自廣州銳博生物科技有限公司；CO2培養(yǎng)箱購自美國Forma；熒光顯微鏡購自日本Olympus；酶標(biāo)儀購自美國Thermo；凝膠成像分析儀購自美國Bio-Bad；PCR檢測儀器購自美國Bio-Bad。體式顯微鏡購自瑞士Leica；流式細(xì)胞儀購自貝克曼庫爾特商貿(mào)（中國）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗動物 C57BL/6J小鼠60只（其中雌鼠40只，雄鼠20只），8～10周齡，體質(zhì)量20 g及以上，購自貴州省遵義醫(yī)科大學(xué)動物中心［動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（黔）-2021-0002］，飼養(yǎng)于遵義醫(yī)科大學(xué)動物中心無特定病原體級的動物房中。本實(shí)驗所有涉及實(shí)驗動物的操作均由遵義醫(yī)科大學(xué)動物實(shí)驗倫理委員會倫理審查并同意后實(shí)施［批準(zhǔn)號：遵醫(yī)倫審（2021）1-053號］。

1.2.2 原代mEPMCs 的獲取、培養(yǎng) 按照雌雄比例為2∶1 于每晚20：00合籠，次日早晨8:00檢查小鼠陰道栓，有陰道栓的小鼠記為孕期0.5 d（GD0.5），稱體質(zhì)量并記錄。GD10.5 時，雌鼠體質(zhì)量增加超過2 g且腹部隆起判定為妊娠。于GD14.5時，采用脫頸法處死孕鼠，75%乙醇消毒，無菌眼科剪剖開孕鼠腹部，取出腹中胚胎置于無菌培養(yǎng)皿中。剝離羊膜及絨毛膜，體式顯微鏡下用無菌眼科剪及眼科鑷獲取1 塊大小約0.5 cm×0.4 cm 的腭突組織，放入現(xiàn)配的中性蛋白酶液（由0.037 g 中性蛋白酶粉劑和5 mL PBS 液配制而成）中，4 ℃冰箱內(nèi)過夜。次日取出腭突組織，PBS 液清洗3 次，加入1 mL 0.125%胰酶消化腭突組織6～8 min，至無明顯組織塊時即消化完成。消化結(jié)束后加入含10%血清的DMEM/F12 完全培養(yǎng)基2 mL 終止消化，1 000 r/min 離心5 min，棄上清液，加入3 mL 完全培養(yǎng)基，重懸細(xì)胞沉淀制成細(xì)胞懸液，接種于T25培養(yǎng)瓶中，置于5%CO2、37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

1.2.3 原代mEPMCs 的鑒定 0.125%胰酶消化細(xì)胞制成細(xì)胞懸液并計數(shù)，1 000 r/min離心5 min，重懸細(xì)胞，以8 000個/孔細(xì)胞接種于96孔板。待細(xì)胞長至70%～80%時，4%多聚甲醛固定15 min；0.5% Triton X-100 通透室溫孵育30 min；5%山羊血清封閉30 min；吸凈封閉液，將一抗Vimentin（稀釋比例1∶500）及P-CK（稀釋比例1∶250）加入相應(yīng)的孔內(nèi)，4 ℃冰箱內(nèi)過夜；熒光二抗孵育1 h（稀釋比例1∶500，此步開始注意避光操作），DAPI染核，滴加抗熒光衰減劑，熒光顯微鏡下采集圖像。

1.2.4 慢病毒載體轉(zhuǎn)染mEPMCs 慢病毒包裝的Sp5基因沉默載體由漢恒生物科技（上海）有限公司設(shè)計、構(gòu)建、包裝完成。載體為pHBLV-U6-MCS-CMV-ZsGreen-PGK-PURO，抗性標(biāo)簽為嘌呤霉素（Puromycin），熒光標(biāo)簽為綠色熒光蛋白（ZsGreen）。基于Sp5基因的編碼序列CDS 區(qū)，公司設(shè)計了3個shRNA 干擾靶點(diǎn)并將其命名為shRNA4、shRNA5、shRNA6。Sp5基因shRNA干擾靶點(diǎn)序列及病毒滴度見表1。

Tab.1 Sp5 gene shRNA interfered with target sequences and viral titers表1 Sp5基因shRNA干擾靶點(diǎn)序列及病毒滴度

（1）最佳感染復(fù)數(shù)（MOI）篩選及轉(zhuǎn)染效率測定。將實(shí)驗分為5組：空白對照組（在常規(guī)培養(yǎng)基上培養(yǎng)細(xì)胞）、空載病毒組（空載慢病毒載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞）、shRNA4 組（攜帶Sp5-shRNA4 的慢病毒載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞）、shRNA5 組（攜帶Sp5-shRNA5 的慢病毒載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞）、shRNA6 組（攜帶Sp5-shRNA6的慢病毒載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞）。將MOI設(shè)置為10、30、50，Polybrene 為4 mg/L［12］進(jìn)行測定。以8 000 個/孔細(xì)胞接種于96 孔板。培養(yǎng)24 h 后轉(zhuǎn)染，向每孔加入25 μL 病毒混合液（具體配制見表2）和0.05 μL Polybrene；轉(zhuǎn)染4 h后加入25 μL完全培養(yǎng)基，置于5%CO2、37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染72 h后，熒光顯微鏡下觀察各組細(xì)胞ZsGreen的表達(dá)情況，同時采用Western blot 法篩選出干擾效果最好的Sp5-shRNA，生長穩(wěn)定后可繼續(xù)后續(xù)實(shí)驗。（2）實(shí)驗分組及轉(zhuǎn)染。實(shí)驗設(shè)3組：空白對照組（在常規(guī)培養(yǎng)基上培養(yǎng)細(xì)胞）、空載病毒組（空載慢病毒載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞）、Sp5-shRNA組（干擾效果最好的攜帶Sp5-shRNA 慢病毒載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞）。以2×105個/孔細(xì)胞接種于6孔板，置于5%CO2、37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。細(xì)胞培養(yǎng)24 h后轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染操作同上。

Tab.2 Preparation of virus mixture in each group表2 各組病毒混合液配制情況（μL）

1.2.5 Western blot 檢測Sp5、β-catenin、GSK-3β、Wnt3a、CyclinD1蛋白的表達(dá) 轉(zhuǎn)染72 h后收集細(xì)胞樣品，加入蛋白裂解液裂解細(xì)胞30 min，用BCA蛋白定量測定試劑盒檢測總蛋白量。樣品經(jīng)10%SDS-PAGE 凝膠電泳（80 V恒壓）分離，然后通過半干轉(zhuǎn)印法（電壓25 V、電流2.5 A、時間10 min）轉(zhuǎn)印到PVDF膜。將膜放入5%脫脂奶粉中室溫封閉2 h。孵育一抗Sp5（1∶1 000）、β-catenin（1∶7 500）、GSK-3β（1∶1 000）、Wnt3a（1∶1 000）、CyclinD1（1∶30 000）、β-tubulin（1∶4 500）。4 ℃孵育過夜后TBST 清洗3 次，加入HPR 標(biāo)記的山羊抗兔IgG 二抗（1∶6 000）室溫孵育2 h。TBST 清洗3 次，然后加入200 μL 顯色液覆蓋膜的表面，顯影拍照。用Image J 圖像分析軟件各蛋白條帶進(jìn)行灰度值分析，以β-Tubulin為內(nèi)參，計算各蛋白條帶相對表達(dá)量。

1.2.6 RT-qPCR 檢測β-catenin、GSK-3β、Wnt3a、CyclinD1mRNA 表達(dá) 轉(zhuǎn)染72 h 后收集mEPMCs，用TRIzol 提取其總RNA，測定總RNA 濃度。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA。反應(yīng)體系：5×PrimeScript Buffer（4 μL）、PrimeScriptRT Enzyme Mix I（1 μL）、Oligo dT Primer（1 μL）、Random 6 mers（1 μL）、Total RNA（1 000 ng/所測總RNA 濃度），加RNase Free ddH2O 補(bǔ)足至20 μL。按照TaKaRa 公司SYBR Green 染料法進(jìn)行RT-qPCR 擴(kuò)增反應(yīng)實(shí)驗。以GAPDH為內(nèi)參，反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，共40個循環(huán)。引物序列見表3。每個樣本均設(shè)3個復(fù)孔，重復(fù)3次取均值，以2-ΔΔCt法計算mRNA相對表達(dá)量。

Tab.3 PCR primer sequence表3 PCR引物序列

1.2.7 CCK-8實(shí)驗 以8 000個/孔細(xì)胞、100 μL/孔體積接種至96 孔板，每組重復(fù)3 個復(fù)孔。待細(xì)胞長至50%～70%進(jìn)行轉(zhuǎn)染。以換液的形式加入CCK-8 液（完全培養(yǎng)基∶CCK-8液=10∶1，110 μL/孔），孵箱中孵育2 h，培養(yǎng)24、48、72 h時通過酶標(biāo)儀檢測其在450 nm波長處的光密度（OD）值。

1.2.8 EdU 實(shí)驗 細(xì)胞轉(zhuǎn)染72 h，向各組細(xì)胞加入EdU 染料孵育8 h，對各組細(xì)胞進(jìn)行固定、通透、孵育Apollo?染色反應(yīng)液及Hoechst 33342復(fù)染細(xì)胞核，熒光顯微鏡拍照。EdU染色后呈紅色熒光，Hoechst 33342 染色后呈藍(lán)色熒光，將這兩種熒光重疊后得到EdU陽性增殖細(xì)胞，呈粉紫色熒光。用FIJI軟件計數(shù)相同視野下EdU 標(biāo)記細(xì)胞及Hoechst 陽性細(xì)胞數(shù)，細(xì)胞增殖率=（EdU 陽性增殖細(xì)胞數(shù)/Hoechst 陽性細(xì)胞數(shù)）×100%。

1.2.9 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期 細(xì)胞轉(zhuǎn)染72 h后，按組別用PBS液清洗1次，1 mL 0.125%胰酶消化細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，1 500 r/min離心5 min，棄上清液，加入2 mL完全培養(yǎng)基，混勻。1 500 r/min離心5 min，棄上清液，加入500 μL 70%預(yù)冷乙醇，置于4 ℃冰箱固定過夜。次日用PBS 清洗細(xì)胞，1 500 r/min 離心5 min，棄上清液，向細(xì)胞沉淀中加入100 μL RNaseA，吹打重懸細(xì)胞，放入37 ℃水浴鍋，孵育30 min。加入400 μL PI染色液混勻，置于4 ℃冰箱避光孵育30 min。采用流式儀檢測各組細(xì)胞周期的分布情況，用modifit軟件分析不同時相的細(xì)胞百分比。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用Graph Pad Prism 8.0.2軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較行Tukey法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 倒置相差顯微鏡下小鼠原代mEPMCs 形態(tài)變化 小鼠原代mEPMCs接種后6～8 h時，細(xì)胞開始貼壁生長，多為三角形或多邊形，其中可見大量漂浮的死細(xì)胞；接種24 h 時，細(xì)胞數(shù)量增多，細(xì)胞體積開始增大，細(xì)胞相互接觸；接種48 h時，細(xì)胞快速生長，細(xì)胞接觸更加緊密，細(xì)胞逐漸鋪滿培養(yǎng)瓶底，呈長梭形或漩渦狀排列生長；接種48～72 h 時，細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)瓶瓶底。見圖1。

Fig.1 Morphology of primary mouse palatal mesenchymal cells under inverted phase contrast microscope(×40，scale=200 μm)圖1 倒置相差顯微鏡下小鼠原代mEPMCs形態(tài)（×40，標(biāo)尺=200 μm）

2.2 小鼠mEPMCs的免疫熒光鑒定 Vimentin染色見細(xì)胞質(zhì)著色，綠色熒光表達(dá)較強(qiáng)，胞核呈藍(lán)色熒光表達(dá)；P-CK 染色胞質(zhì)未見綠色熒光表達(dá)，胞核呈藍(lán)色熒光表達(dá)，見圖2。

Fig.2 Identification of primary mouse palatal mesenchymal cells Vimentin and P-CK by fluorescence(×200，scale=50 μm)圖2 小鼠mEPMCs Vimentin及P-CK免疫熒光鑒定（×200，標(biāo)尺=50 μm）

2.3 各組細(xì)胞轉(zhuǎn)染后綠色熒光表達(dá)情況 當(dāng)MOI=10 時，ZsGreen 表達(dá)約50%；當(dāng)MOI=30 或50 時，ZsGreen 表達(dá)達(dá)80%以上，見圖3。確定后續(xù)實(shí)驗轉(zhuǎn)染條件為MOI=30，Polybrene=4 mg/L。

Fig.3 The expression of ZsGreen in each group 72 h after transfection(×40，scale=200 μm)圖3 轉(zhuǎn)染72 h后各組細(xì)胞ZsGreen表達(dá)情況（×40，標(biāo)尺=200 μm）

2.4 各組細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率的測定 空白對照組、空載病毒組、shRNA4組、shRNA5組、shRNA6組中Sp5蛋白表達(dá)水平分別為：0.703±0.118、0.742±0.059、0.677±0.050、0.594±0.051、0.406±0.028。shRNA6 組中Sp5蛋白表達(dá)最低（F=11.400，P＜0.05），故后續(xù)實(shí)驗使用shRNA6慢病毒。見圖4。

Fig.4 The influence of Sp5-shRNA on mEPMCs of Sp5 expression圖4 Sp5-shRNA對mEPMCs Sp5表達(dá)的影響

2.5 沉默Sp5基因后對mEPMCs中β-catenin、GSK-3β、Wnt3a、CyclinD1 蛋白表達(dá)的影響 Sp5-shRNA組mEPMCs 中β-catenin、GSK-3β、Wnt3a、CyclinD1蛋白表達(dá)水平高于空白對照組和空載病毒組（P＜0.05），空載病毒組與空白對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見圖5、表4。

Fig.5 Western blot results of mouse palatal mesenchymal cells β-catenin,GSK-3β,Wnt3a and CyclinD1圖5 小鼠mEPMCs中β-catenin、GSK-3β、Wnt3a、CyclinD1蛋白印跡圖

Tab.4 Comparison of β-catenin,GSK-3β,Wnt3a and CyclinD1 protein between three groups of cells表4 各組細(xì)胞中β-catenin、GSK-3β、Wnt3a、CyclinD1蛋白表達(dá)比較（n=3，±s）

Tab.4 Comparison of β-catenin,GSK-3β,Wnt3a and CyclinD1 protein between three groups of cells表4 各組細(xì)胞中β-catenin、GSK-3β、Wnt3a、CyclinD1蛋白表達(dá)比較（n=3，±s）

＊P＜0.05；a與空白對照組比較，b與空載病毒組比較，P＜0.05。

組別空白對照組空載病毒組Sp5-shRNA組F CyclinD1 0.76±0.22 0.81±0.33 1.73±0.04ab 16.760＊β-catenin 0.55±0.06 0.62±0.02 1.12±0.22ab 16.640＊GSK-3β 2.26±0.08 2.67±0.120 4.19±0.74ab 16.180＊Wnt3a 0.24±0.03 0.28±0.04 0.34±0.03ab 14.500＊

2.6 沉默Sp5基因后對mEPMCs中β-catenin、GSK-3β、Wnt3a、CyclinD1 mRNA 表達(dá)的影響 Sp5-shRNNA 組mEPMCs 中β-catenin、GSK-3β、Wnt3a、CyclinD1 mRNA相對表達(dá)量高于空白對照組和空載病毒組（P＜0.05），空載病毒組與空白對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表5。

Tab.5 Expression of β-catenin,GSK-3β,Wnt3a and CyclinD1 mRNA in each group of cells表5 各組細(xì)胞中β-catenin、GSK-3β、Wnt3a、CyclinD1 mRNA表達(dá)比較（n=3，±s）

Tab.5 Expression of β-catenin,GSK-3β,Wnt3a and CyclinD1 mRNA in each group of cells表5 各組細(xì)胞中β-catenin、GSK-3β、Wnt3a、CyclinD1 mRNA表達(dá)比較（n=3，±s）

＊P＜0.05；a與空白對照組比較，b與空載病毒組比較，P＜0.05。

組別空白對照組空載病毒組Sp5-shRNA組F β-catenin 0.83±0.09 1.02±0.02 1.26±0.10ab 24.550＊GSK-3β 0.96±0.22 0.96±0.09 1.96±0.39ab 14.310＊Wnt3a 0.90±0.36 1.03±0.08 1.92±0.30ab 12.370＊CyclinD1 0.70±0.24 1.01±0.01 1.61±0.33ab 11.940＊

2.7 沉默Sp5基因后對mEPMCs增殖的影響 轉(zhuǎn)染mEPMCs 48 h、72 h 后，Sp5-shRNNA 組細(xì)胞增殖能力高于空白對照組和空載病毒組（P＜0.05），空載病毒組與空白對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表6。

Tab.6 Comparison of cell proliferation ability between three groups表6 各組不同時點(diǎn)細(xì)胞增殖能力比較 （n=3，±s）

＊P＜0.05；a與空白對照組比較，b與空載病毒組比較，P＜0.05。

組別空白對照組空載病毒組Sp5-shRNA組F OD450 72 h 1.24±0.19 1.21±0.21 1.81±0.11ab 8.457＊24 h 0.31±0.05 0.33±0.06 0.39±0.03 2.419 48 h 0.64±0.06 0.67±0.05 0.84±0.01ab 16.500＊

2.8 沉默Sp5基因后對EdU 陽性細(xì)胞增殖率的影響 空白對照組、空載病毒組、Sp5-shRNNA 組EdU陽性細(xì)胞增殖率分別為：14.00%±0、14.67%±0.58%、22.67%±4.62%，Sp5-shRNA 組高于空白對照組和空載病毒組（F=9.662，P＜0.05），空載病毒組與空白對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見圖6。

Fig.6 Cell proliferation indexes in each group detected by EdU immunofluorescence(×40，scale=200 μm)圖6 EdU免疫熒光檢測各組細(xì)胞增殖情況（×40，標(biāo)尺=200 μm）

2.9 沉默Sp5基因后對細(xì)胞周期的影響 Sp5-shRNA 組mEPMCs 處于S 期的細(xì)胞比例高于空白對照組和空載病毒組，G0/G1 期細(xì)胞比例低于空白對照組和空載病毒組（P＜0.05），各組G2/M 期細(xì)胞比例差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；空載病毒組各細(xì)胞周期與空白對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表7。

Tab.7 Cell cycle distribution of each group of cells表7 各組細(xì)胞的細(xì)胞周期分布（n=3，%，±s）

Tab.7 Cell cycle distribution of each group of cells表7 各組細(xì)胞的細(xì)胞周期分布（n=3，%，±s）

＊P＜0.05；a與空白對照組比較，b與空載病毒組比較，P＜0.05。

組別空白對照組空載病毒組Sp5-shRNA組F G0/G1期87.15±0.72 87.75±0.33 84.66±0.16ab 37.200＊S期7.65±0.16 7.40±0.07 10.48±0.20ab 371.900＊G2/M期5.20±0.82 4.85±0.26 4.85±0.28 0.430

3 討論

腭裂是常見的先天性出生缺陷，不僅造成患者面部畸形等生理功能及心理障礙，也給患者及其家庭帶來沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)［13-15］。目前臨床上已有成熟的手術(shù)治療方案，但對于其發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，因此積極進(jìn)行病因研究，建立早期干預(yù)措施，對于唇腭裂的發(fā)生、預(yù)防、治療和預(yù)后均至關(guān)重要［16］。

慢病毒載體是一種逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，具有轉(zhuǎn)染到分裂或非分裂細(xì)胞的能力，轉(zhuǎn)染效率高以及擴(kuò)大靶基因片段等優(yōu)勢［17］。本實(shí)驗選用特異性強(qiáng)、攜帶ZsGreen 的慢病毒載體轉(zhuǎn)染mEPMCs。轉(zhuǎn)染72 h后，熒光顯微鏡下觀察空載病毒組、Sp5-shRNA 組中均可見ZsGreen表達(dá)，初步提示細(xì)胞轉(zhuǎn)染成功。隨后經(jīng)Western blot驗證轉(zhuǎn)染效率，shRNA6組Sp5蛋白表達(dá)水平最低，提示成功轉(zhuǎn)染mEPMCs，達(dá)到實(shí)驗要求，選擇shRNA6慢病毒進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗。

鋅指蛋白是真核細(xì)胞中表達(dá)較為廣泛的轉(zhuǎn)錄蛋白之一，其通過鋅離子與特殊的氨基酸殘基結(jié)合折疊后形成鋅指結(jié)構(gòu)，具有發(fā)育和分化過程、轉(zhuǎn)錄以及轉(zhuǎn)錄后的調(diào)節(jié)和激活、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等多種生物學(xué)功能［18］。轉(zhuǎn)錄因子特異蛋白Sp5是鋅指蛋白超家族中的一族成員，其在肝細(xì)胞癌、胃癌和結(jié)腸癌中表達(dá)上調(diào)，將Sp5 轉(zhuǎn)入不表達(dá)內(nèi)源性Sp5 蛋白的MCF-7 細(xì)胞，可誘導(dǎo)出顯著的促生長活性，并與Wnt/βcatenin 信號通路有關(guān)［19］。另有研究發(fā)現(xiàn)，Sp5基因可作為特異性轉(zhuǎn)錄共激活因子，在小鼠胚胎和胚胎干細(xì)胞分化Wnt/β-catenin 通路信號傳遞中起重要作用［20］。本課題組前期通過GO 富集數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，Sp5在調(diào)控器官形成和發(fā)育、骨骼系統(tǒng)形成和發(fā)育等生物功能存在明顯差異，故推測Sp5基因?qū)﹄窆悄酥溜B頜面骨骼的生物學(xué)發(fā)育可能起到關(guān)鍵作用［7］。有研究發(fā)現(xiàn)，在mEPMCs 中過表達(dá)Sp5，Wnt信號通路中β-catenin、GSK-3β、Wnt3a 表達(dá)均下調(diào)［12］。本研究結(jié)果顯示，在mEPMCs 中沉默Sp5后，Wnt 信號通路相關(guān)因子β-catenin、GSK-3β、Wnt3a表達(dá)均上調(diào)，提示Sp5 可能通過Wnt 信號通路參與調(diào)控腭的發(fā)育。

腭部的發(fā)育涉及增殖、遷移和凋亡等細(xì)胞過程之間的緊密協(xié)調(diào)［21］。本研究CCK-8實(shí)驗結(jié)果顯示，Sp5-shRNA組細(xì)胞增殖能力較空白對照組和空載病毒組升高；EdU熒光染色實(shí)驗結(jié)果顯示，Sp5-shRNA組細(xì)胞增殖率較空白對照組和空載病毒組增加；提示沉默Sp5基因可促進(jìn)mEPMCs細(xì)胞增殖。

細(xì)胞增殖能力的改變與細(xì)胞周期有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，沉默Sp5基因后mEPMCs 處于DNA 合成期（S期）的細(xì)胞比例升高，DNA合成前期（G0/G1期）的細(xì)胞比例降低，提示沉默Sp5基因后處于S 期的mEPMCs細(xì)胞增多。多種基因蛋白參與調(diào)控細(xì)胞周期，其中CyclinD1是調(diào)控細(xì)胞周期的關(guān)鍵蛋白［22］，可通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶（Cyclindependent kinases，CDKs）的活性，促進(jìn)細(xì)胞從G1 期向S 期轉(zhuǎn)變，從而促進(jìn)細(xì)胞增殖［23］。本研究結(jié)果顯示，沉默Sp5基因后，mEPMCs 中CyclinD1 蛋白和mRNA 表達(dá)水平高于空白對照組和空載病毒組，提示沉默Sp5基因后CyclinD1 表達(dá)上調(diào)，可能會使mEPMCs細(xì)胞周期由G0/G1期向S期轉(zhuǎn)換，從而促進(jìn)mEPMCs 細(xì)胞增殖。陳玨蓉等［24］研究表明，地塞米松可影響小鼠胚胎腭突Shh下游信號傳遞和初級纖毛解聚，抑制CyclinD1表達(dá)，從而抑制小鼠胚胎腭突細(xì)胞增殖，與本研究結(jié)果相似，提示Sp5通過Wnt信號通路調(diào)控mEPMCs細(xì)胞增殖及細(xì)胞周期參與腭的發(fā)育，但沉默Sp5基因后，Wnt 信號通路分子間是否存在相互作用尚需進(jìn)一步探究。

綜上所述，沉默Sp5基因可提高Wnt 信號通路相關(guān)因子β-catenin、GSK-3β、Wnt3a 表達(dá)，促進(jìn)mEPMCs 細(xì)胞增殖及使其細(xì)胞周期從G0/G1 期向S期轉(zhuǎn)變。深入研究Sp5基因在腭裂發(fā)生發(fā)展中的作用及其機(jī)制，這將為唇腭裂畸形的病因、早期篩查研究、疾病預(yù)防、診療提供新思路。