miR-141-3p通過(guò)調(diào)節(jié)Keap1-NRF2/ARE信號(hào)通路對(duì)急性呼吸窘迫綜合征大鼠肺纖維化的影響

龍光文，張謙，楊秀林，孫鴻鵬，吉春玲

急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）是由彌漫性肺部炎癥和水腫引起的肺損傷，導(dǎo)致肺泡毛細(xì)血管屏障破壞、低氧血癥、細(xì)胞大量凋亡和肺纖維化［1］。其中，肺損傷后組織修復(fù)異常導(dǎo)致肺纖維化是急性期后ARDS患者病死率較高的主要原因［2］。自噬和上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial mesenchymal transition，EMT）在急性肺損傷（acute lung injury，ALI）及其纖維化過(guò)程中起重要作用。自噬可通過(guò)抑制EMT，增強(qiáng)肺纖維化的局部肌成纖維細(xì)胞分化，調(diào)節(jié)ARDS 進(jìn)展［3］。因此，探究介導(dǎo)ARDS患者肺部損傷和肺纖維化發(fā)展分子機(jī)制對(duì)治療和改善預(yù)后非常重要。微小RNA（miRNA）是調(diào)節(jié)基因的非編碼RNA，廣泛參與炎癥和纖維化，其中miR-141-3p具有調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化、凋亡和炎癥反應(yīng)的作用。研究表明，miR-141-3p在脂多糖（LPS）誘導(dǎo)的人肺成纖維細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)［4］。核因子E2 相關(guān)因子2（nuclear factor erythroid 2-related factor 2，NRF2）是一種具有抗炎和抗氧化活性的轉(zhuǎn)錄因子，在正常情況下，NRF2 與Kelch 樣環(huán)相關(guān)蛋白1（Kelch-like ECH-associated protein 1，Keap1）結(jié)合；當(dāng)細(xì)胞中存在氧化還原失衡時(shí)，NRF2 與Keap1解離，并結(jié)合細(xì)胞核中的抗氧化反應(yīng)元件（antioxidant response element，ARE）來(lái)促進(jìn)抗氧化基因的轉(zhuǎn)錄［5］。通過(guò)調(diào)節(jié)Keap1/NRF2 信號(hào)通路可緩解LPS 誘導(dǎo)的ALI［6］。miR-141-3p 能否通過(guò)調(diào)節(jié)Keap1-NRF2/ARE 信號(hào)通路影響ARDS 大鼠肺纖維化尚不清楚。本研究通過(guò)構(gòu)建肺纖維化大鼠模型，對(duì)其進(jìn)行探討。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 40只SPF級(jí)SD大鼠購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（滬）2022-0004，飼養(yǎng)單位為貴州省疾病預(yù)防控制中心，使用許可證號(hào)：SYXK（黔）2020-0001，6～8周齡，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，飼養(yǎng)環(huán)境溫度22 ℃左右，濕度55%，12 h光暗循環(huán)，不禁水食。本研究通過(guò)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 主要試劑與儀器 大鼠肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞RLE-6TN購(gòu)自美國(guó)ACCT 細(xì)胞庫(kù)。miR-141-3p agomir 及其陰性對(duì)照（agomir-NC）、miR-141-3p 模擬物（mimics）及其陰性對(duì)照（miR-NC）、Keap1 過(guò)表達(dá)質(zhì)粒（Keap1）及其對(duì)照（pcDNA，上海艾博思生物公司）；胎牛血清（FBS）、Ham's F12 培養(yǎng)基（武漢普諾賽生命科技有限公司）；雙螢光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒（美國(guó)Promega 公司）；TRIzol 試劑盒（沈陽(yáng)萬(wàn)類生物公司）；實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒（日本Takara公司）；羥脯氨酸（Hyp）試劑盒、Masson染色試劑盒（北京索萊寶公司）；HE 染色試劑盒（上海翌圣生物公司）；腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素（IL）-1β酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）試劑盒（上海酶聯(lián)生物公司）；丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒（北京百奧萊博科技有限公司）；上皮型鈣黏附素（E-cadherin）、神經(jīng)型鈣黏附素（N-cadherin）和β-actin 一抗（上海愛(ài)必信公司）；微管相關(guān)蛋白輕鏈3B（LC3B）、自噬相關(guān)基因Beclin-1、α 平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA）、Ⅰ型膠原（Col-Ⅰ）、Keap1、NRF2、血紅素氧合酶1（HO-1）抗體和辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG二抗（英國(guó)Abcam公司）。全自動(dòng)酶標(biāo)儀（奧地利TECAN公司）；熒光定量PCR儀（美國(guó)Bio-rad公司）；顯微鏡（日本尼康公司）。

1.3 方法

1.3.1 動(dòng)物模型構(gòu)建和分組 將大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為對(duì)照組、模型組、agomir-NC 組、miR-141-3p agomir 組，每組10只。除對(duì)照組外，其余大鼠構(gòu)建ARDS 模型［7］，麻醉大鼠，分離暴露氣管，將LPS（5 mg/kg）滴注于大鼠氣管內(nèi)，輕柔旋轉(zhuǎn)大鼠以促進(jìn)LPS 均勻分布。對(duì)照組滴注相同劑量的生理鹽水。24 h 后大鼠出現(xiàn)呼吸頻率增快、精神萎靡、活動(dòng)減少等癥狀表明模型構(gòu)建成功，其中造模過(guò)程中4只大鼠死亡，對(duì)造模不成功或死亡大鼠進(jìn)行補(bǔ)充。造模48 h 后，agomir-NC組、miR-141-3p agomir 組分別氣管滴注agomir-NC、miR-141-3p agomir慢病毒50 μL，并輕柔旋轉(zhuǎn)大鼠，對(duì)照組和模型組給予相同劑量的生理鹽水，每周2次，連續(xù)3周。造模成功后，麻醉處死大鼠，取左肺組織4%多聚甲醛固定進(jìn)行HE 染色、Masson染色；右肺組織-80 ℃保存進(jìn)行其余檢測(cè)。

1.3.2 細(xì)胞培養(yǎng)、處理和分組 將RLE-6TN 細(xì)胞置于含10%PBS 的Ham's F12 培養(yǎng)基中，37°C、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。將RLE-6TN 細(xì)胞分為NC 組、LPS 組、miR-NC 組、miR-141-3p mimics 組、miR-141-3p mimics+pcDNA 組、miR-141-3p mimics+Keap1 組。除NC 組外，其余各組RLE-6TN 細(xì)胞以5 mg/L LPS［8］誘導(dǎo)24 h 構(gòu)建LPS 細(xì)胞模型，miR-NC 組、miR-141-3p mimics 組、miR-141-3p mimics+pcDNA 組、miR-141-3p mimics+Keap1 組在LPS 誘導(dǎo)的基礎(chǔ)上質(zhì)粒轉(zhuǎn)染miR-NC、miR-141-3p mimics、miR-141-3p mimics+pcDNA、miR-141-3p mimics+Keap1，NC 組正常培養(yǎng)，所有細(xì)胞經(jīng)培養(yǎng)48 h后用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.3 qPCR 將各組肺組織和細(xì)胞培養(yǎng)48 h 后使用TRIzol試劑盒提取總RNA，并用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒得到cDNA，隨后進(jìn)行qPCR。反應(yīng)體系為20 μL：2×SG Fast qPCR Master Mix 10 μL，上、下游引物各0.4 μL，cDNA 模板2 μL，PCR-grade water 補(bǔ)至20 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性3 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共計(jì)40 個(gè)循環(huán)。miR-141-3p 以U6 為內(nèi)參，Keap1 以GAPDH 為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算miR-141-3p、Keap1 mRNA相對(duì)表達(dá)水平。引物由上海生工生物公司合成，見(jiàn)表1。

Tab.1 qPCR primer sequences表1 qPCR引物序列

1.3.4 Western blot 檢測(cè)蛋白表達(dá) 取-80 ℃保存的大鼠肺組織和細(xì)胞，用RIPA 裂解，提取總蛋白，用BCA 試劑盒進(jìn)行濃度定量，按步驟將蛋白SDS-PAGE 電泳、轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉2 h，在4 ℃下加入兔抗鼠一抗E-cadherin、Ncadherin、LC3B、Beclin-1、α-SMA、Col-Ⅰ、Keap1、NRF2、HO-1（1∶1 000）和β-actin（1∶2 000）過(guò)夜孵育，清洗，在4 ℃下加入二抗山羊抗兔IgG（1∶2 000），孵育2 h。用ECL 發(fā)光顯影，觀察拍照，各條帶灰度值用Image J軟件處理分析

1.3.5 HE 染色和Masson 染色 取多聚甲醛固定的肺組織，石蠟包埋，制備肺切片（4 μm），脫蠟后HE 染色、Masson 染色，脫水封片后在電子顯微鏡下觀察肺部組織病理學(xué)變化并拍照。并對(duì)肺組織進(jìn)行肺損傷評(píng)分和肺纖維化面積評(píng)分，其中肺損傷評(píng)分：有無(wú)出血；肺泡隔膜數(shù)；肺泡內(nèi)纖維蛋白量；每視野肺泡內(nèi)炎性浸潤(rùn)，共計(jì)為0～4 分，分?jǐn)?shù)越高損傷程度越重。肺纖維化面積評(píng)分：0分，不存在纖維化；1分，輕度；2分，中度；3分，重度；4分，極重度［9］。

1.3.6 Hyp 含量測(cè)定 取-80 ℃保存大鼠肺組織，6 mol/L 的120 ℃HCl 中水解過(guò)夜，并調(diào)節(jié)pH 值至中性，按照Hyp 試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)其含量。

1.3.7 ELISA法檢測(cè)炎性因子和氧化應(yīng)激指標(biāo) 取-80 ℃保存大鼠肺組織和細(xì)胞，按照ELISA 試劑盒說(shuō)明書(shū)，檢測(cè)炎性因子IL-1β、TNF-α和氧化應(yīng)激指標(biāo)MDA、SOD水平。

1.3.8 雙螢光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn) 構(gòu)建含Keap1 的野生型（WT）和突變型（MUT）序列的重組質(zhì)粒，將突變位點(diǎn)克隆至PmirGLO 載體，分別命名為WT-Keap1 和MUT-Keap1。將上述重組報(bào)告質(zhì)粒分別與miR-141-3p mimics 或miR-NC 共轉(zhuǎn)染至RLE-6TN 細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染48 h 后用螢光素酶試劑盒檢測(cè)螢光素酶活性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以±s表示，多組間比較用單因素方差分析，組間多重比較采用SNK-q檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-141-3p 和Keap1 在各組大鼠肺組織中的表達(dá) 與對(duì)照組相比，模型組、agomir-NC 組大鼠肺組織miR-141-3p、NRF2、HO-1 表達(dá)水平降低，Keap1 mRNA 及蛋白表達(dá)水平升高（P＜0.05）；與模型組相比，miR-141-3p agomir 組miR-141-3p、NRF2、HO-1 表達(dá)水平顯著升高，Keap1 mRNA 及蛋白表達(dá)降低（P＜0.05）。見(jiàn)圖1、表2。

Fig.1 Expression of Keap1-NRF2/ARE pathway protein in lung tissue of rats in each group圖1 各組大鼠肺組織Keap1-NRF2/ARE通路蛋白表達(dá)

Tab.2 Expression of miR-141-3p,Keap1-NRF2/ARE in lung tissue of rats in each group表2 各組大鼠肺組織miR-141-3p、Keap1-NRF2/ARE表達(dá)（n=10，±s）

Tab.2 Expression of miR-141-3p,Keap1-NRF2/ARE in lung tissue of rats in each group表2 各組大鼠肺組織miR-141-3p、Keap1-NRF2/ARE表達(dá)（n=10，±s）

＊＊P＜0.01；a與對(duì)照組比較，b與模型組比較，P＜0.05。

組別對(duì)照組模型組agomir-NC組miR-141-3p agomir組F miR-141-3p 1.03±0.10 0.41±0.04a 0.45±0.06a 0.88±0.10b 152.209＊＊Keap1 mRNA 1.00±0.09 1.59±0.16a 1.61±0.14a 1.18±0.13b 52.517＊＊Keap1 0.46±0.05 0.94±0.09a 0.95±0.10a 0.52±0.06b 115.083＊＊NRF2 0.88±0.10 0.44±0.06a 0.45±0.07a 0.81±0.09b 81.454＊＊HO-1 0.78±0.09 0.37±0.04a 0.35±0.05a 0.62±0.08b 92.186＊＊

2.2 過(guò)表達(dá)miR-141-3p對(duì)肺組織病理學(xué)變化的影響 對(duì)照組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)完整，無(wú)炎癥、水腫、出血，未見(jiàn)膠原沉積；模型組、agomir-NC 組大鼠出現(xiàn)肺組織損傷，肺泡壁增厚、水腫出血、破裂，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，出現(xiàn)大量藍(lán)色膠原纖維；相比于模型組、agomir-NC 組，miR-141-3p agomir 組大鼠肺組織病理?yè)p傷減輕，炎性細(xì)胞和膠原沉積減少。見(jiàn)圖2，與對(duì)照組相比，模型組、agomir-NC 組大鼠肺損傷評(píng)分、肺纖維化面積評(píng)分升高（P＜0.05）；與模型組相比，miR-141-3p agomir 組肺損傷評(píng)分、肺纖維化面積評(píng)分降低（P＜0.05）。見(jiàn)表3。

Fig.2 Pathological staining of lung tissue in each group(×200)圖2 各組大鼠肺組織病理染色圖（×200）

Tab.3 Lung injury and pulmonary fibrosis area scores in each group表3 各組大鼠肺組織肺損傷和肺纖維化面積評(píng)分（n=10，分，±s）

Tab.3 Lung injury and pulmonary fibrosis area scores in each group表3 各組大鼠肺組織肺損傷和肺纖維化面積評(píng)分（n=10，分，±s）

＊＊P＜0.01；a與對(duì)照組比較，b與模型組比較，P＜0.05。

組別對(duì)照組模型組agomir-NC組miR-141-3p agomir組F肺損傷評(píng)分0.00±0.00 3.08±0.36a 3.12±0.34a 1.24±0.26b 110.639＊＊肺纖維化面積評(píng)分0.00±0.00 3.29±0.46a 3.32±0.49a 1.70±0.35b 44.875＊＊

2.3 過(guò)表達(dá)miR-141-3p 對(duì)Hyp 含量、炎性因子和氧化應(yīng)激水平影響 與對(duì)照組相比，模型組、agomir-NC 組大鼠肺組織Hyp、IL-1β、TNF-α、MDA升高，SOD降低（P＜0.05）；與模型組相比，miR-141-3p agomir 組Hyp、IL-1β、TNF-α、MDA 降低，SOD 升高（P＜0.05）。見(jiàn)表4。

Tab.4 Comparison of Hyp content,inflammatory factors and oxidative stress levels in lung tissue between the four groups of rats表4 各組大鼠肺組織Hyp含量、炎性因子和氧化應(yīng)激水平比較（n=10，±s）

Tab.4 Comparison of Hyp content,inflammatory factors and oxidative stress levels in lung tissue between the four groups of rats表4 各組大鼠肺組織Hyp含量、炎性因子和氧化應(yīng)激水平比較（n=10，±s）

＊＊P＜0.01；a與對(duì)照組比較，b與模型組比較，P＜0.05。

組別對(duì)照組模型組agomir-NC組miR-141-3p agomir組F Hyp/（μg/g）413.68±52.06 1 068.51±14.27a 1 019.84±10.41a 583.74±62.08b 114.771＊＊IL-1β/（ng/L）17.39±2.14 62.83±7.53a 61.29±6.32a 24.58±3.52b 201.172＊＊TNF-α/（ng/L）35.62±4.97 80.37±9.13a 81.43±8.75a 42.57±5.39b 142.026＊＊MDA/（mmol/g）2.37±0.54 5.26±1.23a 5.24±1.47a 2.45±0.47b 25.700＊＊SOD/（U/mg）22.38±2.61 12.75±1.38a 13.46±1.41a 20.64±3.68b 39.818＊＊

2.4 過(guò)表達(dá)miR-141-3p 對(duì)肺組織E-cadherin、Ncadherin、LC3B、Beclin-1、α-SMA、Col-Ⅰ蛋白表達(dá)的影響 與對(duì)照組相比，模型組、agomir-NC 組大鼠肺組織E-cadherin、LC3B、Beclin-1 蛋白表達(dá)降低，N-cadherin、α-SMA、Col-Ⅰ升高（P＜0.05）；與模型組相比，miR-141-3p agomir 組E-cadherin、LC3B、Beclin-1蛋白表達(dá)升高，N-cadherin、α-SMA、Col-Ⅰ降低（P＜0.05）。見(jiàn)圖3、表5。

Fig.3 The expression of E-cadherin,N-cadherin,LC3B,Beclin-1,α-SMA and Col-I protein in lung tissue of rats in each group圖3 各組大鼠肺組織E-cadherin、N-cadherin、LC3B、Beclin-1、α-SMA、Col-Ⅰ蛋白表達(dá)變化

Tab.5 The expression of E-cadherin,N-cadherin,LC3B,Beclin-1,α-SMA and Col-Ⅰprotein in lung tissue of rats in each group表5 各組大鼠肺組織E-cadherin、N-cadherin、LC3B、Beclin-1、α-SMA、Col-Ⅰ蛋白表達(dá) （n=10，±s）

Tab.5 The expression of E-cadherin,N-cadherin,LC3B,Beclin-1,α-SMA and Col-Ⅰprotein in lung tissue of rats in each group表5 各組大鼠肺組織E-cadherin、N-cadherin、LC3B、Beclin-1、α-SMA、Col-Ⅰ蛋白表達(dá) （n=10，±s）

＊＊P＜0.01；a與對(duì)照組比較，b與模型組比較，P＜0.05。

組別對(duì)照組模型組agomir-NC組miR-141-3p agomir組F Col-Ⅰ0.34±0.05 1.04±0.13a 1.02±0.10a 0.45±0.06b 165.444＊＊E-cadherin 0.96±0.10 0.54±0.06a 0.51±0.05a 0.83±0.09b 80.331＊＊N-cadherin 0.57±0.06 1.04±0.11a 1.08±0.10a 0.61±0.07b 96.950＊＊LC3B 0.92±0.10 0.46±0.05a 0.49±0.07a 0.88±0.09b 95.098＊＊Beclin-1 1.03±0.13 0.52±0.06a 0.55±0.07a 0.84±0.09b 71.048＊＊α-SMA 0.48±0.07 0.95±0.11a 0.97±0.14a 0.53±0.06b 69.146＊＊

2.5 miR-141-3p 與Keap1 靶向關(guān)系驗(yàn)證 生物信息學(xué)分析顯示，miR-141-3p 與Keap1 存在靶向結(jié)合位點(diǎn)，見(jiàn)圖4。雙螢光素酶實(shí)驗(yàn)顯示，與miR-NC+WT-Keap1 組相比，miR-141-3p mimics+WT-Keap1組相對(duì)螢光素酶活性降低（0.41±0.06vs.1.02±0.10，t=12.813，P＜0.05），與miR-NC+MUT-Keap1 組相比，miR-141-3p mimics+MUT-Keap1 組相對(duì)螢光素酶活性差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（1.03±0.11vs.1.00±0.13，t=0.432，P＞0.05）。

Fig.4 Prediction of the targeting relationship between Keap1 and miR-141-3p圖4 Keap1與miR-141-3p靶向關(guān)系預(yù)測(cè)

2.6 miR-141-3p 和Keap1-NRF2/ARE 信號(hào)通路在各組細(xì)胞中的表達(dá) 與NC組相比，LPS組、miR-NC組miR-141-3p、NRF2、HO-1 表達(dá)水平降低，Keap1mRNA 及蛋白表達(dá)水平升高（P＜0.05）；與LPS 組相比，miR-141-3p mimics 組、miR-141-3p mimics+pcDNA 組miR-141-3p、NRF2、HO-1 表達(dá)水平顯著升高，Keap1 mRNA 及蛋白表達(dá)降低（P＜0.05）；與miR-141-3p mimics 組相比，miR-141-3p mimics+Keap1 組miR-141-3p、NRF2、HO-1 表達(dá)水平降低，Keap1 mRNA及蛋白表達(dá)水平升高（P＜0.05）。見(jiàn)圖5、表6。

Fig.5 Expression changes of Keap1-NRF2/ARE signaling pathway in each group of cells圖5 各組細(xì)胞Keap1-NRF2/ARE信號(hào)通路表達(dá)變化

Tab.6 Changes in expression levels of miR-141-3p and Keap1-NRF2/ARE in each group of cells表6 各組細(xì)胞miR-141-3p、Keap1-NRF2/ARE表達(dá)變化（n=6，±s）

Tab.6 Changes in expression levels of miR-141-3p and Keap1-NRF2/ARE in each group of cells表6 各組細(xì)胞miR-141-3p、Keap1-NRF2/ARE表達(dá)變化（n=6，±s）

＊＊P＜0.01；a與NC組比較，b與LPS組比較，c與miR-141-3p mimics組比較，P＜0.05。

組別NC組LPS組miR-NC組miR-141-3p mimics組miR-141-3p mimics+pcDNA組miR-141-3p mimics+Keap1組F miR-141-3p 1.00±0.10 0.32±0.04a 0.35±0.05a 0.89±0.10b 0.90±0.11b 0.40±0.06c 91.128＊＊Keap1 mRNA 1.02±0.09 1.85±0.19a 1.83±0.18a 1.28±0.14b 1.25±0.13b 1.74±0.18c 37.999＊＊Keap1 0.48±0.06 1.04±0.10a 1.05±0.11a 0.57±0.07b 0.55±0.06b 0.84±0.09c 57.719＊＊NRF2 0.92±0.10 0.34±0.05a 0.35±0.06a 0.85±0.09b 0.83±0.08b 0.41±0.05c 83.166＊＊HO-1 0.86±0.09 0.32±0.04a 0.31±0.04a 0.76±0.08b 0.74±0.09b 0.43±0.05c 76.020＊＊

2.7 miR-141-3p靶向調(diào)節(jié)Keap1對(duì)IL-1β、TNF-α、

MDA、SOD、E-cadherin、N-cadherin、LC3B、Beclin-1、α-SMA、Col-Ⅰ的影響 與NC組相比，LPS組、miRNC 組SOD、E-cadherin、LC3B、Beclin-1 表達(dá)降低，IL-1β、TNF-α、MDA、N-cadherin、α-SMA、Col-Ⅰ表達(dá)水平升高（P＜0.05）；與LPS 組相比，miR-141-3p mimics 組、miR-141-3p mimics+pcDNA 組SOD、Ecadherin、LC3B、Beclin-1 表達(dá)水平升高，IL-1β、TNF-α、MDA、N-cadherin、α-SMA、Col-Ⅰ表達(dá)降低（P＜0.05）；與miR-141-3p mimics 組相比，miR-141-3p mimics+Keap1 組SOD、E-cadherin、LC3B、Beclin-1 表達(dá)水平降低，IL-1β、TNF-α、MDA、Ncadherin、α-SMA、Col-Ⅰ表達(dá)升高（P＜0.05）。見(jiàn)圖6，表7、8。

Fig.6 The protein expressions of E-cadherin,N-cadherin,LC3 B,Beclin-1,α-SMA and Col-Ⅰin each group圖6 各組細(xì)胞E-cadherin、N-cadherin、LC3B、Beclin-1、α-SMA、Col-Ⅰ蛋白表達(dá)

Tab.7 Comparison of IL-1β,TNF-α,MDA and SOD levels between the six groups表7 各組細(xì)胞IL-1β、TNF-α、MDA、SOD水平比較（n=6，±s）

Tab.7 Comparison of IL-1β,TNF-α,MDA and SOD levels between the six groups表7 各組細(xì)胞IL-1β、TNF-α、MDA、SOD水平比較（n=6，±s）

＊＊P＜0.01；a與NC組比較，b與LPS組比較，c與miR-141-3p mimics組比較，P＜0.05。

組別NC組LPS組miR-NC組miR-141-3p mimics組miR-141-3p mimics+pcDNA組miR-141-3p mimics+Keap1組F IL-1β/（ng/L）20.14±2.81 73.46±7.35a 71.08±7.48a 31.25±4.07b 35.73±4.28b 62.15±7.06c 91.789＊＊TNF-α/（ng/L）40.62±4.59 91.39±10.13a 89.73±9.64a 49.56±5.03b 48.41±5.72b 71.53±8.04c 52.171＊＊MDA/（nmol/L）2.45±0.32 5.63±1.53a 5.64±1.47a 2.86±0.48b 2.85±0.47b 4.36±1.25c 11.416＊＊SOD/（U/L）25.81±2.63 11.97±1.36a 12.04±1.39a 19.68±2.46b 20.54±2.63b 15.36±1.58c 40.727＊＊

Tab.8 Comparison of E-cadherin,N-cadherin,LC3 B,Beclin-1,α-SMA and Col-Ⅰprotein levels between the six groups表8 各組細(xì)胞E-cadherin、N-cadherin、LC3B、Beclin-1、α-SMA、Col-Ⅰ蛋白表達(dá)比較（n=6，±s）

Tab.8 Comparison of E-cadherin,N-cadherin,LC3 B,Beclin-1,α-SMA and Col-Ⅰprotein levels between the six groups表8 各組細(xì)胞E-cadherin、N-cadherin、LC3B、Beclin-1、α-SMA、Col-Ⅰ蛋白表達(dá)比較（n=6，±s）

＊＊P＜0.01；a與NC組比較，b與LPS組比較，c與miR-141-3p mimics組比較，P＜0.05。

組別NC組LPS組miR-NC組miR-141-3p mimics組miR-141-3p mimics+pcDNA組miR-141-3p mimics+Keap1組F E-cadherin 1.16±0.14 0.45±0.06a 0.48±0.07a 0.91±0.09b 0.93±0.11b 0.56±0.25c 27.623＊＊N-cadherin 0.47±0.06 1.08±0.12a 1.06±0.11a 0.56±0.06b 0.58±0.07b 0.93±0.13c 48.701＊＊LC3B 0.98±0.10 0.45±0.06a 0.47±0.05a 0.83±0.09b 0.85±0.08b 0.51±0.08c 52.012＊＊Beclin-1 1.13±0.12 0.36±0.05a 0.38±0.06a 0.88±0.10b 0.85±0.09b 0.48±0.05c 88.257＊＊α-SMA 0.45±0.06 1.14±0.12a 1.12±0.10a 0.57±0.06b 0.56±0.07b 0.86±0.11c 61.578＊＊Col-Ⅰ0.38±0.04 1.06±0.12a 1.04±0.11a 0.43±0.05b 0.46±0.06b 0.91±0.10c 84.890＊＊

3 討論

肺纖維化的主要特征是成纖維細(xì)胞增殖伴細(xì)胞外基質(zhì)（主要是膠原蛋白）過(guò)度沉積，導(dǎo)致肺泡結(jié)構(gòu)的破壞并促進(jìn)重塑，是ARDS 患者預(yù)后不良的主要因素［2］。LPS 氣管給藥是誘導(dǎo)ARDS 和肺纖維化的常用方法，可促進(jìn)炎癥反應(yīng)和活性氧（ROS）的產(chǎn)生，抑制抗氧化活性，從而誘導(dǎo)肺組織和細(xì)胞EMT的發(fā)生［10］。EMT 是上皮細(xì)胞逐漸獲得間充質(zhì)特征的關(guān)鍵過(guò)程，與多種病理過(guò)程相關(guān)，如肺纖維化，從而導(dǎo)致ARDS 患者的不良結(jié)局。研究證實(shí)，抑制EMT 可改善ARDS肺纖維化［11］。自噬是一種依賴溶酶體的自我消化過(guò)程，可對(duì)功能失調(diào)的細(xì)胞成分和受損蛋白質(zhì)進(jìn)行降解。自噬在許多病理生理狀況中起著重要作用，其中肺部疾病時(shí)肺組織可出現(xiàn)不同程度的自噬異常，而中等程度的自噬有利于疾病狀況的改善［12］。已有研究表明，抑制自噬會(huì)導(dǎo)致肺成纖維細(xì)胞增殖［13］。此外，自噬與EMT還可能相互調(diào)節(jié)參與肺纖維化，在肺泡上皮細(xì)胞中，抑制自噬可促進(jìn)EMT，增強(qiáng)局部肌成纖維細(xì)胞分化，導(dǎo)致纖維化發(fā)生［14］。因此，促進(jìn)ARDS自噬，抑制EMT可能緩解肺纖維化進(jìn)程。

本研究發(fā)現(xiàn)，LPS誘導(dǎo)后ARDS大鼠肺組織出現(xiàn)嚴(yán)重?fù)p傷，肺泡壁增厚、水腫、出血、破裂，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，大量膠原沉積，IL-1β、TNF-α、MDA、纖維化相關(guān)蛋白（α-SMA、Col-Ⅰ）升高，表明ARDS大鼠出現(xiàn)炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激，導(dǎo)致肺部損傷。肺組織中Hyp水平可反映肺纖維化的程度，ARDS大鼠肺組織Hyp水平升高，肺組織和細(xì)胞中纖維化相關(guān)蛋白（α-SMA、Col-Ⅰ）、間充質(zhì)標(biāo)志物N-cadherin 升高，上皮標(biāo)志物E-cadherin、自噬相關(guān)蛋白（LC3B、Beclin-1）表達(dá)降低，表明ARDS中發(fā)生自噬抑制和EMT，猜測(cè)肺纖維化的發(fā)生與自噬抑制和EMT進(jìn)程有關(guān)。

miR-141-3p是miR-200家族的成員，可以通過(guò)調(diào)節(jié)功能蛋白參與多種疾病的發(fā)生發(fā)展。miR-141-3p與多種疾病EMT和纖維化有關(guān)。Zhang等［15］發(fā)現(xiàn)miR-141-3p 下調(diào)促進(jìn)腎曲小管上皮細(xì)胞EMT進(jìn)程和纖維化發(fā)展；Zhu 等［16］發(fā)現(xiàn)在博來(lái)霉素（BLM）誘導(dǎo)建立的小鼠肺纖維化模型中，上調(diào)miR-141-3p表達(dá)可促進(jìn)肺上皮細(xì)胞增殖，抑制EMT和凋亡，改善小鼠肺纖維化；Qian 等［17］發(fā)現(xiàn)miR-141-3p的上調(diào)通過(guò)靶向E 盒結(jié)合鋅指蛋白1（ZEB1），抑制EMT進(jìn)展來(lái)減輕BLM誘導(dǎo)的肺纖維化。此外，miR-141-3p在急性肺炎患者和LPS刺激的人肺成纖維細(xì)胞中下調(diào)，上調(diào)其表達(dá)可減輕LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡、自噬和炎癥反應(yīng)［4］。本研究通過(guò)建立ARDS模型，發(fā)現(xiàn)miR-141-3p 在LPS 誘導(dǎo)的肺組織和細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)，而過(guò)表達(dá)miR-141-3p可改善肺組織病理?yè)p傷和纖維化程度，降低Hyp含量，減少炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激，促進(jìn)自噬并降低EMT的發(fā)生。

Keap1/NRF2通路對(duì)于調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激至關(guān)重要，氧化應(yīng)激下NRF2與Keap1解離，從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核并與ARE 結(jié)合來(lái)激活下游抗氧化效應(yīng)子，如HO-1、SOD，發(fā)揮抗炎和抗氧化作用［5］。Keap1-NRF2/ARE信號(hào)通路參與調(diào)節(jié)肺部損傷和纖維化發(fā)展。研究發(fā)現(xiàn)，Hispolon 通過(guò)調(diào)節(jié)Keap1/Nrf2/HO-1通路，抑制氧化應(yīng)激介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和自噬，減輕LPS誘導(dǎo)的ALI［18］；七氟醚通過(guò)下調(diào)細(xì)胞核Keap1和上調(diào)NRF2 激活下游抗氧化劑信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，以消除氧化損傷改善LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和肺纖維化損傷［19］。此外，自噬不足與肺纖維化密切相關(guān)，自噬激活通過(guò)調(diào)節(jié)Keap1/NRF2 信號(hào)通路來(lái)緩解肺纖維化［20］。本研究發(fā)現(xiàn)，ARDS 大鼠炎癥和氧化應(yīng)激激活，自噬受到抑制，且肺組織和細(xì)胞中Keap1表達(dá)升高，NRF2、HO-1 表達(dá)水平顯著降低，表明Keap1/Nrf2/HO-1 通路參與ARDS 肺纖維化發(fā)展，可能與Keap1/NRF2信號(hào)通路介導(dǎo)的炎癥、氧化應(yīng)激和自噬有關(guān)。miR-141-3p 與Keap1 可能存在靶向關(guān)系。miR-141-3p通過(guò)調(diào)節(jié)Keap1/Nrf2/HO-1途徑可抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖和遷移，表明miR-141-3p可能通過(guò)激活Keap1-NRF2/ARE通路，激活自噬，抑制炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激和EMT，抑制ARDS 大鼠肺纖維化［21］。過(guò)表達(dá)Keap1 可逆轉(zhuǎn)過(guò)表達(dá)miR-141-3p 對(duì)ARDS大鼠肺纖維化的改善作用。

綜上所述，過(guò)表達(dá)miR-141-3p 可能激活Keap1-NRF2/ARE信號(hào)通路，激活自噬，抑制炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激和EMT 進(jìn)展，改善ARDS 大鼠肺纖維化。本研究為改善ARDS大鼠肺纖維化提供了新思路，但miR-141-3p與Keap1-NRF2/ARE信號(hào)通路之間的具體分子機(jī)制和miR-141-3p 在ARDS 肺纖維化中的其他發(fā)病機(jī)制還需進(jìn)一步探討。