蘭花草水提取物急性毒性試驗及藥效作用研究*

鐘承志,吳德松,張夢麒,龔呂東,李 婷,顏 宏,郭 琰△

(1.云南省藥物研究所,云南 昆明 650111;2.云南省中藥和民族藥新藥創(chuàng)制企業(yè)重點實驗室,云南 昆明 650111)

蘭花草最早記載于《滇南本草》[1]中,《滇南本草》系云南明代醫(yī)學家蘭茂歷經20年所著的一部記載和研究滇南地區(qū)特色藥材和民族民間用藥經驗的一部地方性本草學專著。蘭花草為蘭科(Orchidaceae)植物長葉蘭Cymbidium Lo Cymbidium Longifolium;hemostasis;diuretic;digestion promotion;acute toxicity ngifolium D.Don。多年生常綠草本,藥用部位:全草。

書中記載:“蘭花草,味苦、辛,治五淋便濁,利小便,除濕熱”,附方“治婦人赤帶、或紅白相間,或下陰作癢,小便急脹”和“昔一人?；急茄Y,每月數(shù)次,服此草,斷其根,其效甚遠[2]”;其中記載藥方“蘭花草三錢,紅牛膝二錢,地膚子一錢(水煎),點水服酒[3]”。查閱文獻,極少發(fā)現(xiàn)有關蘭花草藥效及毒性方面的研究報道,結合古書記載,筆者對蘭花草的急性毒性、利尿[5]和止血作用等相關藥效進行研究,考證古書所記載的療效,也為該中藥的研發(fā)提供一定的實驗依據(jù)。

1 實驗材料

1.1 受試樣品及實驗動物 SPF級KM小鼠,體重18～22 g,由遼寧長生生物技術有限公司提供。生產許可證號:SCXK(遼)2015-0001;蘭花草水提物,由云南省藥物研究所天然藥物化學研究室提供,批號:20161221;氫氯噻嗪片,常州制藥廠有限公司生產,批號:16062012;大黃,江陰天江藥業(yè)有限公司生產,批號:1510124;酚磺乙胺注射液,國藥集團榮生制藥有限公司,批號:1508323。

1.2 提取物制備 蘭花草粗碎,加水回流提取2次,加水量分別為10倍和8倍,提取時間分別為2 h和1 h,過濾,濾液合并,濃縮干燥得提取物浸膏,提取率為:15.62%。

1.3 樣品溶液及陽性對照藥配制 根據(jù)前期藥效預實驗的研究結果,本文中藥效實驗蘭花草水提物小鼠給藥劑量為0.25、0.50、1.00 g·kg-1。試驗時使用純水配制成所需濃度,供動物灌胃給藥,小鼠灌胃體積為20 mL·kg-1;氫氯噻嗪片,臨床用量為每天1～2 mg·kg-1,本研究小鼠劑量為20 mg·kg-1,實驗時使用CMC-Na配制灌胃給藥;大黃顆粒,臨床用量為每天0.05 g·kg-1,本研究小鼠劑量為2.0 g·kg-1,實驗時使用CMC-Na配制灌胃給藥;酚磺乙胺注射液,臨床用量為每天1.5 g·kg-1,本研究小鼠劑量為1 g·kg-1,使用生理鹽水配制腹腔注射給藥。

1.4 試劑 活性碳粉(廣東臺山化工廠,批號:810805);0.9%氯化鈉注射液(昆明南疆制藥有限公司,批號:A160914 J2);CMC-Na(國藥集團化學試劑有限公司,批號:20160602)。

1.5 儀器 JJ-2000型電子天平,美國雙杰兄弟(集團)有限公司常熟市雙杰測試儀器廠生產、OSB-2000水浴鍋,上海愛郎儀器有限公司生產、PL-203電子分析天平METTER-TOLEDO(上海)有限公司生產、ELGA LA 613超純水機,英國ELGA LabWater/VWS(UK)Ltd生產。

2 實驗方法

2.1 蘭花草水提取物小鼠急性毒性實驗[4-5]根據(jù)急性毒性預實驗的研究結果,蘭花草水提取物的急性毒性試驗最大耐受量和最小致死量法。小鼠按體重分層隨機分為5個組,每組20只,雌雄各半。分別為正常對照組(N)、蘭花草低劑量組(蘭花草-D)、蘭花草中劑量組(蘭花草-Z)、蘭花草高劑量組(蘭花草-G)、蘭花草極高劑量組(蘭花草-JG)。各組在禁食不禁水12 h后,蘭花草水提取物各劑量組按40 mL·kg-1給藥容量灌胃給予相應濃度藥物,空白對照組按相同的灌胃容積給予純水[5]。給藥后仔細觀察小鼠活動特征4 h并記錄,若有死亡小鼠則解剖肉眼觀察內臟狀況并記錄,未死亡小鼠正常飼養(yǎng)14天,每天觀察記錄。給藥后第1天,第3天,第7天和第14天稱重,第14天脫椎處死進行解剖觀察(心、肝、脾、肺、腎、腸道、胃等),并計算蘭花草水提物的最大耐受量和最小致死量。

2.2 實驗動物分組及給藥 小鼠按體重分層隨機分為5個組(小鼠腸推進實驗4個組),每組20只(小鼠斷尾止血和玻片凝血實驗每組14只),雌雄各半。分別為正常對照組(N)、蘭花草低劑量組(蘭花草-D)、蘭花草中劑量組(蘭花草-Z)、蘭花草高劑量組(蘭花草-G)、陽性對照組(氫氯噻嗪/酚磺乙胺/大黃)。蘭花草水提取物各劑量組灌胃給予相應藥物,陽性對照組灌胃/腹腔注射給予相應陽性藥,每天1次,連續(xù)7 d,灌胃容量均為20 mL·kg-1,腹腔注射容量為10 mL·kg-1,空白對照組按相同的灌胃容積給予純水。

2.3 指標檢測

2.3.1 蘭花草水提取物小鼠利尿實驗[6-8]小鼠給藥7 d后,正式測量尿液前禁食20 h(不禁水),稱重后,先輕壓小鼠下腹部10次,排盡余尿,每只小鼠灌胃純水1 mL作水負荷,隨即灌胃給藥,記錄給藥時間,然后將小鼠分別放入自制的漏斗內,下面放置量筒,每一小時測一次尿量,連續(xù)觀察測量4 h,測量尿液時小心去除落入量筒內的小鼠糞粒,記錄數(shù)據(jù)并進行統(tǒng)計分析。

2.3.2 蘭花草水提取物小鼠斷尾止血和玻片凝血實驗[8～13]小鼠給藥7 d后,灌胃30 min后用消毒剪刀橫剪小鼠尾端約1 cm血液自行流出計時,每30 s用濾紙吸血一次,當血流自然停止所需的時間為小鼠止血時間。斷尾止血后小鼠恢復性飼養(yǎng)兩天,同時給以藥,兩天后進行玻片凝血實驗,給藥后30 min后用眼科彎鑷迅速摘去一側眼球即有血液流出,棄去第一滴,于載玻片上滴2滴血,血滴直徑約5 mm,立即記時,每隔30 s用清潔大頭針自血滴邊緣向里呈45度角輕輕挑動一滴血1次,并觀察有無血絲挑起。若90 s還未出現(xiàn)血絲則挑動第二滴,從采血開始至挑起血絲止,所歷時間即為凝血時間,記錄數(shù)據(jù)并進行統(tǒng)計分析。(止血實驗和凝血實驗均在室溫141 ℃的環(huán)境下進行。)

2.3.3 蘭花草水提取物小鼠瀉下實驗[14～17]小鼠給藥7 d后禁食20 h(自由飲水)后分別灌服上述四種劑量組藥液炭末混懸液(0.5 mL/只),含炭末0.1 g·mL-1,空白對照組則用生理鹽水配制相同濃度炭末灌服。各鼠分別置于鋪有濾紙的集氣瓶內觀察,記錄小鼠排黑便的時間、糞便的性狀和數(shù)量,以及糞便沾染肛門情況。連續(xù)觀察6小時,記錄并進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計。

2.3.4 蘭花草水提取物小鼠腸推進實驗[17-20]小鼠給藥7 d后禁食20 h(自由飲水),各組灌胃給藥或者等體積生理鹽水(混有0.5%炭末),20 min后脫頸椎處死,打開腹腔分離腸系膜,剪去上端至幽門、下端至回盲腸部的腸管。不加牽引地將小腸拉成直線,測量腸管長度作為“小腸總長度”。從幽門至炭末前沿的距離作為“炭末在腸內推進距離”。用公式計算炭末推進百分率,比較組間差異。炭末推進率(%)=(炭末推進距離/小腸長度)×100%

2.6 統(tǒng)計分析 所有數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差表示。應用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析統(tǒng)計,兩兩比較,以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3 實驗結果

3.1 蘭花草水提取物小鼠急性毒性試驗 實驗結果(表1)顯示:14d觀察期內16.00 g·kg-1劑量組動物死亡2只,死亡率為10%;13.61 g·kg-1劑量組無動物死亡。對死亡動物進行大體解剖觀察,出現(xiàn)肺部充血癥狀。因未進行組織病理學檢查,不能確定肺部充血癥狀的具體原因。蘭花草水提取物小鼠最大耐受量為13.61 g·kg-1,最小致死量為16.00 g·kg-1,其余劑量組小鼠未出現(xiàn)明顯地急性毒性反應。

表1 蘭花草水提取物小鼠急性毒性試驗結果

3.2 蘭花草水提取物小鼠利尿實驗 實驗結果(表2)顯示:與正常對照組比較,蘭花草水提取物低劑量組和中劑量組小鼠給藥后1 h尿量顯著增加(P<0.01);蘭花草提取物高劑量組小鼠給藥后1 h和2 h總尿量均顯著增加(P<0.05);且在1 h時尿量最大,后隨時間呈遞減趨勢。與正常對照組比較,蘭花草提取物各劑量組小鼠4 h總尿量均顯著增加(P<0.01),提示蘭花草提取物具有良好的利尿作用。

表2 蘭花草水提取物對小鼠利尿作用的影響

3.3 蘭花草水提取物小鼠斷尾止血和玻片凝血實驗 實驗結果(圖1、圖2)顯示:與正常對照組比較,蘭花草水提取物中劑量和高劑量組小鼠止血時間顯著減少(P<0.05),蘭花草水提取物各劑量組小鼠凝血時間均有顯著降低(P<0.01)。提示蘭花草水提取物可能具有良好的止血作用。

圖1 蘭花草水提取物對小鼠斷尾止血作用的影響

圖2 蘭花草水提取物對小鼠玻片凝血作用的影響

3.4 蘭花草水提取物小鼠瀉下實驗 實驗結果(圖3、圖4、圖5)顯示:與正常對照組比較,蘭花草水提取物中劑量和高劑量組小鼠第一次排黑便時間明顯減少(P<0.05或P<0.01);蘭花草高劑量組小鼠排黑便數(shù)顯著增多(P<0.05);蘭花草水提取物中劑量和高劑量組小鼠排便總數(shù)明顯增多(P<0.05)。提示蘭花草水提取物可能具有良好的瀉下作用。

圖3 蘭花草水提取物對小鼠瀉下作用的影響

圖4 蘭花草水提取物對小鼠瀉下作用的影響

圖5 蘭花草水提取物對小鼠瀉下作用的影響

3.5 蘭花草水提取物小鼠腸推進實驗 實驗結果(圖6)顯示:與正常對照組比較,蘭花草水提取物各劑量組小鼠均未見有明顯地促腸推進作用。

圖6 蘭花草水提取物對小鼠腸推作用的影響

4 討論

《滇南本草》系云南明代醫(yī)學家蘭茂歷經20年所著的一部記載和研究滇南地區(qū)特色藥材和民族民間用藥經驗的一部地方性本草學專著。幾百年來,在長期實踐中,《滇南本草》所載的中草藥性味、療效及用藥方法得到證實,被云南省內各民族奉為醫(yī)藥至寶,不僅流傳全國各地,且遠播國外,促進了我國中醫(yī)中藥的發(fā)展。

蘭花草是記載于《滇南本草》[1-3]中的一味中藥,經查閱書籍和文獻報道,對于蘭花草藥效和毒性研究的文獻報道相對較少,根據(jù)《滇南本草》中對蘭花草的記載,我們推測蘭花草可能具有止血、利尿等藥效。此外,在開展利尿實驗過程中偶然發(fā)現(xiàn)蘭花草水提取物給藥組小鼠排便量均多于空白對照組小鼠,進而又對蘭花草水提取物促消化和瀉下作用進行了探索。

本文采用經典藥理學實驗方法中的小鼠斷尾止血[4-5]和玻片凝血實驗[6]進行蘭花草水提取物的止血作用研究,結果發(fā)現(xiàn),蘭花草水提取物可以顯著減少小鼠斷尾止血時間和凝血時間,提示蘭花草具有明顯地止血作用。利尿實驗方法[7-8]眾多,包括稱重法、輸尿管集尿法、家兔導尿管集尿法、代謝籠法和尿液中鈉、鉀和氯離子的含量測定法等,本文采用代謝籠法,簡單易行,實驗動物在生理或接近生理狀態(tài)下進行尿液收集,研究結果較為可靠,結果發(fā)現(xiàn),蘭花草水提取物可以顯著增加小鼠4 h的總尿量,提示,蘭花草具有良好的利尿作用。

蘭花草的腸推進和瀉下[14]作用研究結果不一致,分析原因可能是實驗觀察時間不同所致,腸推進作用觀察時間為20 min,瀉下作用觀察時間為6 h。腸推進作用可能更多的是觀察腸道蠕動功能,這就與藥物的濃度有一定的關系,本文中蘭花草水提取物給藥組的濃度明顯高于正常對照組灌胃的生理鹽水,所以在20 min的時間內很難觀察到蘭花草對腸道蠕動的優(yōu)勢,后續(xù)將改變實驗方法,再次進行研究。瀉下[17]作用不僅僅考察腸道的蠕動功能,還考察藥物對小腸和大腸的綜合作用。由于觀察時間較長,藥物可以在腸道內充分吸收,藥物濃度對腸道蠕動的影響減少,也可能通過其他途徑促進了機體的排泄。

綜上所述,初步確立了蘭花草水提取物的毒性和藥效,蘭花草水提取物毒性較低,并驗證古書記載,證實蘭花草具有利尿和止血作用,同時也發(fā)現(xiàn)了蘭花草具有顯著的瀉下作用,為蘭花草的開發(fā)利用提供了一定的實驗依據(jù)。