納米材料的適配子傳感器及其在醫(yī)學檢測中的應(yīng)用*

黎子華，王 婷，張焜和

（南昌大學第一附屬醫(yī)院消化內(nèi)科江西省消化疾病研究所，江西 南昌 330006）

0 引 言

適配子（aptamer）是短鏈寡核苷酸（單鏈DNA 或RNA序列），能夠高特異性和高親和力結(jié)合其生物靶分子，在分子識別及其相關(guān)的生物醫(yī)學研究中具有重要的潛在應(yīng)用價值［1］。納米材料是微粒尺寸為納米（nm）級的超細材料，通常介于1～100 nm之間，因其具有表面效應(yīng)、體積效應(yīng)和量子尺寸效應(yīng)，是21世紀最有前途的研究領(lǐng)域之一［2］。近年來，將適配子與納米材料耦合形成復(fù)合體，應(yīng)用于醫(yī)學檢測研究，顯示出良好的應(yīng)用前景。本文就這一領(lǐng)域的研究進展進行綜述。

1 適配子與納米材料

1.1 適配子

1990年，Tuerk C 和Gold L 利用隨機RNA 序列庫，結(jié)合聚合酶鏈式反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴增技術(shù)，經(jīng)過多輪篩選，獲得了噬菌體T4 DNA聚合酶的2 個高親和力RNA適配子［3］。這種體外篩選過程被稱為指數(shù)富集的配體系統(tǒng)進化（systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX）技術(shù)。此后，SELEX技術(shù)廣泛應(yīng)用于各種生物靶標的適配子篩選及研究應(yīng)用。

用于適配子篩選的單鏈隨機寡核苷酸文庫由人工合成。隨機寡核苷酸序列兩端為固定序列，是PCR擴增時的引物結(jié)合部位，中間為長度20～40 nt的隨機序列。文庫的序列總數(shù)可達1015～1016之多［4］。典型SELEX 實驗包括4個步驟：1）將靶分子與文庫孵育，使靶分子與寡核苷酸序列特異性結(jié)合；2）分離結(jié)合核酸序列，去掉未與靶分子結(jié)合的序列；3）洗脫與靶分子結(jié)合的核酸序列；4）擴增結(jié)合核酸序列，制備成新一輪篩選的文庫。重復(fù)上述過程數(shù)輪，文庫中能與靶分子高特異性和高親和力結(jié)合的核酸序列得到富集和擴增，再通過克隆和測序分離出適配子。通過SELEX技術(shù)已經(jīng)成功篩出多種靶標的適配子，包括小分子、金屬離子、蛋白質(zhì)、肽、細菌、病毒和活細胞，特別是以活細胞為靶標篩選的適配子，可以結(jié)合到細胞表面分子和膜蛋白［5］，實現(xiàn)基于適配子的細胞靶向作用［6］，在癌癥檢測和治療中具有重要價值［7］。

適配子和抗體相似，可以高親和力特異性結(jié)合靶分子，但有抗體不具備的一些優(yōu)勢，如靶分子廣泛、熱穩(wěn)定性好、易于修飾、分子量小、無免疫原性。適配子通常折疊成獨特的三維結(jié)構(gòu)，如莖、內(nèi)環(huán)、凸起、發(fā)夾、假結(jié)、G-四重結(jié)構(gòu)等。適配子與其靶分子結(jié)合的基礎(chǔ)是構(gòu)象互補性、芳香環(huán)與適配子核堿基的堆積相互作用、帶電基團之間的靜電相互作用、范德華相互作用和氫鍵。

1.2 納米材料

納米技術(shù)已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于不同領(lǐng)域，包括體內(nèi)藥物傳輸和納米尺度的醫(yī)療保健。納米技術(shù)推動了納米醫(yī)學的產(chǎn)生和發(fā)展，升級或改變了在人體細胞水平上的疾病防治［8］。納米材料可有不同的結(jié)構(gòu)，包括納米粒子（nano particles，NPs）、納米管、納米纖維、納米棒和薄膜。這些納米材料在生物傳感器的應(yīng)用已有不少探索研究，并不斷被創(chuàng)新［9］。

2 基于納米材料的適配子傳感器

2.1 適配子與生物傳感器

生物傳感器是適配子用于靶分子檢測的一種重要方式。生物傳感器一般由3部分組成：生物感受器、換能器和信號讀出系統(tǒng)。生物感受器為生物分子，如酶、抗體和寡核苷酸，可以特異性識別感興趣的分析物，具有高親和力和特異性［10］。生物分子-分析物結(jié)合后產(chǎn)生能量變化，通過換能器轉(zhuǎn)換為可測量的信號，如光學變化、電化學變化或電流變化。與抗體、酶等天然生物感受器相比，適配子具有獨特優(yōu)點，包括核酸的固有特性、結(jié)構(gòu)的高度靈活性和結(jié)構(gòu)設(shè)計的方便性。

在生物檢測領(lǐng)域，基于色譜和質(zhì)譜的方法可以實現(xiàn)準確定量檢測，但需要復(fù)雜、昂貴的儀器設(shè)備和訓練有素的技術(shù)人員。而生物傳感器已經(jīng)成為簡單和便攜式檢測的重要選擇，包括現(xiàn)場藥物檢測、血糖測試和生物標志物篩檢等。生物傳感器的廣泛應(yīng)用，也與它們的高敏感性和特異性、易于使用、成本效益好和周轉(zhuǎn)時間快有關(guān)。

2.2 基于NPs的適配子傳感器

2.2.1 AuNPs適配子傳感器

AuNPs因其物理和化學特性而被認為是構(gòu)建生物傳感器最受歡迎的納米材料。近年來，不少文獻報道了基于AuNPs的適配子傳感器的構(gòu)建及其檢測應(yīng)用，其中，AuNPs根據(jù)其作用不同而扮演不同角色。Shui B 等人［11］制作了一種新型適配子傳感器，可以高靈敏度檢測在阿爾茲海默癥發(fā)病中起重要作用的tau 蛋白，他們采用tau-381 蛋白抗體和特異性適配子作為識別元件，半胱胺穩(wěn)定的AuNPs 進行信號擴增，建立了檢測tau-381 蛋白的適配子-抗體夾心檢測方法，其tau-381 蛋白檢出限為0.42 pmol／L，并通過檢測阿爾茲海默癥患者血清中的tau-381，驗證了該方法的可行性和可靠性。

AuNPs適配子傳感器具有良好的檢測敏感性，具有很低的檢測極限（limit of detection，LOD）。新冠肺炎病毒的刺突蛋白與其致病機制密切有關(guān)。Pramanik A 等人［12］將刺突蛋白特異性適配子附著于金納米星，可通過基于距離的納米粒表面能量轉(zhuǎn)移（nanoparticle surface energy transfer，NSET）過程，10 min內(nèi)快速檢測刺突重組抗原或病毒本身，從而實現(xiàn)新冠病毒的快速檢測，檢測限為抗原130 fg／mL，病毒8 顆粒／mL。粘蛋白1（mucoprotein，MUC1）過表達是乳腺和上皮性癌的一個重要特征，Pan M 等人［13］通過NPs自組裝制備了金納米膜-陽極氧化鋁（Au-anodic aluminum oxide，AAO）離子通道而獲得最佳的Au-AAO 離子通道層，并在層間聯(lián)結(jié)適配子，可觀察到一個高度可控的離子整流現(xiàn)象，并由此建立了MUC1濃度與整流比（rectifier ratio，RR）的關(guān)系，他們發(fā)現(xiàn)，在MUC1濃度為1～104fg／mL的范圍內(nèi)，誘導(dǎo)修飾的Au-AO離子通道具有良好的線性范圍，LOD低至0.036 4 fg／mL（0.002 5 amol／L），實現(xiàn)了MUC1 的高靈敏度檢測。

2.2.2 AgNPs適配子傳感器

除AuNPs外，AgNPs也在納米材料研究中占據(jù)重要地位。近年來不少文獻報道用AgNPs結(jié)合適配子制作傳感器用于生物檢測。miRNA-155異常表達存在于乳腺癌或肺癌患者的體液中，Miao X 等人［14］將DNA 穩(wěn)定的銀納米簇團（DNA-stabilized Ag nano-clusters，DNA／AgNCs）作為熒光探針，與miRNA-155結(jié)合后帶上負電荷，然后帶正電的AuNPs［（+）AuNPs］通過靜電吸附到AgNCs 而猝滅熒光，從而構(gòu)建了一種檢測高度靈敏的miRNA-155 檢測新方法，得到miRNA-155的檢出限為33.4 fmol／L。Afzalinia A等人［15］以AgNPs作為能量受體構(gòu)建了基于寡核苷酸“三明治型”雜交和熒光共振能量轉(zhuǎn)移（fluorescence resonance energy transfer，F(xiàn)RET）的一種新型、快速、高靈敏度、高選擇性熒光生物傳感器。在最佳條件下，這種熒光生物傳感器可以檢測和確定低至0.04 ×10-9（ng／mL）或5.5 fmol／L的miRNA-155。

三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）是一種在活細胞中儲存和釋放能量的高能量磷酸鹽化合物，在許多生理過程中具有不可替代的作用。Xu Y 等人［16］設(shè)計了一種基于ATP 適配子的DNA-AgNC＠二硫化鉬（MoS2）的復(fù)合納米探針，通過熒光光譜（inductively coupled plasma mass spectrometry，ICP-MS）實現(xiàn)HeLa細胞內(nèi)ATP的原位熒光成像和定量分析，其結(jié)果與ATP 檢測試劑盒的檢測結(jié)果（（24.6 ±1.7）nmol／L vs.（20.4 ±0.8）nmol／L）相似。該方法可通過熒光成像和ICP-MS檢測細胞內(nèi)ATP來評估代謝水平，可以彌補以往成像檢測方法無法提供定量結(jié)果和ICP-MS生物分析無法提供實時、直觀的圖像信息的缺陷。

2.2.3 AuNPs和AgNPs適配子傳感器

AuNPs和AgNPs 也常一起用于制備傳感器，尤其在基于表面增強拉曼散射（surface enhanced Raman scattering，SERS）技術(shù)的生物傳感器。Li N 等人［17］制備了一種適配子傳感器，在AuNPs 上鍍上一層AgNPs 用于增強SERS 信號，可靈敏地檢測血清中的MUC1，檢測極限達到0.1 U／mL。核蛋白（nuclein，NCL）是一種在多數(shù)腫瘤細胞中過表達的多功能蛋白，由于高水平的亞細胞基質(zhì)效應(yīng)，現(xiàn)有方法識別核蛋白的特異性有限。Hanif S 等人［18］研制了一種新的技術(shù)，利用適配子功能化的金包覆NPs捕捉NCL，以適配子互補DNA鏈修飾AgNPs作為拉曼報告分子產(chǎn)生SERS信號，前者捕獲NCL 后，后者的SERS 信號消失，在MCF7A、HeLa、MCF-10A等多種細胞中成功實現(xiàn)了NCL的亞細胞定位和空間分布分析。

2.2.4 碳NPs適配子傳感器

碳納米材料是重要的無機納米材料之一。在傳感器制作中，使用的碳納米材料主要有碳點（carbon dots，CDs）、碳納米管和石墨電極等。近年來，CDs 作為一種新型熒光納米材料，因其優(yōu)異的光穩(wěn)定性、易修飾性、穩(wěn)定的化學性質(zhì)、良好的生物相容性和優(yōu)異的水溶性等特性而受到廣泛關(guān)注［19，20］。結(jié)腸癌激酶-7（PTK-7），是一種膜受體，可調(diào)節(jié)Wnt信號通路［21］，在肺癌、胃癌、卵巢癌、結(jié)腸癌等多種腫瘤中均有過表達，檢測外周血中PTK-7 是早期診斷的新途徑［22］。由于外周血中PTK-7濃度較低，需要高靈敏度和高選擇性生物傳感器才能檢測。然而，盡管熒光材料具有優(yōu)異的光學性能，但由于缺乏良好的選擇性，PTK-7 傳感器在開發(fā)的過程中受到一些限制。Ma Y等人［23］研制了一種基于多CDs和適配子的信號放大熒光探針，他們選擇PTK-7適配子修飾的y-CDs和b-CDs的熒光分別作為檢測信號和內(nèi)標記，用不含PTK-7 的Fe3O4和適配子互補序列化合物淬滅y-CDs的熒光，加入PTK-7 后熒光恢復(fù)，然后用DNase I消化游離適配子，再擴增檢測信號，從而更加靈敏地檢測PTK-7，其LOD低至0.016 ng／mL。

碳納米管是一種由碳原子Sp 雜化形成的石墨烯片層構(gòu)成的無縫、中空管體，根據(jù)層數(shù)不同，可分為單壁碳納米管、雙壁碳納米管和多壁碳納米管。碳納米管因具有獨特的機械性、良好的電導(dǎo)率和熱導(dǎo)率、表面可修飾性強等優(yōu)點，使其成為熱門的非金屬無機納米材料?；谶@些優(yōu)點，Beqa L等人［24］利用金納米爆米花附著與適配子結(jié)合的單壁碳納米管設(shè)計新型雜化納米材料，用于定向診斷和選擇性光熱治療乳腺癌，對SK-BR-3 乳腺癌細胞的檢測能力高達10個／mL，并且在785 nm和1.5 W／cm2功率的激光照射下能有效地殺滅癌細胞。Kivrak E等人［25］則利用納米纖維修飾一次性鉛筆石墨電極（pencil graphite electrodes，PGEs），提出了一種基于敏感電化學適配子的生物傳感策略用于人類非小細胞肺癌的檢測，檢測限為1.2 ×103cells／mL。

2.2.5 基于NPs的電化學適配子傳感器

電化學傳感器因其易于制作、成本效益高和容易使用，也常用于生物傳感器檢測腫瘤標志物的研究［26，27］。電化學生物傳感器通過被分析物結(jié)合到電極表面發(fā)生電容性變化或發(fā)生氧化和還原反應(yīng)產(chǎn)生電流或電位響應(yīng)而達到檢測目的。靈敏、準確檢測心肌肌鈣蛋白I（cTnI）對心肌梗死的診斷至關(guān)重要。Sun D 等人［28］基于DNA 納米四面體（nano tetrahedron，NTH）捕獲探針和多功能雜交納米探針，設(shè)計了一種用于cTnI檢測的雙適配子電化學生物傳感器，他們把cTnI適配子Tro 4探針固定在金電極表面用于捕獲cTnI，再以磁性Fe3O4納米顆粒負載cTnI適配子Tro 6 及信號放大系統(tǒng)，獲得了良好的分析性能，該傳感器的cTnI 的檢測范圍達0.01～100 ng／mL，檢出下限低至7.5 pg／mL。

2.2.6 基于納米材料的熒光適配子傳感器

1996年，Davis K A等人首次報道到了基于熒光標記適配子的生物傳感器［29］。與其他生物傳感器相比，熒光傳感器具有靈敏度高、操作簡便、響應(yīng)快、不破壞樣品或?qū)毎麚p傷小、能提供實時信息等優(yōu)點，因而受到廣泛關(guān)注。在熒光適配子傳感器中，熒光標記的適配子作為識別元件，將熒光信號與傳導(dǎo)和分析裝置耦合，熒光信號“開”或“關(guān)”均可指示適配子與其靶標的結(jié)合，并定量檢測靶標濃度。

外泌體是細胞來源的納米級（30～150 nm）膜囊泡，在細胞間通信中發(fā)揮關(guān)鍵作用。由于外泌體廣泛存在于體液中，并與疾病發(fā)展密切相關(guān)，其作為診斷性生物標志物的價值越來越被重視。然而，由于目前難以同時鑒定和測量這些納米大小的囊泡，外泌體的準確定量仍然具有挑戰(zhàn)性。Wu M 等人［30］基于磁性和熒光生物探針（magnetic fluorescent bioprobes，MFBPs）開發(fā)了一種新型的熒光適配子傳感器，可一步敏感性定量檢測唾液外泌體。他們在MFBPs中，將標有大量量子點（quantum dots，QDs）的自組裝DNA串聯(lián)體連結(jié)到適配子上，后者被錨定在磁性微球（magnetic microspheres，MMs）表面，在適配子識別和捕獲外泌體時，將同時觸發(fā)作為檢測信號載體的DNA串聯(lián)體釋放，從而產(chǎn)生“一個外泌體-多個QDs”擴增效應(yīng)，可以一步定量檢測，且具有時間短、靈敏度高、檢測限低等特點。而Zhu N 等人［31］設(shè)計了一種FRET磁性適配子傳感器，利用適配子磁性富集外泌體，利用點亮的FRET 策略實現(xiàn)檢測。他們將熒光QDs和適配子引入磁性NPs，當適配子與AuNPs 表面的互補DNA序列結(jié)合時，熒光強度降低，而外泌體與互補DNA序列競爭性結(jié)合適配子時，AuNPs 的熒光強度增強，QDs熒光強度可在外泌體濃度大范圍內(nèi)（5 ×102～5 ×109個顆粒／mL）呈濃度依賴性地線性增加。

Pei X等人［32］提出了一種競爭性的適配子傳感器策略，通過熒光NPs（fluorescent NPs，F(xiàn)NPs）計數(shù)來超靈敏多重檢測CEA等多種癌癥生物標志物，只要一個靶標與一個適配子分子結(jié)合，信號傳遞的FNPs 就會形成一個“三明治”結(jié)構(gòu)的納米復(fù)合材料，可在熒光顯微鏡下進行觀察和計數(shù)，這種策略適用于單路和多路檢測，檢測下限比傳統(tǒng)方法提高了約1 000倍。

3 納米材料在其他適配子檢測中的應(yīng)用

適配子生物傳感也可用于癌細胞的檢測［33］。Norouzi A等人［34］制作了一種新型檢測癌細胞的功能DNA 納米組裝體，由一個DNA串聯(lián)體與大量的粘端三向連接體自組裝而成。當一個適配子引導(dǎo)納米組件到目標癌細胞時，嵌入納米組件中的模擬過氧化物酶產(chǎn)生比色信號，顏色變化可以通過肉眼清晰地辨別出來。

檢測循環(huán)腫瘤細胞（circulating tumor cell，CTC）在癌癥診斷中具有重要作用，但由于CTC 在大量血液細胞中豐度極低，其檢測并不容易［35］。檢測CTC，首先是富集，然后再進行免疫表型分析。靶抗原是細胞識別所必需的，然而，并不是所有的癌細胞都能表達靶抗原，導(dǎo)致檢測困難和可能的假陰性結(jié)果。Ho L C等人［36］基于細胞內(nèi)“開啟”的逆轉(zhuǎn)自猝滅熒光方法，將含有羅丹明6G（Rhodamine 6G，R6G）的1，3-苯二胺樹脂（1，3-phenylenediamine resin，DAR）NPs 與適配子SGC8C 結(jié)合制備成SGC8C-R6GDARNPs，將含有羅丹明101（R101）的1，3-苯二胺樹脂NPs與適配子TD05 結(jié)合制備成TD05-R101DARNPs，兩者分別識別CCRF-CEM和Ramos細胞。由于自猝滅，2個適配子的DARNPs的熒光強度都很弱，但它們在細胞內(nèi)由于釋放熒光團，熒光強度增加，從而實現(xiàn)循環(huán)腫瘤細胞的檢測。SGC8C-R6GDARNPs和TD05-R101DARNPs可分別檢測識別低至每毫升中44個CCRF-CEM和79 個Ramos 細胞。這種通過回火自淬NPs的方法具有穩(wěn)定、靈敏、特異和低成本等優(yōu)點。

4 結(jié)束語

近年來，納米技術(shù)在適配子檢測應(yīng)用中進展迅速，尤其在生物分析領(lǐng)域中表現(xiàn)出了巨大的優(yōu)勢和潛力。但基于納米材料的適配子檢測技術(shù)商業(yè)化并不如意，還面臨著一些問題。首先，大多數(shù)納米材料與適配子的結(jié)合是用作生物傳感器，而生物傳感器的制作難度、技術(shù)水平仍是需要克服的一大難題。其次，對于現(xiàn)實應(yīng)用，必須以用戶在市場上需要檢測的分析物為目標，而許多生物傳感器的應(yīng)用僅限于實驗階段。如何將這些傳感器投入現(xiàn)實使用，以及如何在真實世界達到實用的效果，需要再進行更加深入的研究。