淋巴增強子結(jié)合因子1在腎間質(zhì)纖維化中的作用及機制

張 蒙 王惠明

腎間質(zhì)纖維化是多種慢性腎臟病的最終共同病理特征,給全球公共衛(wèi)生帶來了巨大負擔,其發(fā)病機制涉及到炎癥、自噬、氧化應(yīng)激、細胞凋亡、能量代謝紊亂、上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)等多種過程[1～3]。淋巴增強子結(jié)合因子1(lymphoid enhancer binding factor 1, LEF1)是T細胞因子/LEF1家族的成員之一,是Wnt/β-catenin信號通路的重要下游介質(zhì),可以作為轉(zhuǎn)錄因子與特定的DNA序列(Wnt響應(yīng)元件)結(jié)合而發(fā)揮調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄的作用[4]。有研究表明,LEF1可以通過EMT、細胞周期阻滯和凋亡等途徑促進食管癌、結(jié)腸癌、膀胱癌等多種腫瘤的惡性進展,但LEF1在腎間質(zhì)纖維化中是否發(fā)揮作用及其具體機制尚不明確[5～7]。本研究通過建立腎間質(zhì)纖維化的體內(nèi)和體外模型,探討LEF1在腎間質(zhì)纖維化中的作用及機制,為腎間質(zhì)纖維化的治療提供新的思路和靶點。

材料與方法

1. 動物模型構(gòu)建及分組:飼養(yǎng)于武漢大學人民醫(yī)院動物實驗中心的6～8周齡野生型無特定病原體(specific pathogen free,SPF)級雄性C57BL/6小鼠18只,體質(zhì)量為20±2g,購自鼠來寶(武漢)生物科技有限公司,許可證號:SYCK(京)2019-0013。采用完全隨機設(shè)計將18只小鼠隨機分為假手術(shù)組、單側(cè)輸尿管梗阻(unilateral ureteral obstruction, UUO)3天組和UUO 7天組,每組各6只。UUO模型組用4%水合氯醛腹腔注射麻醉小鼠,取左側(cè)腹部切口,找到并游離左側(cè)輸尿管,于近腎盂處結(jié)扎離斷左側(cè)輸尿管,隨后將臟器復(fù)位后逐層縫合腹壁。假手術(shù)組除不結(jié)扎離斷輸尿管余同UUO組。假手術(shù)組和UUO 3天組于術(shù)后3天處死小鼠,UUO 7天組于術(shù)后7天處死小鼠,留取腎臟。

2.細胞培養(yǎng)及分組:人近端腎小管上皮細胞系(HK-2)購自武漢大學細胞庫,用含10%胎牛血清(美國Gibco公司)和1%青鏈霉素(美國Hyclone公司)的DMEM-F12培養(yǎng)液(美國Hyclone公司)置于37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱(美國Thermo公司)中培養(yǎng)。細胞用含0.5%胎牛血清的DMEM-F12培養(yǎng)液同步化12h后用于實驗。按不同轉(zhuǎn)化生長因子-β1(transforming growth factor-β1, TGF-β1)(美國MCE公司)濃度處理分為3組,即對照組(培養(yǎng)基組)、10ng/ml TGF-β1組、20ng/ml TGF-β1組,刺激時間為24h。按siRNA轉(zhuǎn)染及TGF-β1處理分為4組,即Ctrl siRNA組、LEF1siRNA組、Ctrl siRNA+TGF-β1組和LEF1siRNA+TGF-β1組。

3.Western blot法:收集各組腎組織及各組細胞,用含蛋白酶抑制劑(美國MCE公司)和磷酸酶抑制劑(美國MCE公司)的裂解液(武漢碧云天生物技術(shù)有限公司)裂解,動物組織勻漿(美國Retsch公司),離心取上清,加熱變性。測蛋白濃度后取等量蛋白凝膠電泳,濕轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride,PVDF膜),5%脫脂奶粉室溫封閉1h,一抗4℃孵育過夜,其中一抗分別為LEF1兔單抗(英國Abcam公司)、纖連蛋白(fibronectin,FN)、兔單抗(英國Abcam公司)、α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)兔單抗(武漢賽維爾生物科技有限公司)、Ⅰ型膠原(collagen Ⅰ)兔單抗(武漢賽維爾生物科技有限公司)、E-鈣黏蛋白(E-cadherin)兔單抗(武漢賽維爾生物科技有限公司)、波形蛋白(Vimentin)兔單抗(武漢賽維爾生物科技有限公司)、聚磷酸核糖聚合酶剪切體(cleaved poly ADP-ribose polymerase, cleaved PARP)(武漢愛博泰克生物科技有限公司)、半胱氨酸蛋白酶-3剪切體(cleaved caspase-3)(武漢愛博泰克生物科技有限公司),均為1∶1000稀釋。二抗(武漢安特捷生物技術(shù)有限公司)室溫孵育1h。凝膠成像系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)曝光條帶,以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phophoate dehydrogenase, GAPDH)作為內(nèi)參,以Image J軟件測量并分析條帶灰度。

4.腎組織病理學檢查:取新鮮腎組織固定于4%多聚甲醛中,乙醇脫水,石蠟包埋并切片,蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin,HE)染色及Masson染色,并于顯微鏡(日本Olympus公司)下觀察腎組織病理變化。

5.免疫組化(immunohistochemistry,IHC)法:腎組織石蠟切片常規(guī)梯度脫蠟水化,高溫枸櫞酸鈉抗原修復(fù),3%過氧化氫溶液封閉內(nèi)源性過氧化物酶,牛血清白蛋白室溫下封閉1h,LEF1一抗4℃過夜,二抗37℃孵育1h。滴加3,3′-二氨基聯(lián)苯胺(3,3′-Diaminobenzidine,DAB)顯色,顯微鏡下觀察,蘇木精復(fù)染,脫水透明封片。

6.siRNA轉(zhuǎn)染:待細胞長至60%～70%后,分別將ctrl siRNA(武漢生工生物工程股份有限公司)、LEF1siRNA(武漢生工生物工程股份有限公司)、Lipofectamine RNA iMAX(美國Invitrogen公司)加入無血清培養(yǎng)液中室溫靜置5min后,將RNA iMAX稀釋液以體積1∶1分別加入ctrl siRNA和LEF1siRNA稀釋液中混勻,室溫孵育15min,隨后將混合液加入細胞培養(yǎng)基中。37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)12h,更換完全培養(yǎng)基并加入10ng/ml TGF-β1,處理24h后收集細胞。

7.流式細胞術(shù):將上述分組細胞消化離心后磷酸鹽緩沖液洗滌2次,用加入了Annexin V-PE和7-AAD(美國BD公司)的Binding Buffer重懸混勻,室溫避光孵育15min后于流式細胞儀(美國Beckman Coulter公司)上機檢測。

結(jié) 果

1.腎組織病理改變:HE染色結(jié)果顯示,與假手術(shù)組比較,UUO后腎間質(zhì)炎性細胞浸潤,部分小管擴張,且UUO 7天組比UUO 3天組改變更明顯(圖1)。Masson染色結(jié)果顯示,隨UUO時間的延長,膠原沉積逐漸增加(圖1)。小鼠腎間質(zhì)纖維化模型構(gòu)建成功。

圖1 小鼠腎間質(zhì)纖維化模型的建立(×400)

2.小鼠腎間質(zhì)纖維化后LEF1表達改變:Western blot法及IHC法檢測結(jié)果顯示,與假手術(shù)組比較,UUO 3天組及UUO 7天組LEF1的表達均升高,且主要表達于腎小管上皮細胞的細胞核中(P<0.05),詳見圖2。

圖2 UUO后腎組織中的LEF1表達升高A.免疫組化染色結(jié)果(×400);B.Western blot法檢測結(jié)果。與假手術(shù)組比較,*P<0.05

3.TGF-β1處理HK-2細胞后對LEF1的影響:用10ng/ml和20ng/ml TGF-β1處理HK-2細胞構(gòu)建腎小管上皮細胞的纖維化反應(yīng)模型,FN的表達水平逐漸增高,表明纖維化反應(yīng)逐漸加重,同時LEF1的蛋白表達與對照組比較也呈升高趨勢(P<0.05),詳見圖3。

圖3 用TGF-β1處理的HK-2細胞中LEF1的蛋白表達水平升高與對照組比較,*P<0.05

4.LEF1敲低對HK-2細胞纖維化反應(yīng)的影響:Western blot法檢測結(jié)果顯示,與Ctrl siRNA組比較,LEF1siRNA組LEF1的蛋白表達明顯降低(P<0.05),詳見圖4。與Ctrl siRNA組比較,Ctrl siRNA+TGF-β1組的纖維化反應(yīng)標志物FN、collagen Ⅰ、α-SMA的表達明顯升高。而與Ctrl siRNA+TGF-β1組比較,LEF1siRNA+TGF-β1組的纖維化反應(yīng)標志物表達水平相對減少,纖維化反應(yīng)減輕(P<0.05),詳見圖4。

圖4 LEF1敲低可減輕HK-2細胞的纖維化反應(yīng)與Ctrl siRNA組比較,*P<0.05;與Ctrl siRNA+TGF-β1組比較,#P<0.05

5.LEF1敲低對HK-2細胞EMT的影響:EMT是腎間質(zhì)纖維化的重要機制之一,為了探究LEF1敲低減輕腎小管上皮細胞纖維化反應(yīng)的機制,本研究進一步檢測了敲低LEF1后HK-2的EMT指標。與Ctrl siRNA組比較,Ctrl siRNA+TGF-β1組發(fā)生了EMT,表現(xiàn)為上皮細胞標志物E-cadherin表達下降及間充質(zhì)細胞標志物Vimentin表達上調(diào)(P<0.05)。而轉(zhuǎn)染LEF1siRNA后可以明顯抑制TGF-β1誘導(dǎo)的EMT,詳見圖5。

圖5 LEF1敲低可抑制HK-2細胞的EMT與Ctrl siRNA組比較,*P<0.05;與Ctrl siRNA+ TGF-β1組比較,#P<0.05

6.LEF1敲低對HK-2細胞凋亡的影響:Western blot法及流式細胞儀檢測各組細胞凋亡結(jié)果情況,結(jié)果顯示,Ctrl siRNA+TGF-β1組比Ctrl siRNA組發(fā)生了更多的凋亡,表現(xiàn)為cleaved PARP及cleaved caspase-3蛋白表達升高和細胞凋亡率的增加,且敲低LEF1可以抑制TGF-β1引起的凋亡(P<0.05),詳見圖6。

圖6 LEF1敲低可減少HK-2細胞的凋亡A.Western blot法檢測結(jié)果;B.流式細胞術(shù)檢測結(jié)果與Ctrl siRNA組比較,*P<0.05;與Ctrl siRNA+ TGF-β1組比較,#P<0.05

討 論

慢性腎臟病是導(dǎo)致全球死亡率的主要原因之一,已經(jīng)嚴重威脅到了人類健康,目前尚沒有特異性的治療方案。腎間質(zhì)纖維化是多種慢性腎臟病發(fā)展至終末期腎病的最終共同途徑,其治療和預(yù)防也是慢性腎臟病治療和預(yù)防的關(guān)鍵[8]。腎間質(zhì)纖維化的發(fā)病機制比較復(fù)雜,涉及炎性反應(yīng)、氧化應(yīng)激、代謝紊亂、自噬、EMT等多種過程[9～11]。其中EMT是指上皮細胞向間充質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化的一系列過程,在此過程中不僅上皮極性遭到破壞,失去正常結(jié)構(gòu),而且極性紊亂的腎小管上皮細胞還可以分泌一些細胞因子誘導(dǎo)炎性反應(yīng)及肌成纖維細胞激活,啟動并促進腎間質(zhì)纖維化的發(fā)生、發(fā)展[12～14]。

LEF1是Wnt信號通路重要的轉(zhuǎn)錄因子之一,雖然已有共識指出Wnt信號通路在腎間質(zhì)纖維化中發(fā)揮作用,但是既往研究主要集中于Wnt信號通路的上游分子,如Wnt和β-catenin,而關(guān)于LEF1在腎間質(zhì)纖維化中的具體作用鮮有報道[15～18]。研究表明,LEF1在食管鱗癌、膀胱癌、前列腺癌等多種腫瘤中通過EMT促進腫瘤的進展[5,7,19,20]。本研究結(jié)果顯示,在小鼠UUO的腎間質(zhì)纖維化模型中,LEF1表達上調(diào),主要為核表達,且與梗阻時間呈正相關(guān),表明LEF1參與了腎間質(zhì)纖維化的進程。

腎間質(zhì)纖維化的發(fā)生、發(fā)展涉及到多種機制,為了明確腎小管細胞表達的LEF1在腎間質(zhì)纖維化中的具體作用及機制,本研究采用體外的細胞模型進行進一步研究。結(jié)果表明,敲低LEF1的表達確實可以減輕腎小管上皮細胞的纖維化反應(yīng),同時,上皮細胞標志物E-cadherin表達也相對升高,間充質(zhì)細胞標志物Vimentin相對下降,EMT進程也被減緩。這表明LEF1能促進TGF-β1誘導(dǎo)的腎小管上皮細胞發(fā)生EMT,這可能是其參與腎間質(zhì)纖維化發(fā)生、發(fā)展的重要機制之一。而LEF1調(diào)控纖維化和EMT的具體分子機制是筆者團隊今后深入研究的重點。

綜上所述,LEF1在體內(nèi)腎間質(zhì)纖維化小鼠模型及體外TGF-β1誘導(dǎo)的腎小管上皮細胞纖維化反應(yīng)模型中均為高表達,其激活可以通過促進腎小管上皮細胞發(fā)生EMT而導(dǎo)致腎間質(zhì)纖維化,降低其表達有可能延緩甚至逆轉(zhuǎn)腎間質(zhì)纖維化,LEF1有望成為慢性腎病新的治療靶點。