BMP-7/Smads信號(hào)通路在膽總管結(jié)扎大鼠肝纖維化組織中的表達(dá)及意義

侯 斐 高惠寬 郭賀冰

肝纖維化是由于各種病因如病毒性肝炎、酒精性肝炎、非酒精性脂肪肝病和自身免疫性疾病等多種慢性病導(dǎo)致持續(xù)性肝損傷,而后機(jī)體對(duì)損傷進(jìn)行修復(fù)的病理過程,其主要特征是以膠原纖維為主的細(xì)胞外間質(zhì)(extracellular matrix, ECM)成分的大量合成與沉積,進(jìn)而導(dǎo)致肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞的破壞及纖維瘢痕形成[1～3]。如果肝纖維化程度逐漸加重,肝小葉和血管將會(huì)重建,會(huì)使肝臟的正常結(jié)構(gòu)遭到嚴(yán)重的破壞,如果長(zhǎng)期損傷因素?zé)o法消除,持續(xù)的纖維化將發(fā)展為肝硬化,可能進(jìn)一步將會(huì)誘發(fā)肝癌[4～7]。近年來研究表明,肝損傷導(dǎo)致的早期肝纖維化過程是可逆的[8, 9]。因此,針對(duì)肝纖維化的研究一直是肝病研究的熱點(diǎn),深入研究肝纖維化發(fā)生、發(fā)展的分子機(jī)制將會(huì)為尋找干預(yù)肝纖維化進(jìn)展和逆轉(zhuǎn)肝纖維化的有效靶點(diǎn)提供可靠的實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。

骨形態(tài)發(fā)生蛋白7(bone morphogenetic protein-7,BMP-7)屬轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(transforming growth factor β,TGF-β)超家族成員,發(fā)揮著保持上皮細(xì)胞表型的作用,在細(xì)胞增殖及成骨細(xì)胞分化的過程中發(fā)揮著重要的作用[10]。研究發(fā)現(xiàn),BMP-7可抑制多種組織纖維化,其機(jī)制可能是通過與其受體形成受體復(fù)合物激活其下游的Smad1/5/8分子發(fā)揮拮抗TGF-β1的促纖維化作用,然而,對(duì)于肝纖維化過程中BMP-7的表達(dá)變化及BMP-7/Smads信號(hào)通路在其中發(fā)揮的作用尚不完全明確[11, 12]。本研究通過膽總管結(jié)扎(bile duct ligation,BDL)方法建立大鼠膽汁淤積肝纖維化模型,觀察BDL肝纖維化組織中BMP-7/Smads信號(hào)通路及其相關(guān)蛋白與肝纖維化進(jìn)程的關(guān)系,為探討肝纖維化發(fā)生機(jī)制及尋找干預(yù)肝纖維化靶點(diǎn)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

材料與方法

1. 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:健康雄性Wistar大鼠50只,無特定病原體(specific pathogen free,SPF)級(jí),體質(zhì)量為180±20g,購自中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,動(dòng)物使用許可證號(hào):SCXK-(軍)2014-0004,適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。實(shí)驗(yàn)過程符合《中華人民共和國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》及倫理要求,通過首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理學(xué)委員會(huì)審核(倫理學(xué)審批號(hào):14-1002)。

2.BDL肝纖維化大鼠模型的建立及取材:術(shù)前禁食12h,1%戊巴比妥鈉(批號(hào):11715;美國(guó)Sigma公司)0.5～0.6ml/100g腹腔注射麻醉。大鼠臍上腹正中切口2.0～2.5cm處打開腹腔,暴露膽總管,分離膽總管,用6-0號(hào)絲線行雙重結(jié)扎并剪斷膽總管,其中假手術(shù)組6只大鼠只剖腹、游離膽總管,不結(jié)扎、不剪斷膽總管。關(guān)閉腹腔及皮膚層。于BDL術(shù)后7、14、28、42天時(shí)分別處死各實(shí)驗(yàn)組大鼠,假手術(shù)組大鼠于42天時(shí)一并處死,各組6只大鼠。心臟取血后立即留取左葉肝組織。所有肝組織均取自大鼠肝左葉的相同部位。

3.蘇木精-伊紅染色(hematoxylin-eosin staining,HE染色)及Masson染色:將肝組織固定于4%多聚甲醛溶液內(nèi),然后脫水進(jìn)行石蠟包埋。石蠟包埋的肝組織分別做4μm連續(xù)切片,進(jìn)行HE及Masson染色,而后光鏡下觀察肝組織形態(tài)結(jié)構(gòu)及肝臟膠原纖維沉積的變化。

4.實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)檢測(cè)肝纖維化相關(guān)指標(biāo)基因mRNA表達(dá)變化:肝組織勻漿,提取總RNA,檢測(cè)純度并定量。將mRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA,而后RT-qPCR進(jìn)行擴(kuò)增。結(jié)果分析采用相對(duì)定量,2-△△CT值方法。引物序列由GenBank獲得,引物設(shè)計(jì)由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。引物序列詳見表1。

表1 PCR引物序列

5.免疫組化染色:取3μm厚肝組織石蠟切片按以下操作過程用鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結(jié)(streptomyces antibiozymeprotein-peroxidase binding,SP)免疫檢測(cè)試劑盒進(jìn)行免疫組化染色。將切片進(jìn)行脫蠟、水化、抗原修復(fù),而后進(jìn)行封閉、一抗孵育、二抗孵育(PV-9001,PV-9002,北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司),用辣根過氧化物酶標(biāo)記好的親和素染色生物素孵育,之后進(jìn)行二氨基聯(lián)苯胺(diaminobenzidine,DAB)顯色及胞核復(fù)染,最后進(jìn)行固定封片,用Leica DM6000B圖像采集系統(tǒng)(德國(guó)徠卡公司)采集圖片。

6.Western blot法檢測(cè)BDL肝纖維化相關(guān)蛋白及BMP-7/Smads信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)水平:將各組肝組織進(jìn)行勻漿處理提取蛋白,用雙吡啶卡賓酸(bicinchoninic acid assay,BCA)蛋白定量試劑盒(BCA1,美國(guó)Sigma公司)檢測(cè)蛋白濃度。取20μg蛋白用8%～12%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離出不同相對(duì)分子質(zhì)量的蛋白。將蛋白電轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯(polyvinylidenefluoride,PVDF)膜上,電流為200mA,根據(jù)蛋白相對(duì)分子質(zhì)量大小轉(zhuǎn)60～120min。室溫下用含5%脫脂牛奶的Tris緩沖液孵育2h,封閉非特異性條帶,洗膜3次后在4℃下用特異性一抗孵育PVDF膜過夜,所用的各種特異性一抗為:collagenⅠ(1∶1000;ab34710)、collagenⅢ(1∶500;ab6310)、TIMP1(1∶500;ab61224)、α-SMA(1∶600;ab5694)、BMP-7(1∶500;ab54904)、p-Smad1/5/8(1∶400;ab13820)、FN(1∶400;ab2413)和GAPDH(1∶2000;ab9485),以上抗體均購自英國(guó)Abcam公司。次日將PVDF膜洗膜3次后用辣根過氧化物酶連接的二抗室溫孵育1～2h,之后再次Tris緩沖液洗膜3次,用增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光液(electrochemiluminescence,ECL)(美國(guó)默克公司)進(jìn)行顯色后用Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)采集圖片,最后用Image Lab軟件進(jìn)行各個(gè)蛋白條帶的灰度分析,以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)為內(nèi)參計(jì)算各個(gè)目標(biāo)蛋白的相對(duì)含量。

結(jié) 果

1.BDL后肝臟的病理學(xué)改變:將各組的肝組織進(jìn)行HE染色,在光鏡下觀察肝組織病理改變(圖1)。假手術(shù)組大鼠可見正常的肝小葉結(jié)構(gòu),肝索呈放射狀排列,可見小葉中央的中央靜脈。BDL 7天組:匯管區(qū)可見中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞等炎性細(xì)胞浸潤(rùn),肝細(xì)胞開始出現(xiàn)變性壞死,多為點(diǎn)狀及灶狀壞死,可見小膽管擴(kuò)張及少許新增生膽管和無管腔的小膽管;BDL 14天組:匯管區(qū)小膽管進(jìn)一步擴(kuò)張,可見膽管增生和纖維細(xì)胞增生,肝細(xì)胞變性壞死的程度加重,嚴(yán)重者可見片狀壞死;BDL 28天組:隨著膽汁淤積的程度加重,膽管增生更為明顯,小膽管樣上皮細(xì)胞增生、擴(kuò)展延伸,向小葉內(nèi)深入,同時(shí)與伴隨出現(xiàn)的膠原纖維、成纖維細(xì)胞和小毛細(xì)血管等形成膜樣間隔,并與臨近增生的間隔相互連接,包繞與分割,出現(xiàn)纖維化;BDL 42天組:隨著時(shí)間的延長(zhǎng),肝纖維化程度逐漸加重。

圖1 大鼠肝組織病理學(xué)改變(HE染色,×100)A.假手術(shù)組;B.BDL 7天組;C.BDL 14天組;D.BDL 28天組;E.BDL 42天組

2.Masson染色結(jié)果:將各組的肝組織進(jìn)行Masson染色,觀察肝組織膠原纖維沉積的變化。假手術(shù)組僅在匯管區(qū)和中央靜脈壁周圍有少量藍(lán)色膠原纖維沉積;BDL 7天組:大鼠肝臟膠原纖維開始增生,主要從匯管區(qū)向外延伸;BDL 14天組:膠原纖維增生逐漸增多,可見較細(xì)的藍(lán)色膠原纖維從匯管區(qū)和中央靜脈壁向外延伸,形成不完全的纖維間隔;BDL 28天及42天組:膠原增生明顯增多,形成粗大的纖維間隔(圖2)。

圖2 大鼠肝組織病理學(xué)改變(Masson染色,×100)A.假手術(shù)組;B.BDL7天組;C.BDL14天組;D.BDL 28天組;E.BDL 42天組

3.BDL大鼠肝組織中FN及α-SMA的基因表達(dá)變化:以假手術(shù)組為對(duì)照組,并將其FN和α-SMA的mRNA的表達(dá)量定為1,由圖3可知,BDL術(shù)后7、14、28、42天的FN mRNA表達(dá)倍數(shù)分別為6.82、3.98、0.72、1.18倍,其中BDL 7天及14天組與假手術(shù)組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,圖3中A);BDL術(shù)后7、14、28、42天的α-SMA的mRNA表達(dá)倍數(shù)分別為39.28、34.66、7.30、26.25倍,與假手術(shù)組比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,圖3中B)。

4.BDL大鼠肝組織中collagen Ⅰ及α-SMA蛋白的定位分布和定量表達(dá):免疫組化染色結(jié)果顯示,假手術(shù)組大鼠肝組織中collagen Ⅰ的陽性染色較少,隨著膽管梗阻時(shí)間的延長(zhǎng),collagen Ⅰ的陽性染色逐漸增多,提示肝纖維化加重,其主要表達(dá)于增生的膽管上皮細(xì)胞、纖維間隔及匯管區(qū),廣泛表達(dá)于細(xì)胞質(zhì),細(xì)胞核內(nèi)也有陽性表達(dá)(圖4)。

圖4 各組大鼠肝組織collagen Ⅰ蛋白的表達(dá)(免疫組化染色,×100)A.假手術(shù)組;B.BDL 7天組;C.BDL 14天組;D.BDL 28天組;E.BDL 42天組

免疫組化染色結(jié)果顯示,假手術(shù)組大鼠肝組織中僅在中央靜脈及小膽管周圍觀察到α-SMA蛋白的陽性表達(dá),而BDL 7天組α-SMA蛋白的陽性染色明顯增多,隨著膽管梗阻時(shí)間的延長(zhǎng),α-SMA蛋白的陽性染色逐漸增多,提示肝星狀細(xì)胞活化程度升高,但BDL 42天組的陽性染色率較BDL 28天組略有減少,此外,α-SMA蛋白主要表達(dá)部位為纖維間隔區(qū)及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)區(qū)(圖5)。

圖5 各組大鼠肝組織α-SMA蛋白的表達(dá)(免疫組化染色,×100)A.假手術(shù)組;B.BDL 7天組;C.BDL 14天組;D.BDL 28天組;E.BDL 42天組

5.BDL大鼠肝組織中FN、collagenⅠ、collagenⅢ、α-SMA及TIMP1蛋白的表達(dá)變化:Western blot法檢測(cè)結(jié)果顯示,隨著膽管梗阻時(shí)間延長(zhǎng),FN、collagen Ⅰ及collagenⅢ的蛋白表達(dá)量逐漸增多,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);α-SMA的蛋白表達(dá)量在BDL 7天組最多,BDL 14天、28天及42天組表達(dá)量逐漸減少,但仍高于假手術(shù)組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。TIMP1蛋白隨著膽汁淤積時(shí)間延長(zhǎng)表達(dá)量逐漸增多,在BDL 28天組中TIMP1蛋白表達(dá)最多,在BDL 42天組中略有下降,但較假手術(shù)組仍呈高水平的表達(dá),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,圖6)。

圖6 各組大鼠肝纖維化相關(guān)蛋白的表達(dá)A.Western blot法檢測(cè)結(jié)果;B.蛋白定量表達(dá)結(jié)果,與假手術(shù)組比較,*P<0.05,**P<0.01

6.BDL大鼠肝組織中BMP-7/Smads信號(hào)通路相關(guān)蛋白的定位及其表達(dá)變化:免疫組化染色結(jié)果顯示,BMP-7蛋白及 p-Smad1/5/8蛋白在大鼠肝組織中均主要表達(dá)于肝細(xì)胞質(zhì)內(nèi),其中假手術(shù)組肝組織中未觀察到明顯的BMP-7陽性染色,但在BDL14天、28天及42天組可以觀察到明顯的BMP-7陽性染色,而且BDL 14天組BMP-7的陽性染色率較高(圖7中A)。p-Smad1/5/8蛋白在假手術(shù)組肝組織中未觀察到明顯的陽性染色,但在BDL14天、28天組可以觀察到明顯的 p-Smad1/5/8陽性染色,而BDL 42天組未見到明顯的陽性染色(圖7中B)。Western blot法檢測(cè)結(jié)果顯示,隨著肝纖維化程度的加重,BMP-7蛋白呈先增多后減少的趨勢(shì),BDL 28天組BMP-7蛋白水平最高,BDL 42天組BMP-7蛋白較之略有減少,但仍高于假手術(shù)組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,圖7中C和D)。p-Smad1/5/8蛋白在BDL 7天組較假手術(shù)組明顯升高,而隨著肝纖維化程度的加重, p-Smad1/5/8蛋白的表達(dá)水平逐漸減少,卻依然高于假手術(shù)組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);此外,在BDL 28天及42天組, p-Smad1/5/8蛋白的表達(dá)水平與BDL 7天組比較呈明顯的下降趨勢(shì),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,圖7中C和E)。

圖7 BDL大鼠肝組織中BMP-7/Smads信號(hào)通路相關(guān)蛋白的定位及其表達(dá)變化A.BMP-7蛋白的表達(dá)(免疫組化染色,×100);B.p-Smad1/5蛋白的表達(dá)(免疫組化染色,×100);C.BMP-7、P-smad1/5蛋白Western blot法檢則結(jié)果;D.BMP-7蛋白定量表達(dá)結(jié)果;E.p-Smad1/5蛋白定量表達(dá)結(jié)果。A.假手術(shù)組;b.BDL 7天組;c.BDL 14天組;d.BDL 28天組;e.BDL 42天組。與假手術(shù)組比較,*P<0.05;與BDL 7天組比較,#P<0.01

討 論

肝纖維化是一種在多種損傷因素的作用下導(dǎo)致肝細(xì)胞受損和免疫細(xì)胞浸潤(rùn),從而激活肝星狀細(xì)胞,使其向產(chǎn)生膠原的肌成纖維細(xì)胞分化產(chǎn)生大量的ECM的病理生理過程[13～15]。在正常的肝組織中,ECM的合成和降解處于一種動(dòng)態(tài)平衡,然而在慢性肝病過程中,這種平衡狀態(tài)將會(huì)被打破,使得肝星狀細(xì)胞持續(xù)激活,ECM成分大量合成與沉積,降解顯著減少,從而使其在肝內(nèi)過度沉積,長(zhǎng)期將會(huì)導(dǎo)致肝臟實(shí)質(zhì)細(xì)胞的破壞及纖維瘢痕形成,如果肝臟損傷因素長(zhǎng)期存在,肝纖維化將發(fā)展為肝硬化[16,17]。

肝星狀細(xì)胞是引起肝纖維化的主要細(xì)胞,靜息狀態(tài)的肝星狀細(xì)胞在各種慢性因素的刺激下大量增殖活化,分化成為具有增殖性、收縮性、成纖維性的肌成纖維細(xì)胞[18]。肌成纖維細(xì)胞是ECM的主要來源,其能夠合成并分泌多種ECM的主要成分,如α-SMA、collagen Ⅰ、collagenⅡ、FN等。此外,激活狀態(tài)下的肝星狀細(xì)胞還能合成基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMP)和TIMP1,這兩者之間的平衡是ECM的沉積或降解的主要影響因素[19]。本研究所構(gòu)建的BDL模型,其原理與膽源性肝硬化的發(fā)病機(jī)制相似,建立人為的肝外膽管梗阻引起梗阻部位以上膽管擴(kuò)張、膽汁淤積、膽管內(nèi)壓力增高,引發(fā)肝內(nèi)膽小管擴(kuò)張破裂。研究發(fā)現(xiàn),對(duì)大鼠進(jìn)行BDL后,其膽總管擴(kuò)張明顯,肝臟表面出現(xiàn)結(jié)節(jié),嚴(yán)重者可出現(xiàn)腹腔積液,組織病理學(xué)觀察顯示其匯管區(qū)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)明顯,膽小管擴(kuò)張及增生明顯,肝細(xì)胞外基質(zhì)增多,隨著膽管梗阻時(shí)間延長(zhǎng),肝組織內(nèi)膠原纖維沉積明顯,形成粗大的纖維間隔,后期可見明顯假小葉。隨后采用分子生物學(xué)方法檢測(cè)了膽汁淤積后的大鼠肝臟內(nèi)α-SMA和FN的基因表達(dá)水平明顯升高,在蛋白水平兩者的表達(dá)亦明顯升高,另外作為ECM主要成分的collagenⅠ、collagenⅢ以及TIMP1表達(dá)量隨著膽汁淤積程度加重其表達(dá)水平明顯升高,以上結(jié)果提示,隨著膽汁淤積程度加重,肝臟內(nèi)肝星狀細(xì)胞明顯激活,ECM產(chǎn)生明顯增多,肝纖維化程度逐漸加重,即說明本研究成功誘導(dǎo)了BDL肝纖維化模型。

TGF-β是公認(rèn)的主要致纖維化因子,可以促進(jìn)上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化,可以激活肝星狀細(xì)胞進(jìn)而促進(jìn)ECM的合成,是加速肝纖維化發(fā)生、發(fā)展的至關(guān)重要因子[20]。TGF-β超家族由TGF-β、BMP-7、激活素、生長(zhǎng)分化因子等成員組成,該家族在纖維化發(fā)生、細(xì)胞增殖及凋亡過程中發(fā)揮著重要作用。BMP-7屬于TGF-β超家族,具有抗纖維化和抗炎作用,其發(fā)揮作用的機(jī)制主要是BMP-7通過結(jié)合BMP受體激活其下游的Smad分子發(fā)揮作用[21]。Smads蛋白家族是BMP-7信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的重要胞質(zhì)遞質(zhì),其中Smad1、Smad5和Smad8是胞內(nèi)介導(dǎo)BMP信號(hào)通路中重要的下游信號(hào)分子,激活的Smad1/5/8分子轉(zhuǎn)化為磷酸化形態(tài)與Smad4形成已聚復(fù)合物,轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核內(nèi)調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄[22]。但是BMP-7/Smads信號(hào)通路在BDL膽汁淤積肝纖維化模型中的表達(dá)變化及其意義尚不十分明確。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),BDL大鼠膽管內(nèi)壓力升高,膽汁淤積,肝纖維化程度逐漸加重,BMP-7蛋白呈先增多后減少的趨勢(shì), p-Smad1/5/8蛋白在肝纖維化的早期明顯增多,但隨著纖維化程度的加重, p-Smad1/5/8蛋白表達(dá)減少卻仍高于假手術(shù)組。分析以上變化的原因可能有以下幾點(diǎn):①BDL因素持續(xù)存在將促進(jìn)大鼠肝臟內(nèi)的TGF-β1對(duì)Smad2和Smad3磷酸化修飾,進(jìn)而激活致纖維化信號(hào)通路發(fā)揮促進(jìn)ECM合成,減少其降解的作用;②BMP-7作為近年來逐漸被認(rèn)知的抗纖維化因子,研究認(rèn)為,BMP-7可通過與其受體形成受體復(fù)合物,促進(jìn)Smad1/5/8的磷酸化,其可阻止Smad3與進(jìn)行特定的DNA結(jié)合,阻止其募集協(xié)同因子,達(dá)到抑制TGF-β1通路的致纖維化目的[23];③機(jī)體作為一個(gè)整體,面對(duì)外在的致病因素,可以啟動(dòng)自身調(diào)節(jié)機(jī)制以對(duì)抗外源性損傷因素,在膽汁淤積誘導(dǎo)纖維化激活TGF-β1通路之后,作為機(jī)體的一種保護(hù)性反應(yīng),BMP-7信號(hào)通路隨即被迅速激活發(fā)揮其抑制作用。故在膽汁淤積導(dǎo)致的肝纖維化早期,BMP-7及 p-Smad1/5/8的表達(dá)明顯增多,但是隨著時(shí)間的延長(zhǎng),膽汁淤積誘導(dǎo)的肝纖維化程度也越來越重,肝纖維化過程慢慢失控,BMP-7及 p-Smad1/5/8的表達(dá)逐漸減少,即提示BMP-7/Smads信號(hào)通路的作用也逐漸被削弱,因此,BMP-7/Smads信號(hào)通路在膽汁淤積肝纖維化的過程中呈現(xiàn)早期顯著激活,后期逐漸減弱的趨勢(shì)。目前大量的研究證實(shí),BMP-7/Smads信號(hào)通路可以通過拮抗TGF-β1的作用來發(fā)揮抑制纖維化作用,但BMP-7/Smads信號(hào)通路在膽汁淤積肝纖維化過程中的抗纖維化具體分子機(jī)制尚需開展深入研究。

綜上所述,本研究證實(shí)了在膽汁淤積肝纖維化模型中BMP-7/Smads信號(hào)通路早期顯著被激活,作為一種保護(hù)性措施發(fā)揮內(nèi)源性保護(hù)作用,但隨著膽汁淤積程度加重,這一作用逐漸減弱。