二肽類雙酰胺導向農(nóng)藥的合成與韌皮部輸導性探索

吳必俊，孫兵，王振鋒

(江蘇揚農(nóng)化工股份有限公司，江蘇 揚州 225000)

0 引言

傳統(tǒng)的雙酰胺類農(nóng)藥表現(xiàn)出優(yōu)異的殺蟲效果，但缺乏靶向性，有可能殺滅有益的昆蟲。為了研制具有導向殺蟲能力的農(nóng)藥，可通過化學合成形成二肽類雙酰胺農(nóng)藥。此類藥物可在植物的韌皮部實現(xiàn)輸導，能夠提高對刺吸式害蟲的殺滅效果，應用前景廣泛。

1 二肽類雙酰胺導向農(nóng)藥合成路線

1.1 目標合成物

雙酰胺類殺蟲劑在農(nóng)藥市場中占據(jù)著重要地位，目前已經(jīng)上市的產(chǎn)品包括氟苯蟲酰胺、氯蟲苯甲酰胺、環(huán)丙蟲酰胺等，其共同特點為具有“雙酰胺”化學結(jié)構(gòu)。研究過程的目標合成物為二肽類氯蟲苯甲酰胺偶合物，合成基礎為美國杜邦公司開發(fā)的氯蟲苯甲酰胺(化學分子式為C18H14BrCl2N5O2)。此類農(nóng)藥具有較強的滲透性和內(nèi)吸傳導性，藥劑進入植物后，沿著木質(zhì)部傳導至未施藥的其他部位。從殺蟲機理來看，主要作用于昆蟲的魚尼丁受體，使其過度釋放鈣離子，損耗害蟲的肌肉調(diào)節(jié)功能，最終導致其停止取食，直至死亡[1]。

1.2 合成路線

1.2.1 總合成路線

合成路線包括四個核心步驟，每一步的目標合成物分別為2a-b(中間體)、3a-b(中間體)、4a-k(目標化合物)、5a-k(目標化合物)?；瘜W合成的初始物料(以下稱為初始化合物)如圖1 所示，在適宜的條件下，由其中的有機物生成2a-b 中間體。再改變反應條件，依次生成3a-b、4a-k，最后生成二肽類氯蟲苯甲酰胺偶合物5a-k，其化學結(jié)構(gòu)式如圖2 所示。

圖1 合成線路的初始物料

圖2 二肽類氯蟲苯甲酰胺偶合物的化學結(jié)構(gòu)式

1.2.2 各類中間體及目標化合物的合成方法

(1)中間體2a-b 的合成方法

合成2a-b 中間體的化學物料包括甘氨酸甲酯鹽酸鹽(C3H8ClNO2)、三乙胺(C6H15N) 以及二氯甲烷(CH2Cl2), 三種物質(zhì)的用量分別為12 mmol、12 mmol、20 mL。先將反應物料裝入圓底燒瓶，在10～30 ℃環(huán)境下進行攪拌，時間控制為30 min。將10 mmol 的初始化合物溶解在CH2Cl2中，準備完畢后，向其中加入圓底燒瓶中的攪拌物，操作時需采取N2保護措施。以45 ℃的恒定溫度加熱混合后的物質(zhì)，同時穩(wěn)定地攪拌混合物，使其發(fā)生反應，8 h 后會分析薄層的液相色譜特征，確定其完全反應[2]。之后，經(jīng)過冷卻、清水稀釋、萃取、氯化鈉溶液水洗、無水硫酸鎂干燥、濃縮等一系列處理措施，即可得到2a-b 中間體。

(2)中間體3a-b 的合成方法

配置C4H8O(四氫呋喃)溶液，蒸餾水用量為20 mL，C4H8O 的用量為40 mL,輕輕搖晃使其混合均勻，再將5 mmol 的2a-b 中間體加入四氫呋喃溶液中。準備冰浴反應條件，使以上混合物與氫氧化鋰-水合物試劑發(fā)生化學反應，后者的用量為15 mmol，對反應物進行加熱，溫度達到室溫后停止加熱，大約2 h 后反應充分。反應結(jié)束之后，溶液的pH 值較高，向其中加入適量的HCl 溶液，將pH 值降低至2.0，再使用3×20 mL 的C4H8O2溶液進行萃取，以飽和的氯化鈉溶液洗滌萃取操作所得到的有機相，最后經(jīng)過干燥、濃縮、純化得到3a-b 中間體。3a-b 中間體是3a 和3b 的混合物，兩種物質(zhì)的區(qū)別在于化學結(jié)構(gòu)式中可變部分R1所連接的原子。在3a 中，R1為氫基(-H),在3b 中，R1為甲基(-CH3)[3]。

(3)化合物4a-k 的合成方法

取干燥的CH2Cl210 mL，將3a 或者3b 中間體溶解在其中。按照順序向溶液中加入其他反應物，包括14 mmol 的氨基酸甲酯鹽酸鹽、15mmol 的碳二亞胺鹽酸鹽(EDCI)、15 mmol 的N-甲基嗎啉(NMM)，將以上混合物在室溫下攪拌12 h，向其中加入適量的蒸餾水，以檸檬酸(C6H8O7)溶液進行酸化處理。使用3×10 mL 的CH2Cl2萃取酸化后的混合溶液，再利用飽和NaHCO3溶液洗滌萃取得到的有機相，通過干燥、濃縮和純化等后續(xù)操作得到目標產(chǎn)物4a-k。

(4)化合物5a-k 的合成方法

制備四氫呋喃溶液，水的用量為20 mL，四氫呋喃的用量為40 mL，將4a-k 目標化合物加入該溶液中，準備冰浴條件，向混合溶液中加入15 mmol 的氫氧化鋰-水合物，對反應裝置進行加熱，使反應溫度達到室溫，反應時間控制為2 h。待反應完全結(jié)束之后，在混合物中加入適量的HCl 溶液，將pH 值調(diào)節(jié)為2.0。再利用乙酸乙酯萃取反應產(chǎn)物，經(jīng)過NaCl 溶液洗滌、干燥、濃縮以及純化等一系列操作，得到目標產(chǎn)物5a-k。

1.2.3 目標化合物的二肽結(jié)構(gòu)

4a-k 和5a-k 是一系列二肽類氯蟲苯甲酰胺偶合物的總稱，4a、4b、…、4k 用于區(qū)分偶合物，其對應的二肽結(jié)構(gòu)有所差異。與之相同，5a-k 目標化合物包括5a、5b、…、5k 等類型。表1 為各類目標化合物對應二肽結(jié)構(gòu)的統(tǒng)計結(jié)果。

表1 目標化合物對應的二肽類型示例

2 二肽類雙酰胺導向農(nóng)藥的植物韌皮部輸導性評估

2.1 輸導性評估的實驗

2.1.1 實驗植株的處理

為了檢驗二肽類雙酰胺導向農(nóng)藥在植物韌皮部的輸導性，將蓖麻幼苗作為實驗對象，在施用農(nóng)藥之前需對其進行處理，具體方法如下。剝離蓖麻幼苗(培養(yǎng)時間為7 d)的胚乳，僅保留子葉部分，確保子葉未出現(xiàn)破壞。準備MES 瓊脂培養(yǎng)液，將符合要求的蓖麻子葉浸泡在培養(yǎng)液中，培養(yǎng)時間為30 min，再將其轉(zhuǎn)移至含有目標農(nóng)藥的MES 培養(yǎng)液中。

2.1.2 韌皮部汁液的收集方法

施用農(nóng)藥之后，收集一定量的蓖麻幼苗韌皮部汁液，向其中加入適量的CH3CN 溶液，將韌皮部汁液稀釋4 倍，利用液相色譜儀檢測汁液中目標農(nóng)藥的含量。CH3CN 溶液由CH3CN 和H2O 配置而成，兩種物質(zhì)的比例為3∶2。液相色譜分析儀的柱溫控制為30 ℃、檢測波長設置為210 nm[4]。進樣時的流量和流速分別為10 μL、1 mL·min-1。通過計算出峰面積確定二肽類雙酰胺導向農(nóng)藥的含量。

2.1.3 二肽類氯蟲苯甲酰胺偶合物體外殺蟲實驗方法

實驗中的害蟲為小菜蛾幼蟲、甜菜夜蛾幼蟲，分別采用三齡幼蟲和二齡幼蟲。測試的目標二肽類導向農(nóng)藥為氯蟲苯甲酰胺以及合成線路中的4e、5e。實驗植物為莧菜，葉片采用正在生長的新葉。將葉子制備成蝶形，直徑為1.6 cm。將測試用的農(nóng)藥溶解在二甲亞砜中，形成母液，并且要求每升母液中含有10 g 目標農(nóng)藥。使用滴管吸取母液，滴入適量的超純凈水，形成實驗用的藥液。葉蝶的邊緣部位存在切口，將其放置在藥液中，浸泡10 s，取出后自然晾干。將晾干后的葉蝶放置在培養(yǎng)皿中，再向其中加入15 只實驗害蟲。經(jīng)過48 h 后，計算目標害蟲的死亡率。

2.2 數(shù)據(jù)及結(jié)果分析

2.2.1 二肽類氯蟲苯甲酰胺偶合物在蓖麻幼苗韌皮部的輸導性評估

蓖麻幼苗韌皮部能夠產(chǎn)生較多的滲出液，可利用液相色譜儀檢測其滲出液中是否存在二肽類氯蟲苯甲酰胺偶合物，從而判斷輸導性，將氯蟲苯甲酰胺作為對照組，部分實驗數(shù)據(jù)如表2 所示。從中可知，氯蟲苯甲酰胺在蓖麻韌皮部滲出液中的檢出量為0，說明其不具備輸導性。對4a-k、5a-k 的二肽類氯蟲苯甲酰胺偶合物進行實驗，發(fā)現(xiàn)蓖麻滲出液中均能檢測到目標化合物，說明相關化合物在韌皮部存在一定的輸導性。另外，在實驗中發(fā)現(xiàn)，4a～4k 的化合物在植物內(nèi)運輸時會出現(xiàn)水解反應，導致原化合物分解。5a～5k的目標化合物不存在這一情況。

表2 部分二肽類氯蟲苯甲酰胺偶合物在蓖麻韌皮部的輸導性實驗數(shù)據(jù)

2.2.2 二肽類氯蟲苯甲酰胺偶合物殺蟲實驗數(shù)據(jù)及結(jié)果分析

在殺蟲效果實驗中，設置了三組實驗，分別為4e、5e 和氯蟲苯甲酰胺，使用3 種農(nóng)藥分別配置55 mg/L的溶液，按照實驗方案進行操作，得到殺蟲數(shù)據(jù)如表3所示。從中可知，氯蟲苯甲酰胺對兩種害蟲的滅殺效果最強，其次為5e 類合成農(nóng)藥，最差的是4e 類合成農(nóng)藥。4e 類殺蟲效果較差的原因是其在植物組織內(nèi)存在水解效應，破壞了原有的化學結(jié)構(gòu)。

表3 目標化合物殺蟲實驗數(shù)據(jù)

3 結(jié)語

二肽類雙酰胺導向農(nóng)藥具有多種合成路線，不同類型的差異在于偶合體以及二肽的化學結(jié)構(gòu)。根據(jù)合成農(nóng)藥、氯蟲苯甲酰胺在蓖麻韌皮部滲出液中的檢出量，前者可在韌皮部中實現(xiàn)輸導，后者無輸導性。在殺蟲效果方面，二肽類雙酰胺導向農(nóng)藥略遜于氯蟲苯甲酰胺。