兩個(gè)復(fù)合雜合突變導(dǎo)致遺傳性凝血因子V缺陷癥家系的表型與基因突變分析

鄭周，徐琦煜，周星星，王明山，謝耀盛

溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心 浙江省檢驗(yàn)診斷及轉(zhuǎn)化研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 溫州 325015

凝血因子V（coagulation factor V, FV）是一種由肝細(xì)胞和巨核細(xì)胞產(chǎn)生的單鏈糖蛋白，由 2 196個(gè)氨基酸組成。它可被凝血酶和活化的凝血因子X(jué)（active coagulation factor X, FXa）水解，生成活化的凝血因子V（active coagulation factor V, FVa）[1]。FVa在凝血酶原復(fù)合物中作為FXa的膜受體，可以增強(qiáng)FXa的催化活性，促進(jìn)凝血酶原激活[2]。 此外，F(xiàn)V還作為活化蛋白C（activated protein C,APC）的輔助因子具有抗凝作用，可以滅活活化的凝血因子VIII（active coagulation factor VIII,FVIIIa）[3]，但這一功能在FV被激活促凝期間不會(huì)表現(xiàn)出來(lái)[4]。遺傳性FV缺陷癥是一種罕見(jiàn)的常染色體隱性遺傳的出血性疾病，在普通人群中的發(fā)病率為百萬(wàn)分之一[5]，可表現(xiàn)為無(wú)癥狀或鼻衄、口腔黏膜出血、月經(jīng)量過(guò)多以及手術(shù)后異常出血等。根據(jù)FV活性（FV activity, FV:C）和FV抗原（FV antigen,FV:Ag）降低的程度，遺傳性FV缺陷癥分為I型數(shù)量缺陷型（FV:C和FV:Ag均降低）和II型質(zhì)量缺陷型（FV:C降低但FV:Ag正常）兩種類(lèi)型[6]。筆者報(bào)道兩例遺傳性FV缺陷癥家系，分析各成員臨床表型和基因型，結(jié)合生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)結(jié)果，初步探討該兩個(gè)家系可能的分子致病機(jī)制。

1 對(duì)象和方法

1.1 對(duì)象 先證者A，男，52歲，因“發(fā)現(xiàn)肺結(jié)節(jié)4 個(gè)月”至溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院準(zhǔn)備手術(shù)治療。術(shù)前常規(guī)出凝血檢測(cè)發(fā)現(xiàn)其凝血酶原時(shí)間（prothrombin time, PT）和活化部分凝血活酶時(shí)間（activated partial thromboplastin time, APTT）延長(zhǎng)。進(jìn)一步的凝血因子活性檢測(cè)發(fā)現(xiàn)其FV:C和FV:Ag均降低，其他凝血指標(biāo)無(wú)明顯異常。將先證者及家系其他成員共3代10人納入調(diào)查，發(fā)現(xiàn)其妹妹在分娩期間曾出現(xiàn)過(guò)異常出血，其余家系成員目前均無(wú)相關(guān)臨床癥狀，家系圖譜見(jiàn)圖1。

圖1 遺傳性FV缺陷癥家系圖（家系A(chǔ)）

圖2 遺傳性FV缺陷癥家系圖（家系B）

為建立相關(guān)凝血指標(biāo)的實(shí)驗(yàn)室參考范圍，招募篩選100名健康體檢者為正常對(duì)照組。男58名，女42名，平均年齡（35±12）歲，均無(wú)糖尿病及心血管疾病，無(wú)肝腎疾病，無(wú)出血或血栓性疾病病史。本研究獲得溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（倫理批準(zhǔn)號(hào)：2016-192），研究對(duì)象均知情同意。

1.2 方法

1.2.1 樣本采集：外周血樣本采集自?xún)擅茸C者及其家系成員，采集于2.7 mL的枸櫞酸鈉（濃度為109 mmol/L）抗凝劑管，4 ℃ 2 100×g離心10 min， 制備上清乏血小板血漿和下層血細(xì)胞。血漿用于檢測(cè)凝血指標(biāo)，下層血細(xì)胞用于DNA基因組提取。

1.2.2 血漿凝血指標(biāo)測(cè)定：采用一期凝固法測(cè)定PT、APTT、FV:C、凝血因子II活性（coagulation factor II activity, FII:C）、凝血因子VII活性 （coagulation factor VII activity, FVII:C）和凝血因子X(jué)活性（coagulation factor X activity,FX:C），測(cè)定儀器為STA-R-Max血凝分析儀（法國(guó)Stago公司），采用Stago公司原裝試劑。FV:Ag使用ELISA試劑盒（美國(guó)Cedarlane Laboratories公司）并嚴(yán)格按試劑說(shuō)明書(shū)測(cè)得。

1.2.3F5基因分析：所有家系成員的基因組DNA均使用DNA血液提取試劑盒[天根生化科技（北京）有限公司]從外周血細(xì)胞中提取。參照文獻(xiàn)[5]設(shè)計(jì)引物序列和PCR反應(yīng)條件，通過(guò)PCR擴(kuò)增先證者F5基因的所有外顯子及其側(cè)翼序列。PCR產(chǎn)物經(jīng)過(guò)提純后由上海陽(yáng)光生物技術(shù)股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。在確定相關(guān)突變位點(diǎn)后，擴(kuò)增其所有家庭成員F5基因的相關(guān)外顯子以確認(rèn)是否攜帶同樣的突變。

1.2.4 比對(duì)分析：使用多序列比對(duì)軟件ClustalX-2.1-win，分別以多種比對(duì)模式分析FV 蛋白中Ser111 的保守性。共研究了9 個(gè)同源物種：人類(lèi)（NP_000121.2）、小鼠（NP_032002.1）、大鼠 （NP_001041343.1）、黑猩猩（XP_513984.4）、長(zhǎng)尾猴（XP_001093072.2）、家犬（XP_005622605.1）、黃牛（NP_776304.1）、雞（XP_001231901.3）和斑馬魚(yú)（NP_001007209.2）。同源序列比對(duì)完成后，再進(jìn)行保守性分析。

1.2.5 生物信息學(xué)分析：通過(guò)4 種在線(xiàn)生物信息軟件PolyPhen-2（http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2/index.shtml）、PROVEAN（https://www.jcvi.org/research/provean）、Mutation Taster（https://www.mutationtaster.org/）和SIFT（http://sift.jcvi.org）來(lái)預(yù)測(cè)p.Ser111Ile突變對(duì)蛋白質(zhì)功能的影響。根據(jù)UniProt（https://www.uniprot.org/）中已知的FV蛋白結(jié)構(gòu)（AF-P12259-F1），使用PyMOL軟件分析了突變前后FV蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)的差異。整個(gè)蛋白質(zhì)模型以卡通模式展示，突變位點(diǎn)氨基酸及與它們相互作用的氨基酸則以不同顏色的棒狀分子表示。

1.2.6 凝血酶生成實(shí)驗(yàn)：參照文獻(xiàn)[7]，使用經(jīng)校準(zhǔn)的自動(dòng)凝血酶生成實(shí)驗(yàn)來(lái)檢測(cè)凝血酶的生成。按照荷蘭Thrombinoscope BV公司提供的操作流程，使用美國(guó)Fluoroskan Ascent FL熒光讀數(shù)儀測(cè)定滯后時(shí)間、峰高、峰值時(shí)間和內(nèi)源性凝血酶潛能來(lái)評(píng)估FV的促凝活性，采用的試劑為FluoCa試劑盒和PPP試劑盒（法國(guó)Stago公司），使用的PPP試劑為中等組織因子濃度。

文學(xué)翻譯領(lǐng)域，學(xué)界圍繞“何為翻譯”、“如何翻譯”等問(wèn)題展開(kāi)了長(zhǎng)久探討。嚴(yán)復(fù)曾提出“譯事三難”：信、達(dá)、雅，對(duì)譯者之為譯者所應(yīng)具備的基本素養(yǎng)及翻譯倫理進(jìn)行了細(xì)致探討；奈達(dá)曾主張“形式對(duì)等”、“功能對(duì)等”，就翻譯實(shí)踐中貼近源語(yǔ)還是貼近譯入語(yǔ)問(wèn)題進(jìn)行了探討。

2 結(jié)果

2.1 表型檢測(cè)結(jié)果 先證者A的APTT和PT均延長(zhǎng)，其FV:C和FV:Ag均降低（分別為13%和20%），其父親、母親、妹妹、兒子和女兒的FV:C和FV:Ag也有所降低。先證者B的APTT和PT也均延長(zhǎng)，其FV:C和FV:Ag也顯著降低（分別為3%和5%），其父親、母親、兒子和女兒的FV:C和FV:Ag也都有所降低，見(jiàn)表1。

表1 兩個(gè)遺傳性FV缺陷癥家系的表型和基因型檢測(cè)結(jié)果

2.2 基因型檢測(cè)結(jié)果 家系A(chǔ)的基因分析顯示，先證者A第3 外顯子存在c.332G＞T雜合錯(cuò)義突變（p.Ser111Ile）；第25 外顯子存在c.6665A＞G雜合多態(tài)性（p.Asp2222Gly）。查閱gnomAD數(shù)據(jù)庫(kù)未發(fā)現(xiàn)p.Ser111Ile錯(cuò)義突變，排除了多態(tài)性可能，并且在HGMD數(shù)據(jù)庫(kù)和PubMed（https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/）數(shù)據(jù)庫(kù)中也未發(fā)現(xiàn)此錯(cuò)義突變。家系研究表明，先證者的母親、妹妹和兒子均為p.Ser111Ile雜合子，其父親和女兒則是p.Asp2222Gly雜合子。家系其他成員為野生型。見(jiàn)圖3。

圖3 兩個(gè)遺傳性FV缺陷證家系的基因測(cè)序圖

家系B的基因分析顯示，先證者B第3 外顯子存在c.286G＞C雜合錯(cuò)義突變（p.Asp96His）；第13 外顯子存在c.2393-2393delC雜合缺失突變（p.Pro798Leufs*13）。家系研究表明，先證者的父親和女兒均為p.Asp96His雜合子，其母親和兒子則是p.Pro798Leufs*13雜合子，其丈夫?yàn)橐吧停ㄒ?jiàn)圖3）。

根據(jù)A C M G 變異評(píng)級(jí)指南，c.3 3 2 G ＞T（p.Ser111Ile）變異評(píng)級(jí)為意義不明確的（PM2+PP1+ PP3+PP4），具體證據(jù)項(xiàng)如下：①正常人群數(shù)據(jù)庫(kù)中未發(fā)現(xiàn)該變異（PM2）；②在該家系中除了先證者，其母親（I2）、妹妹（II4）及兒子（III2）中也均檢測(cè)到此變異（PP1）；③保守性分析顯示p.Ser111在多種同源物種中高度保守；SIFT、Polyphen-2和 M u t a t i o n T a s t e r 在線(xiàn)生物信息學(xué)軟件對(duì)p.Ser111Ile的預(yù)測(cè)結(jié)果分別為0.001分、0.999分和0.935分，顯示為致病變異（PP3）；④先證者的PT和APTT明顯延長(zhǎng)，F(xiàn)V:C和FV:Ag均明顯降低，家族史也高度符合遺傳性FV缺陷癥（PP4）。

2.3 保守性軟件分析結(jié)果 在完成序列比對(duì)后，對(duì)Ser111進(jìn)行序列保守性分析。使用ClustalX-2.1-win軟件對(duì)九個(gè)物種的同源序列進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)這些物種的Ser111序列高度保守（圖4）。Asp2222的保守性分析顯示也是保守的。

圖4 Ser111序列保守性分析

2.4 生物信息學(xué)軟件分析結(jié)果 通過(guò)在線(xiàn)軟件SIFT、PolyPhen-2、MutationTaster和PROVEAN對(duì)p.Ser111Ile錯(cuò)義突變的致病性進(jìn)行預(yù)測(cè)，預(yù)測(cè)結(jié)果依次為“有害”“可能有害”“致病”和“有害”。p.Pro798Leufs*13和p.Asp2222Gly的致病性分析顯示均為“有害”，與陳元等[7]的研究一致。

通過(guò)PyMOL軟件對(duì)FV的蛋白質(zhì)模型進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)：野生型的Ser111 位于A(yíng)1 區(qū)域，與Tyr66、Gly125、Ser174 和His175 通過(guò)氫鍵相連接。當(dāng)Ser111突變?yōu)镮le111時(shí)，Ile111與Gly125和His175之間的氫鍵消失（圖5）。

圖5 p.Ser111Ile的模型分析

Pro798位于FV蛋白的B區(qū)域，當(dāng)p.Pro798Leufs* 13發(fā)生突變時(shí)，會(huì)導(dǎo)致FV蛋白中的13個(gè)氨基酸發(fā)生移位以及下游Leu1010處氨基酸合成提前終止，最終導(dǎo)致B區(qū)域的一部分以及整個(gè)A3、C1、C2區(qū)域的缺失（圖6）。

圖6 p.Pro798Leufs*13的模型分析

2.5 凝血酶生成實(shí)驗(yàn)結(jié)果 與健康對(duì)照組相比，先證者A和B的凝血酶生成量和峰值均明顯降低，而且達(dá)峰時(shí)間和凝血酶生成時(shí)間均延長(zhǎng)。另外根據(jù)凝血酶生成曲線(xiàn)所示p.Arg2222Gly多態(tài)性與p.Ser111Ile、p.Asp96His和p.Pro798Leufs*13雜合子相比，在凝血酶生成量和峰值方面表現(xiàn)更高（圖7）。

圖7 家系A(chǔ)和B凝血酶生成實(shí)驗(yàn)

3 討論

人類(lèi)凝血因子V基因（F5）位于染色體1q23區(qū)域，由25個(gè)外顯子組成，編碼A1-A2-B-A3-C1-C2不同的結(jié)構(gòu)域。每個(gè)結(jié)構(gòu)域在FV蛋白中具有不同的功能。A1結(jié)構(gòu)域有助于FVa/FXa相互作用和FVa重輕鏈之間的結(jié)合，A2結(jié)構(gòu)域有多個(gè)凝血酶和APC水解作用位點(diǎn)，而C1和C2結(jié)構(gòu)域提供了與磷脂及質(zhì)膜的相互作用平臺(tái)[8-9]。但B結(jié)構(gòu)域在同源物種中變化較大，并在FV活化為FVa的過(guò)程中被除去，后者由兩個(gè)Ca2+和一個(gè)Cu2+的非共價(jià)連接的重鏈（A1-A2結(jié)構(gòu)域）和輕鏈（A3-C1-C2結(jié)構(gòu)域）組成[10]。該排列方式可防止結(jié)構(gòu)域被破壞，并穩(wěn)定A1/A3鏈接處的結(jié)合。

本研究顯示，在家系A(chǔ)中發(fā)現(xiàn)了p.Ser111Ile和p.Asp2222Gly多態(tài)性?xún)煞NF5基因突變，在家系B中發(fā)現(xiàn)了p.Pro798Leufs*13和p.Asp96His兩種F5基因突變。這兩個(gè)家系的四種雜合突變均表現(xiàn)出FV:C和FV:Ag的同步降低，屬于I型FV缺陷癥。凝血酶生成試驗(yàn)表明，F(xiàn)5基因缺陷患者的凝血酶生成數(shù)量均有所下降，其中以先證者A和先證者B的凝血功能下降最為明顯。因此，本研究認(rèn)為這兩個(gè)家系中FV水平的下降與F5基因缺陷有關(guān)。

Ser111位點(diǎn)位于A(yíng)1結(jié)構(gòu)域中，其中所有配體均與Ca2+完全協(xié)同[11]。此外，ADAMS等[11]還認(rèn)為A1結(jié)構(gòu)域中可能存在一個(gè)由Lys121-Asp140組成的環(huán)，其空間構(gòu)象使得A1和A3 結(jié)構(gòu)域之間存在多個(gè)重要相互作用，增加了重鏈和輕鏈結(jié)合的穩(wěn)定性，破壞這個(gè)結(jié)構(gòu)可能會(huì)導(dǎo)致FVa的輕鏈和重鏈分離。保守性分析顯示，Ser111在生物進(jìn)化中高度保守，表明它是凝血因子V蛋白質(zhì)的一個(gè)重要的功能位點(diǎn)。通過(guò)構(gòu)建FV蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)模型，本研究發(fā)現(xiàn)Gly125位于Lys121-Asp140的環(huán)上，并且與Lys121在空間上相鄰。改變Ile111與Gly125之間的氫鍵以及擴(kuò)展的側(cè)鏈可能會(huì)破壞Lys121的空間構(gòu)象，影響環(huán)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，可能會(huì)導(dǎo)致FVa的重鏈和輕鏈分離。有文獻(xiàn)[12]報(bào)道了一個(gè)p.His175Arg變異體，影響了His1845的正常構(gòu)象，導(dǎo)致FV活性降低。His1845是A1和A3結(jié)構(gòu)域之間Cu2+配位的殘基，在FV蛋白質(zhì)中與His175在空間上相近[13]。本研究的p.Ser111Ile突變鮮見(jiàn)報(bào)道，通過(guò)本研究發(fā)現(xiàn)Ile111和His175 之間氫鍵改變可能影響His175空間構(gòu)造的穩(wěn)定性，進(jìn)而影響His1845。因此，這些氫鍵變化可能導(dǎo)致FVa的穩(wěn)定性下降，從而加速FVa的降解，最終導(dǎo)致FV水平下降。

本研究發(fā)現(xiàn)FV的p.Asp2222Gly多態(tài)性與R2單倍型形成有關(guān)[14]。YAMAZAKI等[15]研究認(rèn)為p.Asp2222Gly使得FV蛋白質(zhì)的錯(cuò)誤折疊，進(jìn)而導(dǎo)致蛋白質(zhì)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中滯留，最終在細(xì)胞內(nèi)被降解。值得注意的是，在家系B中發(fā)現(xiàn)的p.Arg96His具有與p.Asp2222Gly多態(tài)性相似的致病機(jī)制。有文獻(xiàn)報(bào) 道[16]認(rèn)為這種突變可能會(huì)改變Arg96與Arg4之間的氫鍵，進(jìn)而導(dǎo)致FV蛋白質(zhì)的錯(cuò)誤折疊并在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中滯留，最終在細(xì)胞內(nèi)被降解。因此，p.Asp2222Gly多態(tài)性和p.Arg96His突變都顯示出FV表達(dá)的不穩(wěn)定和FV蛋白質(zhì)分泌速率降低，這可能是p.Asp2222Gly和p.Arg96His雜合子中FV:Ag降低的原因。本研究的p.Pro798Leufs*13突變最早見(jiàn)于DENG等[7]報(bào)道，認(rèn)為它是一種致病的突變體，可能會(huì)對(duì)FV蛋白質(zhì)的功能和結(jié)構(gòu)造成損害。根據(jù)本研究的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)模型可知，p.Pro798Leufs*13突變可直接導(dǎo)致FV蛋白質(zhì)合成提前終止，形成了截?cái)嗟鞍?。而這種截?cái)嗟鞍讓?duì)生物體是有害的[17]，并且其在細(xì)胞內(nèi)更容易被降解，最終導(dǎo)致FV蛋白質(zhì)分泌減少以及機(jī)體內(nèi)FV水平減低。

綜上所述，本研究中發(fā)現(xiàn)的四種突變p.Ser111Ile和p.Asp2222Gly、p.Arg96His和p.Pro798Leufs*13的復(fù)合雜合突變與兩個(gè)家系的遺傳性FV缺陷癥有關(guān)，并且可能是造成兩個(gè)家系FV水平下降的主要原因。本研究采用生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)突變危害性和建立突變蛋白模型，對(duì)p.Ser111Ile和p.Pro798Leufs*13突變潛在致病機(jī)制進(jìn)行了初步研究，但具體的致病機(jī)制需要通過(guò)體外表達(dá)實(shí)驗(yàn)做進(jìn)一步的探討。