犀角地黃湯治療ITP的療效及其作用機(jī)制

胡哲 胡輝 楊舟 趙早云 王躍

(湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院 1血液腫瘤科,湖南 長(zhǎng)沙 410007;2消毒供應(yīng)室)

原發(fā)免疫性血小板減少癥(ITP)是臨床上常見(jiàn)的血液系統(tǒng)免疫性疾病,主要表現(xiàn)為血小板(PLT)計(jì)數(shù)明顯減少,并伴有皮膚黏膜、內(nèi)臟等出血,嚴(yán)重的損害患者的生命健康〔1〕。目前,臨床上ITP治療多以西藥為主,主要包括激素、血小板生成刺激素、單克隆抗體及免疫抑制劑等,但是上述治療藥物存在不良反應(yīng)多、價(jià)格昂貴等缺點(diǎn)〔2,3〕。中醫(yī)辯證法在治療ITP患者中具有一定優(yōu)勢(shì),能夠明顯改善臨床癥狀,且具有不良反應(yīng)少、療效顯著等優(yōu)點(diǎn),已經(jīng)成為ITP治療藥物選取的新方向〔4〕。犀角地黃湯出自《備急千金要方》,具有增強(qiáng)免疫功能、清心涼血及清熱止血等功效,已在臨床及實(shí)驗(yàn)研究中得到廣泛證實(shí)〔5〕。研究顯示,犀角地黃湯能夠通過(guò)維持ITP大鼠外周血輔助性T細(xì)胞17/調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Th17/Treg)免疫細(xì)胞平衡,調(diào)節(jié)白細(xì)胞介素(IL)-17、IL-35細(xì)胞因子表達(dá),增加PLT計(jì)數(shù),從而達(dá)到改善ITP作用〔6〕。但是,有關(guān)犀角地黃湯通過(guò)何種機(jī)制調(diào)節(jié)Th17/Treg免疫細(xì)胞平衡,并最終參與ITP的分子機(jī)制尚不完全清楚。Toll樣受體(TLR)4/骨髓樣分化因子(MyD88)/核因子(NF)-κB信號(hào)通路參與調(diào)控炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激及細(xì)胞免疫功能等〔7,8〕。研究發(fā)現(xiàn),抑制TLR4/MyD88/NF-κB信號(hào)通路能夠明顯抑制Th17細(xì)胞分化,促進(jìn)Treg細(xì)胞分化,從而改善Th17/Treg細(xì)胞失衡,并最終抑制機(jī)體炎癥反應(yīng)〔9〕。但是,有關(guān)TLR4/MyD88/NF-κB信號(hào)通路介導(dǎo)的Th17/Treg細(xì)胞失衡在ITP中研究尚無(wú)相關(guān)報(bào)道。本研究探究犀角地黃湯對(duì)ITP的療效及其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1動(dòng)物 雄性,SPF級(jí),SD大鼠,周齡6～8 w,體質(zhì)量(200±15)g,購(gòu)于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司〔生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(滬)2020-0008〕,實(shí)驗(yàn)大鼠置于(25±2)℃,相對(duì)濕度45%～55%的動(dòng)物房?jī)?nèi)適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w,期間正常飲食、飲水,晝/夜12 h交替光照。

1.2藥物與主要試劑 犀角地黃湯由水牛角(替代犀牛角)45 g、白芍12 g、丹皮9 g、生地黃30 g組成,藥材均購(gòu)自北京同仁堂藥店。犀角地黃湯組方藥材均經(jīng)冷水浸泡30 min,其中水牛角預(yù)先煎煮30 min,而后與其余藥材共同繼續(xù)煎煮60 min,制備并濃縮為水剪劑1 g/ml;醋酸潑尼松pain(浙江仙居制藥股份有限公司,規(guī)格:5 mg/片,國(guó)藥準(zhǔn)字H33021207);完全弗氏佐劑(Sigma公司,批號(hào):Lot#SLBZ9884);IL-6、IL-17、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)-β1、IL-10、IL-35檢測(cè)試劑盒(上海酶聯(lián)生物科技有限公司,批號(hào):ml063160、ml063129、ml022522-2、ml037888、ml063154);蘇木素-伊紅(HE)檢測(cè)試劑盒、蛋白濃度測(cè)定試劑盒、山羊抗兔二抗、山羊抗小鼠二抗、β-actin抗體(碧云天生物技術(shù),批號(hào):C0105S、P0009、A0239、A0258、AF0003);TLR4抗體、MyD88抗體、NF-κB抗體、p-NF-κB抗體(Cell Signaling Technology公司,批號(hào):14358、4283、8242、3033)。

1.3儀器 全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀(美國(guó)Abbott公司,型號(hào):CELL-DYN1700);酶標(biāo)儀(山東恒美科技,型號(hào):HM-SY96S);熒光倒置顯微鏡(日本/奧林巴斯Olympus,型號(hào):CKX53);離心機(jī)(湖南湘儀離心機(jī)有限公司,型號(hào):HT165R);凝膠成像系統(tǒng)(美國(guó)Bio-Rad伯樂(lè)公司,型號(hào):Gel Doc XR+)。

1.4兔抗大鼠血小板血清制備 腹腔注射1%戊巴比妥鈉40 mg/kg麻醉SD大鼠,腹主動(dòng)脈取血,放入EDTA抗凝管內(nèi),1 000 r/min,離心10 min,收集血小板,使用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌血小板并調(diào)整濃度為1×109個(gè)/L,之后與完全弗氏佐劑充分混合制備成佐劑抗原。將上述佐劑抗原于新西蘭兔后肢足墊、背部多處進(jìn)行皮下注射。佐劑抗原于首次注射后的7、14、28 d進(jìn)行重復(fù)上述步驟。末次注射后3 d后新西蘭兔心臟采血,3 000 r/min,離心10 min,收集上清液,即為兔抗大鼠血小板血清(APS)〔6〕,并將其放置于-80 ℃冰箱內(nèi)待用。

1.5ITP模型構(gòu)建、分組及給藥干預(yù) 將50只SD大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型組、犀角地黃湯低劑量組、犀角地黃湯高劑量組、潑尼松組,每組10只。除正常對(duì)照組外,其余各組均采用腹腔注射APS構(gòu)建ITP模型(采用生理鹽水稀釋APS,稀釋比例為1∶4,濃度為0.7 ml/200 g,連續(xù)注射3 d)。于造模后7 d,正常對(duì)照組和模型組生理鹽水灌胃;依據(jù)文獻(xiàn)〔6〕及大鼠與人體表面積等效劑量換算,犀角地黃湯低、高劑量組分別給予0.012 5 g/kg、0.050 0 g/kg犀角地黃湯灌胃;潑尼松組給予9.1 mg/kg潑尼松灌胃,1次/d,連續(xù)灌胃14 d,各組灌胃體積均為10 ml/kg。

1.6外周血象檢測(cè) 各組于造模前、給藥前(腹腔注射APS造模后7 d)及給藥后(各組大鼠連續(xù)藥物干預(yù)14 d),大鼠尾靜脈取血,全自動(dòng)血細(xì)胞計(jì)數(shù)儀檢測(cè)各組PLT計(jì)數(shù)。于連續(xù)給藥14 d時(shí)進(jìn)行血紅蛋白(Hb)含量檢測(cè)。

1.7脾臟及胸腺指數(shù)檢測(cè) 各組連續(xù)給藥14 d后稱(chēng)量體質(zhì)量,腹腔注射1%戊巴比妥鈉40 mg/kg麻醉大鼠并頸椎脫臼處死,解剖分離脾臟及胸腺,取出血液及筋膜組織,稱(chēng)量脾臟及胸腺質(zhì)量,計(jì)算脾臟和胸腺指數(shù)。脾臟指數(shù)=脾臟重量(mg)/大鼠體質(zhì)量(g);胸腺指數(shù)=胸腺質(zhì)量(mg)/大鼠體質(zhì)量(g)。

1.8血清IL-6、IL-17、TGF-β1、IL-10、IL-35含量檢測(cè) 各組大鼠連續(xù)灌胃給藥干預(yù)14 d后,腹腔注射1%戊巴比妥鈉40 mg/kg麻醉大鼠后,腹主動(dòng)脈取血,放置于抗凝離心管內(nèi),4 ℃,3 000 r/min,離心10 min,收集上層血清。參照ELISA檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行血清IL-6、IL-17、TGF-β1、IL-10、IL-35含量檢測(cè)。

1.9Th17和Treg細(xì)胞占比測(cè)定 各組大鼠末次給藥結(jié)束后24 h,腹腔注射1%戊巴比妥鈉40 mg/kg麻醉大鼠,腹主動(dòng)脈取血,分離外周血中單核細(xì)胞,向重懸細(xì)胞中加入適量異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的CD4抗體,30 min后加入FITC標(biāo)記的IL-17A抗體及PE標(biāo)記的Foxp3抗體,4 ℃條件下,避光孵育30 min,流式細(xì)胞儀對(duì)上述細(xì)胞信號(hào)進(jìn)行采集,并通過(guò)軟件分析Th17/Treg細(xì)胞比例。

1.10脾臟和胸腺組織病理學(xué)檢測(cè) 各組大鼠連續(xù)給藥14 d后,腹腔注射1%戊巴比妥鈉40 mg/kg麻醉大鼠并頸椎脫臼處死,解剖分離脾臟及胸腺,剪去部分組織放置于10 %多聚甲醛固定液中進(jìn)行組織固定24 h,切片后行HE染色觀察各組脾臟和胸腺組織病理學(xué)變化。

1.11脾臟組織TLR4/MyD88/NF-κB通路蛋白表達(dá)檢測(cè) 各組干預(yù)14 d后,立即將大鼠處死,剪取大鼠脾臟組織并提取總蛋白;二喹啉甲酸(BCA)法測(cè)定各組脾臟組織蛋白質(zhì)濃度;蛋白上樣;凝膠電泳;濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜;5%BSA室溫封閉2 h;分別賦予TLR4抗體(1∶1 000)、MyD88抗體(1∶500)、p-NF-κB抗體(1∶1 000)、NF-κB抗體(1∶1 000)及β-actin抗體(1∶2 000),4 ℃ 條件下孵育16 h;37 ℃條件下二抗孵育60 min;去除二抗后TBST洗膜15 min;滴加顯影液于Gel Doc XR+成像系統(tǒng)中顯影拍照,并通過(guò)ImageJ軟件分析蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.12統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS20.0軟件進(jìn)行多因素方差分析,組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1犀角地黃湯對(duì)ITP大鼠一般情況的影響 正常對(duì)照組反應(yīng)靈敏、精神狀態(tài)良好,飲食、飲水均正常;其余各組造模7 d后出現(xiàn)活動(dòng)能力明顯減弱,飲食、飲水下降,皮膚出血,精神狀態(tài)較差等現(xiàn)象。與模型組相比,各藥物干預(yù)組活動(dòng)能力明顯增強(qiáng),皮膚出血點(diǎn)減少,精神狀態(tài)得到明顯改善。

2.2犀角地黃湯對(duì)ITP大鼠外周血PLT數(shù)目的影響 造模前,各組外周血PLT計(jì)數(shù)無(wú)顯著差異(P>0.05)。給藥前,與正常對(duì)照組相比,各造模組外周血PLT計(jì)數(shù)均顯著降低(P<0.05)。連續(xù)給藥14 d后,與正常對(duì)照組相比,模型組外周血PLT計(jì)數(shù)顯著降低(P<0.05)。與模型組相比,犀角地黃湯低、高劑量組及潑尼松組外周血PLT計(jì)數(shù)顯著升高(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組外周血PLT數(shù)目比較

2.3犀角地黃湯對(duì)ITP大鼠Hb濃度、脾臟及胸腺指數(shù)的影響 連續(xù)給藥14 d后,與正常對(duì)照組相比,模型組外周血Hb濃度顯著降低,脾臟和胸腺指數(shù)均顯著升高(P<0.05)。與模型組相比,犀角地黃湯低劑量組、高劑量組及潑尼松組外周血Hb濃度顯著升高,脾臟和胸腺指數(shù)均顯著降低(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 各組Hb濃度、脾臟、胸腺指數(shù)、血清IL-6、IL-17、TGF-β1、IL-10、IL-35水平比較

2.4犀角地黃湯對(duì)ITP大鼠血清炎性因子及外周血Th17/Treg細(xì)胞比例的影響 與正常對(duì)照組相比,模型組血清IL-6、IL-17水平顯著升高,TGF-β1、IL-10、IL-35水平均顯著降低(P<0.05)。與模型組相比,犀角地黃湯低劑量組、高劑量組及潑尼松組血清IL-6、IL-17水平顯著降低,TGF-β1、IL-10、IL-35水平均顯著升高(P<0.05)。見(jiàn)表2。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)顯示,與正常對(duì)照組相比,模型組外周血中Th17細(xì)胞百分含量明顯增加,Treg細(xì)胞百分含量明顯降低(P<0.05)。與模型組相比,犀角地黃湯低劑量組、高劑量組及潑尼松組外周血中Th17細(xì)胞百分含量明顯降低,Treg細(xì)胞百分含量明顯增加(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 各組外周血中Th17、Treg細(xì)胞比例比較

2.5犀角地黃湯對(duì)ITP大鼠臟器病理形態(tài)學(xué)的影響 脾臟組病例染色顯示,正常對(duì)照組脾臟結(jié)構(gòu)清晰、紅髓、白髓相見(jiàn)分布,可見(jiàn)紅髓充血,可見(jiàn)髓樣生化;模型組脾臟組織結(jié)構(gòu)模糊,脾臟小體部分萎縮,可見(jiàn)紅髓明顯充血,巨噬細(xì)胞明顯增多。與模型組相比,犀角地黃湯低劑量組、高劑量組及潑尼松組骨髓外造血減輕,脾臟結(jié)構(gòu)得到改善,巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)程度減輕。胸腺病理性染色顯示,正常對(duì)照組胸腺組織結(jié)構(gòu)清晰,皮質(zhì)及髓質(zhì)分解清晰,且皮質(zhì)區(qū)域淋巴細(xì)胞排列規(guī)整,髓質(zhì)區(qū)域可見(jiàn)胸小小體,淋巴細(xì)胞減少;模型組大鼠胸腺組織結(jié)構(gòu)疏松,淋巴細(xì)胞明顯減少,皮質(zhì)髓質(zhì)分界模糊。與模型組相比,犀角地黃湯低劑量組、高劑量組及潑尼松組胸腺組織病理形態(tài)學(xué)得到不同程度改善。見(jiàn)圖1。

圖1 各組脾臟及胸腺組織病理學(xué)(HE染色,×400)

2.6犀角地黃湯對(duì)ITP大鼠脾臟TLR4/MyD88/NF-κB信號(hào)通路蛋白表達(dá)的影響 與正常對(duì)照組相比,模型組脾臟組織TLR4、MyD88、p-NF-κB/NF-κB蛋白表達(dá)均顯著升高(P<0.05)。與模型組相比,犀角地黃湯低、高劑量組及潑尼松組脾臟組織TLR4、MyD88、p-NF-κB/NF-κB蛋白表達(dá)均顯著降低(P<0.05)。見(jiàn)圖2、表4。

1～5:正常對(duì)照組、模型組、犀角地黃湯低劑量組、犀角地黃湯高劑量組、潑尼松組圖2 Western印跡檢測(cè)脾臟組織TLR4/MyD88/NF-κB信號(hào)通路蛋白

表4 各組脾臟組織TLR4、MyD88、p-NF-κB蛋白相對(duì)表達(dá)水平

3 討 論

ITP約占出血性疾病的1/3〔10〕。ITP發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜,至今尚未完全闡明。研究表明,以T淋巴細(xì)胞免疫失衡及相關(guān)細(xì)胞因子分泌異常在ITP疾病進(jìn)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用〔11〕,但其具體致病機(jī)制尚未完全闡明。Th細(xì)胞在機(jī)體免疫系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用,其可以分化成為T(mén)h1、Th2、Th17及Treg細(xì)胞等,而以Th17/Treg細(xì)胞平衡是維持機(jī)體免疫穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵〔12〕。Th17是介導(dǎo)炎癥和自身免疫性疾病的重要調(diào)節(jié)因子,主要通過(guò)產(chǎn)生特異性炎癥細(xì)胞因子IL-6、IL-17、IL-21及IL-22等介導(dǎo)機(jī)體炎癥反應(yīng)及免疫功能異常激活。而Treg是介導(dǎo)免疫穩(wěn)態(tài)及免疫耐受的關(guān)鍵,主要通過(guò)分泌IL-10、IL-35及TGF-β1等抑制性細(xì)胞因子,從而抑制T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫耐受,維持免疫功能平衡及抑制炎癥反應(yīng)的發(fā)生,兩者功能相反且處于動(dòng)態(tài)平衡〔13〕。既往研究顯示,當(dāng)機(jī)體存在炎癥、感染及自身免疫性疾病時(shí),會(huì)導(dǎo)致機(jī)體免疫系統(tǒng)異常激活,從而導(dǎo)致Th17/Treg細(xì)胞平衡被打破〔14〕。研究證實(shí),Th17/Treg失衡參與了ITP的發(fā)生發(fā)展〔15〕。因此,以Th17/Treg細(xì)胞失衡及相關(guān)細(xì)胞因子分泌異常為靶標(biāo)可能是治療ITP的關(guān)鍵。

祖國(guó)醫(yī)學(xué)認(rèn)為,ITP屬“血證”“紫斑”等范疇,病機(jī)為氣不攝血、陰虛火旺及血熱妄行等〔16〕,其中以血熱妄行為ITP主要病機(jī),治療多宜涼血止血、清熱解毒。犀角地黃湯以犀牛角、丹皮、生地黃、白芍四味中藥組成,組方中犀角具有清心解毒止血;芍藥,丹皮具有清熱涼血、活血化瘀之效;生地黃具有滋陰生津,輔助犀牛角涼血止血。既往研究顯示,犀角地黃湯能夠用于治療系統(tǒng)性紅斑〔17〕、ITP〔6〕及小兒過(guò)敏性紫癜〔18〕等中醫(yī)辨證為血熱患者。以上研究表明犀角地黃湯具有治療ITP作用。王躍等〔6〕研究顯示,犀角地黃湯能夠通過(guò)維持Th17/Treg細(xì)胞平衡,從而改善ITP大鼠PLT計(jì)數(shù)。本研究結(jié)果進(jìn)一步證實(shí),犀角地黃湯具有治療ITP作用,與維持Th17/Treg細(xì)胞平衡,抑制炎癥細(xì)胞因子釋放相關(guān)。但是,有關(guān)Th17/Treg細(xì)胞平衡的調(diào)節(jié)機(jī)制尚不清楚。

TLR4/MyD88/NF-κB信號(hào)通路參與介導(dǎo)炎癥反應(yīng)及免疫功能的重要調(diào)節(jié)機(jī)制。研究顯示,下調(diào)TLR4表達(dá)能夠抑制NF-κB向核內(nèi)轉(zhuǎn)移,從而參與調(diào)控Th17/Treg免疫平衡,抑制結(jié)直腸炎小鼠炎癥因子表達(dá),從而緩解結(jié)腸炎小鼠臨床癥狀〔19〕。徐化雪等〔20〕研究顯示,右美托咪定能夠通過(guò)抑制TLR4/MyD88/NF-κB信號(hào)通路介導(dǎo)的免疫功能紊亂,從而改善原位肝癌切除術(shù)大鼠術(shù)后免疫功能抑制。以上研究提示,TLR4/MyD88/NF-κB信號(hào)通路可能通過(guò)調(diào)節(jié)Th17/Treg免疫平衡,參與ITP發(fā)生發(fā)展。本研究結(jié)果表明,TLR4/MyD88/NF-κB信號(hào)通路激活可能與ITP時(shí)Th17/Treg免疫細(xì)胞失衡相關(guān);犀角地黃湯能夠通過(guò)抑制TLR4/MyD88/NF-κB信號(hào)通路活化,改善Th17/Treg免疫細(xì)胞失衡。