土木香內(nèi)酯上調(diào)miR-3178抑制膽管癌QBC939細(xì)胞增殖、遷移和侵襲

張玉勝 李稱才 陳博藝 余勇 王振龍 (湛江中心人民醫(yī)院肝膽外科,廣東 湛江 524000)

膽管癌是第二常見的原發(fā)性肝膽惡性腫瘤,具有發(fā)病隱匿、進(jìn)展快、轉(zhuǎn)移快等特點〔1〕?；熓遣荒苁中g(shù)切除患者延緩病情進(jìn)展的重要手段,但由于化學(xué)敏感性差、化療藥毒副作用較大,多數(shù)膽管癌患者預(yù)后較差,5年總生存率極低〔2〕。因此,尋找有效抑制膽管癌細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移的藥物是治療膽管癌的關(guān)鍵。土木香內(nèi)酯是從菊科植物土木香Inula helenium L.根中提取的萜類化合物,具有抗炎、保肝、清除自由基、抗癌等生物活性〔3〕。研究報道土木香內(nèi)酯通過靶向轉(zhuǎn)錄因子(TF)EB破壞自噬-溶酶體通路,誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞凋亡,提高化療敏感性〔4〕。此外,土木香內(nèi)酯對乳腺癌細(xì)胞遷移、侵襲、黏附、增殖具有抑制作用〔5〕。然而,土木香內(nèi)酯在膽管癌中的抗癌作用未見報道。微小RNA(miR)是一類長度約20個核苷酸的小分子RNA,其通過在轉(zhuǎn)錄后調(diào)控基因表達(dá),參與調(diào)節(jié)細(xì)胞發(fā)育、分化、凋亡、增殖、轉(zhuǎn)移等細(xì)胞過程〔6〕。研究報道肝細(xì)胞癌腫瘤內(nèi)皮細(xì)胞中miR-3178表達(dá)較低,過表達(dá)miR-3178可抑制肝細(xì)胞癌腫瘤內(nèi)皮細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移〔7〕。乳腺癌中miR-3178低表達(dá)與總生存率較差相關(guān),過表達(dá)miR-3178通過抑制上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)抑制乳腺癌細(xì)胞遷移和侵襲〔8〕。然而,miR-3178在膽管癌是否具有抗癌作用仍然未知。因此,本研究旨在闡明土木香內(nèi)酯、miR-3178對膽管癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響,并確定土木香內(nèi)酯是否通過調(diào)控miR-3178表達(dá)發(fā)揮抗癌作用。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2018年1～12月在湛江中心人民醫(yī)院接受手術(shù)切除的39例膽管癌組織標(biāo)本和癌旁組織標(biāo)本(非癌組織),組織標(biāo)本均由兩名病理學(xué)家確認(rèn)。其中男24例,女15例,年齡45～75歲,中位年齡61歲。膽管癌患者術(shù)前均未接受任何抗腫瘤治療。本研究經(jīng)醫(yī)院科研倫理委員會批準(zhǔn),患者均獲得書面知情同意。手術(shù)后立即將組織標(biāo)本置于液氮中冷凍,然后在-80 ℃冰箱保存直到使用。

1.2細(xì)胞和試劑 人膽管癌細(xì)胞QBC939購自上海鈺博生物公司;土木香內(nèi)酯(純度99.4%,批號110760-201811,土木香內(nèi)酯先溶于二甲基亞砜配制50 mmol/L的母液備用,實驗時用培養(yǎng)基稀釋至所需濃度)購于中國食品藥品檢定研究院;Opti-MEM培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基購自美國Gibco公司;Lipofectamine2000購自美國Thermo Fisher公司;miR-3178模擬物(mimics)、miR-3178抑制物(anti-miR-3178)及各自的陰性對照(miR-NC、anti-miR-NC)由北京六合華大基因公司提供;細(xì)胞計數(shù)試劑盒(CCK-8)、miRNA熒光定量檢測試劑盒、NP-40裂解液、Trizol試劑購自北京百奧萊博生物公司;Transwell小室購自美國BD公司;小鼠E-cadherin單克隆抗體(sc-21791)、小鼠N-cadherin單克隆抗體(sc-8424)、小鼠GAPDH單克隆抗體(sc-47724)、山羊抗小鼠IgG二抗(sc-2005)購自美國Santa Cruz公司;miRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自南京諾唯贊生物公司。

1.3細(xì)胞培養(yǎng)和分組 QBC939細(xì)胞接種在含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基,放入含5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞密融合度為80%時胰酶0.25%胰蛋白酶消化,1∶3比例傳代。將第五代對數(shù)期QBC939細(xì)胞接種24孔板,細(xì)胞密度為1×105個/孔,當(dāng)細(xì)胞融合度為50%時進(jìn)行轉(zhuǎn)染。按照Lipofectamine2000說明書將脂質(zhì)體和無血清Opti-MEM培養(yǎng)基混勻;同時將待轉(zhuǎn)染序列與無血清Opti-MEM培養(yǎng)基混勻;室溫孵育5 min,將二者混合,室溫孵育20 min。取100 μl混合物加入24孔板各孔進(jìn)行轉(zhuǎn)染,培養(yǎng)6 h后更換為含血清DMEM培養(yǎng)基,轉(zhuǎn)染48 h時收集QBC939細(xì)胞,實時定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-qPCR)測定miR-548b的相對水平以驗證轉(zhuǎn)染效果。正常培養(yǎng)的QBC939細(xì)胞命名為對照組;用含1.25、2.50、5.00 μmol/L土木香內(nèi)酯〔9〕培養(yǎng)液孵育QBC939細(xì)胞48 h,分別命名為土木香內(nèi)酯低濃度(AL-L)組、土木香內(nèi)酯中濃度(AL-M)組、土木香內(nèi)酯高濃度(AL-H)組;轉(zhuǎn)染miR-NC、轉(zhuǎn)染miR-3178 mimics的QBC939細(xì)胞分別命名為miR-NC組、miR-3178組;用含5 μmol/L土木香內(nèi)酯的培養(yǎng)液孵育轉(zhuǎn)染anti-miR-NC、轉(zhuǎn)染anti-miR-3178的QBC939細(xì)胞,分別命名為AL+anti-miR-NC組、AL+anti-miR-3178組。

1.4CCK-8法檢測細(xì)胞增殖 將未轉(zhuǎn)染QBC939細(xì)胞及轉(zhuǎn)染miR-NC、轉(zhuǎn)染miR-3178 mimics、轉(zhuǎn)染anti-miR-NC、轉(zhuǎn)染anti-miR-3178的QBC939細(xì)胞接種96孔板,每孔5×103個細(xì)胞,按照1.3分組給予對應(yīng)濃度的土木香內(nèi)酯置于培養(yǎng)箱孵育,48 h后每孔加入10 μl CCK-8工作液,培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育2 h。用酶標(biāo)儀測定各孔在450 nm處的吸光度值(A)。抑制率(%)=(1-實驗組OD值/對照組OD值)×100%

1.5Transwell實驗檢測細(xì)胞侵襲 取各組QBC939細(xì)胞,分別用0.25%胰蛋白酶消化并吹打成單個細(xì)胞,并把細(xì)胞懸浮在無血清的DMEM培養(yǎng)液中(細(xì)胞濃度為1×106個)備用。向包被基質(zhì)膠的Transwell上室加入200 μl細(xì)胞懸浮,向24孔板下室中加入500 μl含10%胎牛血清培養(yǎng)基。培養(yǎng)箱孵育24 h后,用無菌棉小心擦去Transwell膜上表面細(xì)胞,4%多聚甲醛固定膜表面侵襲細(xì)胞30 min,0.1%結(jié)晶紫染液染色20 min。在顯微鏡下觀察QBC939細(xì)胞穿膜情況,以隨機(jī)5個視野內(nèi)細(xì)胞數(shù)均值表示細(xì)胞侵襲數(shù)。

1.6劃痕愈合實驗檢測細(xì)胞遷移 每組取6×105個QBC939細(xì)胞接種6孔板,當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到80%～90%時,用移液槍100 μl槍頭在細(xì)胞表面劃一條橫線。PBS漂洗除去細(xì)胞碎片。加入無血清培養(yǎng)基,放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)。培養(yǎng)0、24 h時顯微鏡下拍照,測量劃痕寬度。劃痕愈合率(%)=(0 h劃痕寬度-24 h劃痕寬度)/0 h劃痕寬度×100%

1.7平板克隆實驗檢測細(xì)胞克隆形成能力 每組QBC939細(xì)胞以每孔200個細(xì)胞的密度接種在6孔板中,輕輕轉(zhuǎn)動6孔板使細(xì)胞分散均勻。將6孔板置于常規(guī)培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3 w。當(dāng)6孔板中出現(xiàn)肉眼可見的克隆時,終止培養(yǎng)。棄去上清液,用PBS漂洗細(xì)胞兩次,用4%多聚甲醛固定細(xì)胞15 min,去除固定液,用0.1%結(jié)晶紫染液染色20 min。流水洗去染色液,空氣干燥。在顯微鏡下計數(shù)大于50個細(xì)胞的克隆數(shù)。

1.8Western印跡法檢測E-cadherin和N-cadherin蛋白表達(dá) QBC939細(xì)胞處理完畢后,使用NP-40裂解細(xì)胞。每組QBC939細(xì)胞取40 μg蛋白進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE),隨后濕轉(zhuǎn)法將分離的蛋白轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜。將膜放入孵育盒,加入5%脫脂牛奶緩沖液封閉1 h,棄去封閉液、Tris緩沖鹽水-吐溫20(TBST)漂洗后用1∶1 000稀釋的一抗4 ℃孵育過夜,TBST漂洗后用1∶3 000稀釋的山羊抗小鼠二抗室溫孵育1 h。加入化學(xué)發(fā)光底物使蛋白條帶顯色,以Imag J軟件測得的目的條帶和內(nèi)參GAPDH條帶灰度值比值表示目的蛋白的表達(dá)量。

1.9RT-qPCR檢測miR-3178表達(dá) Trizol試劑分離各組QBC939細(xì)胞及乳腺癌組織、癌旁組織的總RNA。測定RNA濃度合格后,按照miRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明進(jìn)行合成cDNA,再用miRNA熒光定量檢測試劑盒進(jìn)行RT-qPCR。miR-3178相對水平檢測以U6為內(nèi)參,采用2-ΔΔCt法計算。miR-3178上游5′-GGGGCGCGGCCGGATCG-3′,下游′5′-GCTGTC-AACGATACGCTACGTAACG-3′;U6上游5′-CTCGC-TTCGGCAGCACA-3′,下游5′-AACGCTTCACGAAT-TTGCGT-3′。

1.10統(tǒng)計學(xué)方法 每組設(shè)置3個復(fù)孔,實驗重復(fù)3次。采用SPSS22.0軟件進(jìn)行獨立樣本t檢驗、單因素方差分析和SNK-q檢驗。

2 結(jié) 果

2.1土木香內(nèi)酯對膽管癌QBC939細(xì)胞增殖的影響 與對照組比較,AL-L、AL-M、AL-M組QBC939細(xì)胞增殖抑制率顯著升高(P<0.05),克隆形成數(shù)顯著降低(P<0.05)。隨著土木香內(nèi)酯濃度的增加,其對QBC939細(xì)胞的增殖抑制作用逐漸增強(qiáng),兩兩比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 土木香內(nèi)酯對膽管癌QBC939細(xì)胞增殖、遷移、侵襲及miR-3178表達(dá)的影響

2.2土木香內(nèi)酯對膽管癌QBC939細(xì)胞遷移、侵襲的影響 與對照組比較,AL-L、AL-M、AL-M組QBC939細(xì)胞劃痕愈合率、侵襲細(xì)胞數(shù)、N-cadherin蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05),E-cadherin蛋白表達(dá)水平顯著增加(P<0.05)。隨著土木香內(nèi)酯濃度的增加,其對QBC939細(xì)胞遷移、侵襲、N-cadherin蛋白表達(dá)的抑制作用及對E-cadherin蛋白表達(dá)的促進(jìn)作用均逐漸增強(qiáng),兩兩比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1、圖1。

1～8:對照組、AL-L組、AL-M組、AL-H組、miR-NC組、miR-3178組、AL-anti-miR-NC組、AL-anti-miR-3178組圖1 各組遷移、侵襲相關(guān)蛋白表達(dá)

2.3土木香內(nèi)酯對膽管癌QBC939細(xì)胞miR-3178表達(dá)的影響 與對照組比較,AL-L組、AL-M組、AL-M組QBC939細(xì)胞miR-3178相對水平顯著升高(P<0.05)。隨著土木香內(nèi)酯濃度增加,其對QBC939細(xì)胞miR-3178表達(dá)抑制作用逐漸增強(qiáng),兩兩比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

2.4miR-3178過表達(dá)對膽管癌QBC939細(xì)胞增殖、遷移、侵襲的影響 與miR-NC組比較,miR-3178組QBC939細(xì)胞miR-3178相對水平、抑制率、E-cad-herin蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05),細(xì)胞克隆形成數(shù)、劃痕愈合率、侵襲細(xì)胞數(shù)、N-cadherin蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05)。見圖1、表2。

表2 miR-3178過表達(dá)對膽管癌QBC939細(xì)胞增殖、遷移侵襲的影響

2.5miR-3178在膽管癌組織中的表達(dá) 膽管癌組織中miR-3178的相對水平(0.34±0.03)較癌旁組織(1.00±0.08)顯著降低(n=39;t=48.241,P=0.000)。

2.6抑制miR-3178表達(dá)逆轉(zhuǎn)了土木香內(nèi)酯對膽管癌QBC939細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的作用 與AL+anti-miR-NC組比較,AL+anti-miR-3178組QBC939細(xì)胞miR-3178相對水平、抑制率、E-cadherin蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05),細(xì)胞克隆形成數(shù)、劃痕愈合率、侵襲細(xì)胞數(shù)、N-cadherin蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05)。見圖1、表3。

表3 干擾miR-3178表達(dá)逆轉(zhuǎn)了土木香內(nèi)酯對膽管癌QBC939細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的作用

3 討 論

近年來,天然化合物作為新型癌癥治療手段的潛力受到廣泛關(guān)注。土木香內(nèi)酯已被證實在多種人類癌癥中表現(xiàn)出抗癌潛力。研究〔4〕表明土木香內(nèi)酯處理后乳腺癌細(xì)胞形態(tài)由梭形變?yōu)閳A形,細(xì)胞存活率明顯下降。Zhang等〔10〕指出土木香內(nèi)酯可通過下調(diào)磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)信號通路抑制骨肉瘤細(xì)胞遷移和侵襲。Wang等〔11〕證實土木香內(nèi)酯通過活性氧介導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和AKT/糖原合成酶激酶(GSK)3通路增強(qiáng)肺癌細(xì)胞對吉西他濱的敏感性。此外,土木香內(nèi)酯通過調(diào)控p38絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)和核因子(NF)-κB通路促進(jìn)胃癌細(xì)胞,并抑制細(xì)胞遷移〔12〕。本研究首次探討土木香內(nèi)酯在膽管癌中的抗癌作用,結(jié)果表明,土木香內(nèi)酯以濃度依賴方式抑制膽管癌細(xì)胞QBC939增殖、遷移和侵襲,這與Chun等〔5〕報道其在乳腺癌中抗癌作用一致。E-cadherin是腫瘤細(xì)胞表型的中樞調(diào)節(jié)因子,E-cadherin表達(dá)下調(diào)與其膽管癌陽性轉(zhuǎn)移狀態(tài)有關(guān),下調(diào)E-cadherin表達(dá)可降低細(xì)胞黏附強(qiáng)度,促進(jìn)膽管癌細(xì)胞遷移和侵襲,進(jìn)而促進(jìn)膽管癌進(jìn)展〔13〕。本研究中,土木香內(nèi)酯顯著下調(diào)間質(zhì)表型蛋白N-cadherin表達(dá),上調(diào)上皮表型蛋白E-cadherin表達(dá),這與其對QBC939細(xì)胞的遷移和侵襲抑制作用一致。以上研究表明,土木香內(nèi)酯對膽管癌細(xì)胞QBC939的惡性生物學(xué)行為具有抑制作用。

miR-3178是一種腫瘤相關(guān)miRNA,研究顯示乳腺癌中miR-3178表達(dá)改變可能與他莫昔芬耐藥有關(guān)〔14〕。miR-3178通過靶向腫瘤壞死因子相關(guān)受體因子(TRAF)3能夠改善幽門螺桿菌新毒素腫瘤壞死因子-α誘導(dǎo)蛋白(Tip-α)誘導(dǎo)的胃部炎癥和腫瘤發(fā)生〔15〕。特異性蛋白(Sp1)通過下調(diào)miR-3178促進(jìn)低轉(zhuǎn)移性前列腺癌、肺癌和乳腺癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移〔16〕。本研究發(fā)現(xiàn)膽管癌組織中miR-3178的相對水平顯著降低,提示miR-3178低表達(dá)可能有助于膽管癌進(jìn)展。功能實驗表明,過表達(dá)miR-3178明顯下調(diào)N-cadherin蛋白表達(dá),上調(diào)E-cadherin蛋白表達(dá),抑制QBC939細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。既往研究報道,中藥化合物可通過調(diào)控miRNA表達(dá)發(fā)揮抗腫瘤作用,例如姜黃素通過上調(diào)miR-143表達(dá)明顯抑制前列腺癌細(xì)胞增殖和遷移過程〔17〕。本研究發(fā)現(xiàn),土木香內(nèi)酯以濃度依賴方式增加QBC939細(xì)胞中miR-3178相對水平,且土木香內(nèi)酯和過表達(dá)miR-3178的抗腫瘤效果類似,提示miR-3178可能介導(dǎo)土木香內(nèi)酯的抗腫瘤作用。進(jìn)一步研究顯示,抑制miR-3178表達(dá)部分逆轉(zhuǎn)土木香內(nèi)酯對QBC939細(xì)胞增殖、遷移、侵襲、N-cadherin蛋白表達(dá)的抑制作用及對E-cadherin蛋白表達(dá)的促進(jìn)作用,這表明土木香內(nèi)酯通過上調(diào)miR-3178表達(dá)抑制膽管癌細(xì)胞QBC939的惡性生物學(xué)行為。然而,本研究僅進(jìn)行了體外細(xì)胞實驗,后續(xù)將在動物模型中進(jìn)一步驗證土木香內(nèi)酯的抗腫瘤作用。

綜上,miR-3178在膽管癌中表達(dá)下調(diào),土木香內(nèi)酯通過上調(diào)miR-3178表達(dá)進(jìn)而抑制膽管癌細(xì)胞QBC939增殖、遷移和侵襲,這初步揭示了土木香內(nèi)酯的抗腫瘤分子機(jī)制,并可能為土木香內(nèi)酯作為一種新型抗癌藥提供理論基礎(chǔ)。