白藜蘆醇調(diào)控TLR4/NF-κB信號(hào)通路對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎大鼠炎癥反應(yīng)的影響

劉景鴻 萬(wàn)云 劉曉龍 葉鵬 顧秋平 (贛州市人民醫(yī)院消化內(nèi)科,江西 贛州 341000)

潰瘍性結(jié)腸炎是一種反復(fù)發(fā)作的自發(fā)性炎癥性腸道疾病,其病因不明,且病情輕重不等〔1〕。大多數(shù)患者發(fā)病時(shí)多以腹瀉、黏液膿血便、腹痛等為主要表現(xiàn)〔2,3〕。近年來(lái)該病的發(fā)病率逐年上升,且極易復(fù)發(fā)。目前為止該病的治療方法仍舊是以藥物治療為主,但是許多免疫抑制類(lèi)藥物多存在不可耐受的副作用,并且會(huì)引發(fā)一系列并發(fā)癥〔4〕,因此,尋找安全性及療效較好的新型藥物至關(guān)重要。白藜蘆醇是一種存在于花生或植物中的酚類(lèi)化合物,有研究已證實(shí)其具有抵抗炎癥、免疫調(diào)節(jié)、抵抗腫瘤增殖等作用〔5,6〕。近年來(lái)有研究指出,該藥材還具有抵抗癌細(xì)胞的能力,可以通過(guò)調(diào)控mTOR來(lái)抑制肝癌細(xì)胞的增殖;還可以抑制肺癌細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展〔7,8〕。研究發(fā)現(xiàn)Toll樣受體(TLR)4/核轉(zhuǎn)錄因子(NF)-κB是潰瘍性結(jié)腸炎的重要信號(hào)通路之一,與炎癥和免疫息息相關(guān),其激活后在機(jī)體的炎癥、免疫反應(yīng)、細(xì)胞凋亡等過(guò)程中起樞紐作用〔9〕。但是白藜蘆醇是否可以通過(guò)調(diào)控TLR4/NF-κB通路對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎大鼠的炎癥反應(yīng)有一定的作用,還不夠明確,因此,本文觀察白藜蘆醇對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎大鼠炎癥反應(yīng)的影響,并探討其相關(guān)機(jī)制。

1 資料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組 選取50只9周齡左右的SD雄性大鼠,體質(zhì)量260 g左右,購(gòu)自北京科宇動(dòng)物養(yǎng)殖中心,飼養(yǎng)與無(wú)菌環(huán)境中,溫度27 ℃左右;濕度:55%左右,自由進(jìn)食,適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。將其隨機(jī)分為:空白組、模型組、白藜蘆醇低、中、高劑量組,每組各10只。

1.2儀器與試劑 白藜蘆醇(純度≥99%,美國(guó)Sigma公司)、磷酸鹽緩沖液(PBS,成都中仕石化有限公司)、石蠟(瑞沃德生命科技有限公司)、乙醇、生理鹽水(南京化學(xué)試劑有限公司)、所需試劑盒(上海酶聯(lián)生物科技有限公司)、離心機(jī)、凝膠成像儀(上海無(wú)陌光學(xué)儀器有限公司)、酶標(biāo)儀、PCR儀、電泳儀(大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)、組織勻漿機(jī)(深圳欣博盛生物科技有限公司)、所需抗體(美國(guó)Thermo公司)。

1.3模型制備 采用2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)灌腸法制備模型〔10〕,大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d,禁食不禁水24 h后開(kāi)始造模,首先對(duì)除空白組外的大鼠進(jìn)行麻醉,仰臥位置于鼠臺(tái)上,然后快速將0.65 ml的TNBS結(jié)合乙醇溶液灌入,空白組則灌入等體積生理鹽水,大鼠均快速注入后捏緊肛門(mén),提取大鼠尾巴數(shù)分鐘,以防注倒流。大鼠清醒后開(kāi)始常規(guī)飼養(yǎng),自由飲食。第2天開(kāi)始除空白組和模型組外,白藜蘆醇低、中、高劑量組分別腹腔注射白藜蘆醇(10、50、100 mg/kg),連續(xù)給藥7 d,而空白組和模型組則不處理。

1.4蘇木素-伊紅(HE)染色觀察大鼠組織病理變化 先將大鼠麻醉,仰臥固定,打開(kāi)腹部暴露臟器,小心摘取肝臟、肺臟后,用生理鹽水充分沖洗后再固定,流水沖洗并采用酒精脫水,再將組織塊置于既溶于酒精又溶于石蠟的透明劑中,放入保溫箱中。待石蠟完全浸入組織塊后包埋,連續(xù)5 μm切片,進(jìn)行染色,然后觀察各組大鼠結(jié)腸組織的病理學(xué)變化,并進(jìn)行評(píng)分,評(píng)分=炎癥分?jǐn)?shù)+潰瘍深度分?jǐn)?shù)+腸壁增厚分?jǐn)?shù)+隱窩破壞情況分?jǐn)?shù)。

1.5酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)各組大鼠血清炎性細(xì)胞因子 將大鼠頸部的皮向后擼,使大鼠的眼睛突出后采集血液,離心后置于-80 ℃環(huán)境中待檢,采用ELISA檢測(cè)大鼠血清腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細(xì)胞介素(IL)-6、IL-1β、IL-10的表達(dá),嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)操作。

1.6Western印跡檢測(cè)各組組織TLR4/NF-κB信號(hào)通路的相關(guān)蛋白表達(dá) 取組織總蛋白進(jìn)行測(cè)定,行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE),分離后進(jìn)行轉(zhuǎn)膜用牛血清白蛋白(BSA)封閉聚偏氟乙烯(PVDF)膜1 h,脫脂封閉后加入TLR4、NF-κB抗體;吸盡一抗孵育時(shí)的洗滌液后加入稀釋好的二抗慢慢搖動(dòng);再次搖動(dòng)洗滌,進(jìn)行化學(xué)發(fā)光反應(yīng),然后浸入顯影液中顯色、最后凝膠成像,計(jì)算蛋白表達(dá)。

1.7PCR檢測(cè)各組組織中TLR4、NF-κB mRNA表達(dá) 提取血清總RNA,按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)要求,將提取的總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA,然后再進(jìn)行擴(kuò)增,以GAPDH為內(nèi)參,檢測(cè)相對(duì)表達(dá):ΔCt=目的基因Ct-內(nèi)參基因Ct,引物序列:TLR4正向5′-CCTGTGGACAAGGTCAGCAACTC-3′,反向5′-CACTCAGACTCGGCACTTAGCAC-3′;NF-κB正向5′-TGAG-TCCCGCCCCTTCTAAA-3′,反向5′-CCTGGATCACTTCAATGGCCT-3′;GAPDH正向5′-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3′,反向5′-GGCTGTTGTCATACTTC-TCATGG-3′。

1.8分子對(duì)接 運(yùn)用YASARA分子模擬軟件進(jìn)行結(jié)構(gòu)優(yōu)化,運(yùn)用軟件AutoDock4.0進(jìn)行剛性分子對(duì)接,白藜蘆醇構(gòu)象的搜索使用 Lamarchian遺傳算法,能量匹配通過(guò)半經(jīng)驗(yàn)自由能的計(jì)算。驗(yàn)證白藜蘆醇與TLR4/NF-κB的相互作用。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS21.0軟件進(jìn)行單因素方差分析、LSD-t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1各組結(jié)腸組織病理結(jié)果比較 空白組結(jié)腸結(jié)構(gòu)清晰,黏膜上皮結(jié)構(gòu)較好,細(xì)胞排列整齊均勻,無(wú)浸潤(rùn)。模型組結(jié)腸黏膜、黏膜下層見(jiàn)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn),且結(jié)構(gòu)紊亂,潰瘍已達(dá)到肌層,固有層結(jié)構(gòu)破壞嚴(yán)重。白藜蘆醇各劑量組結(jié)腸黏膜、黏膜下層炎性胞浸潤(rùn)明顯減少,結(jié)構(gòu)開(kāi)始逐漸清晰,水腫、糜爛現(xiàn)明顯減輕,且隨著劑量增加,潰瘍明顯減少。且與空白組相比,模型組及白藜蘆醇高、中、低劑量組病理評(píng)分顯著升高,而白藜蘆醇各劑量組病理評(píng)分顯著下降,且呈劑量依賴性(P<0.05),見(jiàn)圖1、表1。

表1 各組病理組織評(píng)分、炎性細(xì)胞因子水平

圖1 各組結(jié)腸組織病理學(xué)(HE染色,×100)

2.2各組血清炎性細(xì)胞因子 與空白組相比,模型組及白藜蘆醇各組TNF-α、IL-6、IL-1β水平顯著較高,IL-10水平顯著較低;與模型組相比,白藜蘆醇各組TNF-α、IL-6、IL-1β水平顯著較低,IL-10水平顯著較高,且隨著劑量的增加而變化(P<0.05),見(jiàn)表1。

2.3各組TLR4/NF-κB信號(hào)通路相關(guān)蛋白和mRNA表達(dá) 與空白組相比,模型組TLR4、NF-κB蛋白和mRNA表達(dá)顯著較高(P<0.05),白藜蘆醇用藥后,TLR4、NF-κB蛋白和mRNA表達(dá)顯著下降,且隨著劑量的增加而顯著降低(P<0.05),見(jiàn)表2、圖2。

表2 各組結(jié)腸組織中TLR4、NF-κB蛋白和mRNA表達(dá)比較

1～5:空白組、模型組、白藜蘆醇低劑量組、白藜蘆醇中劑量組、白藜蘆醇高劑量組圖2 各組TLR4、NF-κB蛋白表達(dá)

2.4分子對(duì)接結(jié)果 分子對(duì)接時(shí)Grid Box分子對(duì)接格點(diǎn)包含整個(gè)模型,分子對(duì)接格點(diǎn)為94×86×113,格點(diǎn)間距為0.375 nm。分別選擇O00206TLR4、P19838NF-κB的晶體結(jié)構(gòu)從uniprot中下載,序列號(hào)分別為4G8A、3GUT,分辨率分別為2.40?、3.59?,結(jié)合能分別為-6.37、-5.31;結(jié)合模式見(jiàn)圖3、圖4。

圖3 白藜蘆醇和TLR4/NF-κB作用的3D圖

圖4 白藜蘆醇和TLR4/NF-κB作用的2D圖

3 討 論

研究認(rèn)為潰瘍性結(jié)腸炎有關(guān),病因與免疫炎癥通路密切相關(guān)〔11〕。目前為止,普遍接受的機(jī)制是在易感人群中腸道免疫的平衡被破壞,從而產(chǎn)生許多促炎因子,導(dǎo)致免疫紊亂〔3〕。且該病極易發(fā)展為結(jié)腸癌,因此,早期的治療顯得至關(guān)重要。但目前的常規(guī)化療藥物有極其嚴(yán)重的耐藥反應(yīng),并且長(zhǎng)時(shí)間使用,還會(huì)伴有副作用,嚴(yán)重影響患者的生存質(zhì)量〔12〕。白藜蘆醇具有吸收快、代謝迅速的特點(diǎn),排泄方式通過(guò)尿液排出,所以其副作用較低〔13〕。Ruan等〔14〕指出,白藜蘆醇通過(guò)調(diào)節(jié)產(chǎn)生炎癥的酶和途徑表現(xiàn)出抗感染活性,并提到其可以抑制許多癌癥和腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移。NF-κB是潰瘍性結(jié)腸炎發(fā)病時(shí)關(guān)鍵的調(diào)控因子,其可以調(diào)控促炎因子的表達(dá),影響炎癥,也有研究發(fā)現(xiàn)TLR4在該病發(fā)生發(fā)展中起到了樞紐的作用〔15,16〕。

本研究首先證實(shí)了大鼠造模成功;其次說(shuō)明了白藜蘆醇對(duì)潰瘍性大鼠有較好的保護(hù)作用。趙承滿等〔17〕認(rèn)為抗炎癥類(lèi)藥物可通過(guò)調(diào)控炎癥介質(zhì)對(duì)該病有一定的治療作用。本研究結(jié)果說(shuō)明白藜蘆醇可能是調(diào)節(jié)TNF-α、IL-6、IL-1β因子的水平對(duì)淋巴細(xì)胞進(jìn)行抑制,避免大鼠發(fā)生免疫反應(yīng);白藜蘆醇可以通過(guò)對(duì)TLR4介導(dǎo)的信號(hào)通路調(diào)控TLR4及NF-κB蛋白及基因表達(dá),減少促炎因子的釋放,從而抑制免疫反應(yīng),減輕大鼠結(jié)腸組織的炎癥損傷。這與顧怡康等〔18〕的研究結(jié)論也基本一致。

姚君等〔19〕研究指出,白藜蘆醇可提高潰瘍性結(jié)腸炎大鼠腸道的IL-10的水平,從而下調(diào)T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)錄分泌的致炎因子的作用,最終抑制細(xì)胞免疫反應(yīng),使腸道免疫炎癥反應(yīng)得到了一定的控制。但是其具體調(diào)控通路并未指出。王堅(jiān)衡等〔20〕研究表明白藜蘆醇可以改善潰瘍性結(jié)腸炎大鼠的病理學(xué)改變,是通過(guò)調(diào)控通過(guò)抑制TLR4活性,以阻止其下游的核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的激活,阻礙其信號(hào)傳遞而實(shí)現(xiàn)的,但對(duì)其炎癥介質(zhì)的研究并不深入。在本研究分子對(duì)接實(shí)驗(yàn)中表明白藜蘆醇具備抵抗?jié)冃越Y(jié)腸炎的作用,其機(jī)制可能與炎癥通路及炎癥介質(zhì)密切相關(guān)。

綜上,白藜蘆醇可以減輕潰瘍性結(jié)腸炎大鼠的腸道炎癥反應(yīng),對(duì)大鼠具有保護(hù)作用,其機(jī)制可能是通過(guò)調(diào)控TLR4/NF-κB信號(hào)通路,從而調(diào)節(jié)炎癥因子實(shí)現(xiàn)的,但本文只是初步探討,還需后續(xù)研究進(jìn)一步驗(yàn)證。