薯蕷皂苷對缺血性腦損傷模型大鼠cAMP/PKA通路、NHE1和GLUTs蛋白的調(diào)控作用

李靜 馬俊遠 何雄文 鄭夢曉 胡曉鳳 牛美蘭

(1黃河科技學院醫(yī)學院,河南 鄭州 450000;2河南省中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院)

缺血性腦卒中是血管狹窄或閉塞造成腦供血不足而引發(fā)的一種常見病,發(fā)病率高,死亡率高。除低糖和低氧外,組織酸化也是誘發(fā)缺血性腦損傷的重要病理因素之一〔1〕。葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白(GLUTs)是葡萄糖跨膜轉(zhuǎn)運的重要載體,缺血性腦損傷會改變其表達及功能,導致葡萄糖轉(zhuǎn)運障礙,三磷酸腺苷(ATP)供應不足,蛋白質(zhì)合成減少,血腦屏障通透性改變引發(fā)中樞神經(jīng)損傷。1型Na+/H+交換蛋白(NHE1)可通過排出H+、移入Na+調(diào)控細胞內(nèi)pH(pHi)和細胞容量〔2〕。文獻報道,缺血性腦損傷時NHE1被過度激活,加劇神經(jīng)毒性和細胞水腫〔3,4〕。薯蕷皂苷是薯蕷科植物的主要活性成分之一,具有抗腫瘤、抗血小板聚集、減少心腦腎的缺血再灌注損傷等多種作用。文獻報道,薯蕷皂苷對大腦中動脈缺血(MCAO)大鼠具有高效的神經(jīng)保護作用〔5〕。本研究旨在探索薯蕷皂苷對MCAO大鼠環(huán)腺苷酸(cAMP)/蛋白激酶(PK)A通路及NHE1、GLUTs蛋白的調(diào)控作用,為其臨床應用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實驗動物 60只SD大鼠,SPF級,雄性,體質(zhì)量280～350 g,購自河南省實驗動物中心,許可證號SCXK(豫)2017-0001,合格證號(NO201720584),飼養(yǎng)于標準實驗動物房。實驗均由鄭州大學倫理委員會批準進行。

1.2主要藥物、試劑及儀器 薯蕷皂苷(質(zhì)量分數(shù)≥98%)由四川省維克奇生物科技有限公司提供;兔抗 NHE1 抗體、兔抗GLUTs抗體、小鼠抗GLUTs抗體、cAMP酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒、大鼠PKA-α ELISA試劑盒均購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司;其余試劑由sigma-aldrich公司提供。

1.3動物分組及復制MCAO模型 將60只大鼠隨機分為假手術(shù)(J)組、模型(MCAO)組、尼莫地平(N)組、薯蕷皂苷高劑量(H)、中劑量(M)、低劑量(L)組,每組10只。參照線栓法復制MCAO模型〔6〕,即用線栓阻塞大鼠右側(cè)大腦中動脈血流,結(jié)扎右側(cè)頸外動脈,切口縫合,持續(xù)栓塞2 h后輕輕拔出線栓。J組分離血管后縫合,不做其他操作。

1.4給藥 造模成功后大鼠經(jīng)灌胃給藥7 d,H、M、L組分別給予20、10、5 mg/ml薯蕷皂苷溶液(10 ml/kg)灌胃,N組給予15 ml/kg尼莫地平灌胃,J組和M組給予等體積0.9%NaCl灌胃,均為1次/d。

1.5神經(jīng)功能評分 參照文獻〔6〕,根據(jù)Longa標準對各大鼠進行神經(jīng)功能評分。

1.6GLUTs和NHE1蛋白水平檢測 大鼠斷頭處死,取少量缺血腦皮質(zhì),提取總蛋白,對蛋白進行定量,常規(guī)法進行Western印跡操作,Odyssey紅外熒光掃描成像系統(tǒng)掃描Image Studio Lite Ver4.0分析圖像結(jié)果。β-actin為內(nèi)參計算相對值,重復3次。

1.7腦脊液中cAMP、PKA含量檢測 取各組大鼠腦脊液樣本室溫平衡,ELISA檢測各組大鼠腦脊液中cAMP、PKA含量。

1.8統(tǒng)計學方法 采用SPSS25.0軟件進行LSD-t檢驗、單因素方差分析及Studentt檢驗。

2 結(jié) 果

2.1各組神經(jīng)功能評分 MCAO組較J組出現(xiàn)明顯的神經(jīng)功能缺損(P<0.01),如左側(cè)前肢抓力減弱,轉(zhuǎn)圈等癥狀。N、H、M組較MCAO組神經(jīng)病學癥狀顯著改善(P<0.01,P<0.05),L組較MCAO組癥狀有減輕,但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。M、L組改善效果顯著較N組差(P<0.05),H與N組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 各組神經(jīng)功能評分、腦脊液中cAMP、PKA含量、腦皮質(zhì)GLUTs、NHE1蛋白表達

2.2薯蕷皂苷對MCAO大鼠腦脊液中cAMP、PKA含量的影響 MCAO組腦脊液中cAMP、PKA含量較J組顯著降低(P<0.01)。與MCAO組相比,N、L、M、H組cAMP、PKA含量升高,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01,P<0.05),H組cAMP、PKA含量與N組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),L、M組顯著低于N組(P<0.01,P<0.05)。見表1。

2.3薯蕷皂苷對MCAO大鼠腦皮質(zhì)GLUTs蛋白表達水平的影響 與J組比較,MCAO組GLUTs表達顯著減少(P<0.01);與MCAO組相比,隨著薯蕷皂苷劑量的增加,GLUTs表達水平逐漸升高,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01,P<0.05);其中L、M組GLUTs表達水平較N組顯著降低(P<0.01,P<0.05),H組GLUTs表達水平與N組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),見表1及圖1。

圖1 各組腦皮質(zhì)GLUTs、NHE1蛋白表達

2.4薯蕷皂苷對MCAO大鼠腦皮質(zhì)NHE1蛋白表達水平的影響 與J組比較,MCAO組NHE1表達顯著增加(P<0.01);與MCAO組相比,M、H組NHE1表達降低,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01,P<0.05),而L組無統(tǒng)計學差異(P>0.05);H組NHE1表達水平顯著較N組高(P<0.05),而L、M組無統(tǒng)計學差異(P>0.05),見表1及圖1。

3 討 論

薯蕷皂苷是甾體皂苷的一種,近年來發(fā)現(xiàn)其具有顯著的改善缺血性腦損傷的作用〔5〕。本研究結(jié)果提示薯蕷皂苷對MCAO模型大鼠有一定的神經(jīng)保護作用。

cAMP是細胞信號傳導的最重要的第二信使之一,常和下游因子PKA形成cAMP/PKA信號系統(tǒng)。近來,細胞實驗和動物實驗證明 cAMP/PKA信號通路在缺血性腦損傷過程中通過維持星形膠質(zhì)細胞和誘導血腦屏障的完整性發(fā)揮神經(jīng)保護效應〔7,8〕。本研究提示,薯蕷皂苷可能通過上調(diào)cAMP/PKA信號通路,保護腦組織。

缺血性腦損傷的發(fā)生與血腦屏障的完整性及轉(zhuǎn)運蛋白表達異常密切相關(guān)〔9,10〕?，F(xiàn)代醫(yī)學在缺血性腦損傷疾病的研究中,關(guān)于能量供應、血液循環(huán)、基因蛋白調(diào)控研究較多,但關(guān)于GLUTs和NHE1表達與缺血性腦損傷的關(guān)系報道甚少。腦的能量代謝過程中,葡萄糖的有氧氧化是其能量的主要來源,但是葡萄糖必須依賴GLUTs的幫助才能通過血腦屏障進入神經(jīng)細胞。缺血性腦損傷破壞了血腦屏障的完整性,導致葡萄糖轉(zhuǎn)運障礙,而cAMP/PKA信號通路的上調(diào)能增強GLUTs的轉(zhuǎn)運功能〔11,12〕。本研究結(jié)果提示,薯蕷皂苷可能通過增強GLUTs的作用,逆轉(zhuǎn)缺血引起的腦內(nèi)葡萄糖匱乏,保障腦細胞葡萄糖的供應,進而改善缺血性腦損傷的程度,此作用可能與cAMP/PKA信號通路的上調(diào)有關(guān)。

NHE1廣泛分布在哺乳動物的中樞神經(jīng)系統(tǒng)中,能夠反向轉(zhuǎn)運Na+和H+,是神經(jīng)元調(diào)節(jié)pHi的最普遍機制,被認為是治療缺血性腦損傷的有意義靶點〔13,14〕。缺氧會降低葡萄糖的糖酵解,使乳酸和H+形成,并向能量匱乏的腦細胞施加酸負荷,進而激活NHE1,導致Na+被轉(zhuǎn)運進入細胞,細胞內(nèi)高Na+驅(qū)動Na+-Ca2+交換,使細胞內(nèi)Ca2+濃度升高,形成胞內(nèi)Ca2+超載,引起細胞內(nèi)離子失衡,改變細胞容量和pHi,破壞血腦屏障,進而引發(fā)腦水腫及神經(jīng)細胞損傷〔15,16〕。本研究提示,薯蕷皂苷可能通過抑制NHE1的作用,改善細胞內(nèi)酸中毒,維持細胞內(nèi)pH,保護腦組織。綜上,薯蕷皂苷可通過上調(diào)cAMP/PKA 信號通路、增強GLUTs表達水平、降低NHE1水平,來緩解缺血性腦損傷程度,保護腦組織。