基于Wnt/β-catenin信號(hào)通路探討膝痹康方在兔膝骨性關(guān)節(jié)炎模型中的作用機(jī)制

宋坤玉 張偉冬 李宗洋 于斌 李裕柳 尹宏兵 莊世偉

(1長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué),吉林 長(zhǎng)春 130000 ;2長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)附屬第三臨床醫(yī)院)

膝骨性關(guān)節(jié)炎(KOA)是一種關(guān)節(jié)退行性疾病,其最顯著的特征是關(guān)節(jié)軟骨的破損和碎裂,包括滑膜、軟骨成分(尤其是Ⅱ型膠原和聚集蛋白)、軟骨下骨和周?chē)浗M織的破壞,同時(shí)伴隨著關(guān)節(jié)功能障礙〔1〕。KOA在60歲以上的老年人中發(fā)生率為30%～50%〔2〕,KOA的發(fā)病機(jī)制錯(cuò)綜復(fù)雜,包括遺傳、肥胖、創(chuàng)傷和年齡等多種因素,均可能導(dǎo)致其發(fā)生。據(jù)相關(guān)研究表明〔3〕,Wnt/β-連環(huán)蛋白(catenin)信號(hào)通路在調(diào)控細(xì)胞增殖和分化方面扮演著至關(guān)重要的角色,該通路的異常會(huì)對(duì)軟骨細(xì)胞的正常代謝產(chǎn)生影響,導(dǎo)致軟骨及軟骨下骨的細(xì)胞表型和分子功能失衡,同時(shí)也會(huì)影響細(xì)胞外基質(zhì)的合成,這在KOA的發(fā)病過(guò)程中具有重要意義。近年來(lái)研究表明,中藥方劑對(duì)于治療KOA有顯著效果。膝痹康方(XBKF)由蒼術(shù)、黃柏、熟地、雞血藤、肉蓯蓉、大黃、牛膝、赤芍、莪術(shù)等藥物組成,具有清熱除濕、補(bǔ)腎活血、消腫止痛的功效。在KOA的長(zhǎng)期臨床治療中,XBKF顯著改善KOA的癥狀,改善患者健康和生活質(zhì)量〔4〕。然而,XBKF治療KOA的具體機(jī)制尚未明確。本實(shí)驗(yàn)觀察XBKF對(duì)KOA兔Wnt/β-catenin信號(hào)通路及細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平及炎性因子的影響,進(jìn)一步探討XBKF對(duì)KOA軟骨的保護(hù)作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)新西蘭大白兔30只,平均體質(zhì)量2.5～3.0 kg,雌雄各半。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物公司:長(zhǎng)生生物科技有限公司,許可證號(hào)SCXK(黑)2017-008。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物環(huán)境:長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心(許可證號(hào)SYXK(吉)2018-0013)。每只單獨(dú)分籠喂養(yǎng),每日定時(shí)更換飼料、飲用水及清理大小便。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物觀察室為開(kāi)放式,溫度、照明、通風(fēng)、噪音等條件控制在所規(guī)定范圍內(nèi)。實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核通過(guò)(倫理批號(hào):2022-644)。

1.2實(shí)驗(yàn)藥物 主要藥物:XBKF(配比如下薏苡仁50 g、蒼術(shù)、黃柏、熟地各25 g,雞血藤、肉蓯蓉各20 g,牛膝、赤芍、莪術(shù)、蘇木各15 g,大黃、木通、地龍、茯苓、甘草各10 g、蜈蚣2條、全蝎3 g)上述中藥選自長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)附屬第三臨床醫(yī)院中藥房,將所購(gòu)各位藥材加水后,兩次煎煮合并提取液,減壓濃縮為含生藥1 g/ml,于4 ℃冰箱中儲(chǔ)存?zhèn)溆?。塞?lái)昔布膠囊(輝瑞制藥有限公司;規(guī)格:0.2 g/粒,批號(hào):J20140072)。

1.3主要試劑 木瓜蛋白酶(公司:Biosharp,批號(hào):BS190-25g),L-半胱氨酸(公司:Biosharp,批號(hào):BS181-25g),速眠新Ⅱ(公司:圣達(dá)動(dòng)物藥品有限公司,批號(hào):070031582,),舒泰50(公司:Virbac China,批號(hào):外獸藥證號(hào)43號(hào)),蘇木素-伊紅(HE)高清恒染、Wnt3a兔抗體、β-catenin兔抗體、Bcl-2兔抗體、Bax兔抗體(公司Servicebio,批號(hào):G1076、GB113750、GB12015、GB112495、GB11247-1),兔IL-1β、IL-6、TNF-α酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒(MM-0305O1,MM-0302O1,MM-0240O1,均購(gòu)買(mǎi)于江蘇酶免實(shí)業(yè)有限公司)。

1.4主要儀器 動(dòng)物跑步機(jī)(宇晟YS-J100)、酶標(biāo)儀(公司:Rayto,型號(hào):RT-6100)、超聲波細(xì)胞破碎儀(公司:寧波新芝生物,型號(hào):JY92-11N)、臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(公司:DRAGONLAB,型號(hào):D3024R)、烤箱(公司:天津市萊玻瑞儀器設(shè)備有限公司,型號(hào):GFL-230)、化學(xué)發(fā)光儀(公司:CLINX,型號(hào):6100)正置光學(xué)顯微鏡(公司:日本尼康,型號(hào):Nikon Eclipse E100)等。

1.5實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組 將30只新西蘭健康大耳白兔采用隨機(jī)數(shù)字表法,分為空白組、模型組、塞來(lái)昔布組、膝痹康方低劑量(XBKF-L)組、膝痹康方高劑量(XBKF-H)組,每組6只。

1.6KOA模型制備 適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w后,除空白組外,其余4組參照文獻(xiàn)方法〔5〕進(jìn)行造模:精確稱取木瓜蛋白酶0.4 g、L-半胱氨酸 36 mg,共同置于離心管中,加入生理鹽水 10 ml,均勻混合后4 ℃低溫冷藏保存。以兔子右膝建立模型:推去右腿兔毛,以髕骨下極髕韌帶外緣為進(jìn)針點(diǎn)。分別于第1、4、7天注入配置好的溶液,并每日定時(shí)強(qiáng)迫大白兔在動(dòng)物跑步機(jī)活動(dòng)15 min。連續(xù)驅(qū)趕14 d后,空白組和造模組分別隨機(jī)抽取1只大白兔進(jìn)行X光拍照觀察兔右膝關(guān)節(jié),建立穩(wěn)定的 KOA 兔模型。

1.7藥物干預(yù) 藥物治療于造模成功后第1天開(kāi)始,各組兔連續(xù)灌胃4 w,給藥劑量按照徐叔云等〔6〕主編的《藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》算出大白兔的等效劑量。每只兔每天灌胃液體量20 ml?？瞻捉M、模型組每只每日等量生理鹽水灌胃;塞來(lái)昔布組每只每日給予24 mg/(kg·d)塞來(lái)昔布灌胃;XBKF-L組每只每日給予8.7 g/(kg·d)膝痹康濃縮液灌胃;XBKF-H組每只每日給予17.4 g/(kg·d)膝痹康濃縮液灌胃;(分別相當(dāng)于臨床等效劑量1、2 倍)。

1.8觀察兔一般情況 觀察實(shí)驗(yàn)兔造模與給藥期間膝關(guān)節(jié)形態(tài),活動(dòng)度和色澤等改變,及有無(wú)發(fā)熱現(xiàn)象,并對(duì)其精神狀態(tài)、進(jìn)食狀況、毛發(fā)光澤及疏密程度,實(shí)驗(yàn)兔步態(tài)和大小便色澤性狀進(jìn)行觀察。

1.9觀察指標(biāo)及方法 連續(xù)灌胃4 w,末次給藥后稱量每只兔的體重,右后肢肌肉注射進(jìn)行麻醉,麻醉劑(舒泰50和速眠新Ⅱ,配比 6∶1),0.35 ml/kg,腹主動(dòng)脈采血,4 ℃、1 500 r/min分離血清;在二氧化碳下安樂(lè)死后,無(wú)菌條件下分離膝關(guān)節(jié),將部分膝關(guān)節(jié)放入含4%多聚甲醛的EP管中,用于后續(xù)組織形態(tài)學(xué)觀察;部分膝關(guān)節(jié)放入凍存管中,置于-80 ℃冰箱中保存,用于后續(xù)蛋白檢測(cè)。

1.10HE染色觀察KOA兔關(guān)節(jié)軟骨的病理變化及Makin評(píng)分 取各組兔右側(cè)股骨頂點(diǎn)鈣化層以上軟骨制作標(biāo)本,使用10%的乙二胺四乙酸(EDTA)脫鈣液進(jìn)行脫鈣,接著進(jìn)行脫水、浸蠟、矢狀位包埋、切片(3 μm)。通過(guò)使用HE染技術(shù)色,在顯微鏡下觀察,并以Mankin評(píng)分進(jìn)行評(píng)估〔7〕。

1.11ELISA檢測(cè)兔血清中炎性因子IL-1β、IL-6和TNF-α表達(dá) 取各組兔血清樣品,按照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)操作,終止反應(yīng)后測(cè)定每孔450 nm最大吸收波長(zhǎng)的OD值,并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算出樣品中IL-1β、IL-6、TNF-α的濃度。

1.12Western印跡檢測(cè)兔關(guān)節(jié)軟骨組織中Wnt3a、β-catenin 、Bcl-2及Bax蛋白表達(dá) 取各組兔右膝關(guān)節(jié)軟骨組織標(biāo)本,進(jìn)行勻漿、離心處理后收集上清液,依次經(jīng)測(cè)定蛋白濃度、上樣及電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉和孵育抗體、滴加發(fā)光液后檢測(cè)膜上蛋白,獲取目的蛋白顯色條帶并讀取灰度值。以β-actin作為內(nèi)參,分析各組兔關(guān)節(jié)軟骨組織中Wnt3a、β-catenin、Bcl-2及Bax蛋白相對(duì)表達(dá)水平。

1.13統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS25.0軟件進(jìn)行方差分析、t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1各組大白兔一般情況觀察 空白組大白兔未觀察到明顯異常,毛發(fā)茂密順滑,飲水?dāng)z食正常、大小便正常。各組造模的大白兔經(jīng)造模后出現(xiàn)膝關(guān)節(jié)紅腫明顯,輕微發(fā)熱、伴有不同程度跛行、飲水?dāng)z食量下降,精神萎靡及體質(zhì)量減輕;灌胃開(kāi)始后的2 w,模型組、XBKF-L組膝關(guān)節(jié)腫脹程度較膝XBKF-H組及塞來(lái)昔布組更明顯,各藥物組兔活動(dòng)量較前改善、精神萎靡好轉(zhuǎn)、飲水?dāng)z食量增加。造模結(jié)束后,經(jīng)X線掃描:與空白組大白兔相比較,模型組大白兔右膝關(guān)節(jié)后可見(jiàn)骨間隙明顯變窄,骨質(zhì)增生有骨贅生成,說(shuō)明模型構(gòu)建成功。見(jiàn)圖1。

圖1 空白組與模型組右膝關(guān)節(jié)X線

2.2各組大白兔關(guān)節(jié)軟骨組織病理觀察結(jié)果及Mankin評(píng)分 空白組軟骨表面光滑,細(xì)胞排列整齊,未見(jiàn)裂隙,各層組織完好均未見(jiàn)破壞,潮線清晰完整;與空白組相比,模型組軟骨表面膜樣結(jié)構(gòu)破壞,軟骨細(xì)胞變少,甚者軟骨層出現(xiàn)裂隙樣破壞,Mankin評(píng)分明顯升高(P<0.05);經(jīng)藥物治療后,與模型組相比,塞來(lái)昔布組軟骨表面較為光滑,軟骨細(xì)胞增多,部分軟骨核皺縮;XBKF-L組軟骨表面較為粗糙,細(xì)胞排列不齊,軟骨厚薄不均;XBKF-H組軟骨表面較光滑,有少量毛刺,細(xì)胞排列較為整齊,接近于空白組;塞來(lái)昔布組、XBKF-L組、XBKF-H組Mankin評(píng)分均明顯降低(P<0.05)。見(jiàn)圖2、表1。

表1 各組軟骨組織Mankin評(píng)分、血清中IL-1β、IL-6和TNF-α含量、Wnt3a、β-catenin 、Bcl-2及Bax 蛋白表達(dá)比較

箭頭所指為軟骨損傷處圖2 各組軟骨組織病理(HE染色)

2.3各組血清中IL-1β、IL-6和TNF-α含量比較 與空白組比較,模型組IL-1β、IL-6和TNF-α含量均顯著升高(P<0.05);與模型組比較,經(jīng)各藥物組治療后兔血清中IL-1β、IL-6和TNF-α含量均顯著降低(P<0.05)。見(jiàn)表1。

2.4各組膝軟骨組織中Wnt /β-catenin信號(hào)通路蛋白及凋亡蛋白表達(dá) 與空白組比較,模型組軟骨組織中Wnt3a、β-catenin、Bax蛋白表達(dá)量顯著升高,Bcl-2蛋白表達(dá)量顯著降低(P<0.05);經(jīng)各藥物組治療后,與模型組比較,各藥物治療組 Wnt3a、β-catenin 、Bax蛋白表達(dá)量顯著降低,Bcl-2蛋白表達(dá)量顯著升高(P<0.05)。見(jiàn)表1、圖3。

1～5:空白組,模型組,塞來(lái)昔布組,XBKF-L組,XBKF-H組圖3 各組軟骨組織中Wnt3a、β-catenin 、Bcl-2及Bax蛋白表達(dá)

3 討 論

KOA導(dǎo)致活動(dòng)嚴(yán)重受限甚至無(wú)法移動(dòng)〔8〕。KOA的確切發(fā)病機(jī)制至今仍未被完全闡明。XBKF是臨床治療KOA等疾病常用方,其在臨床應(yīng)用中表現(xiàn)出顯著的療效,具有除濕止痛的功效。XBKF中重用北蒼術(shù)、黃柏為君,以清熱解毒、祛風(fēng)除濕,二藥合而為君,具有利濕、瀉火、止痛、解毒的功效,清熱燥濕力強(qiáng),標(biāo)本兼顧,北蒼術(shù)辛甘祛濕,脾胃最喜,故亦入之;臣以牛膝、薏苡仁、熟地黃、雞血藤、赤芍、莪術(shù)、蘇木以滋陰補(bǔ)血,舒筋活絡(luò),益精填髓,具有補(bǔ)肝腎,強(qiáng)筋骨的功效;佐以大黃、木通、地龍、茯苓、蜈蚣及全蝎,大黃瀉下攻積,清熱逐瘀,涼血解毒,滌蕩濕熱瘀結(jié)之毒,木通利尿通淋,通經(jīng)除煩,地龍、蜈蚣、全蝎走竄性強(qiáng),破血通絡(luò),以息風(fēng)鎮(zhèn)痙,通絡(luò)止痛,攻毒散結(jié),茯苓利水滲濕,健脾寧心,共為佐藥;使以甘草,以清熱益氣,調(diào)和諸藥,避免清熱消腫之力過(guò)盛而傷及正氣。通過(guò)本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn),XBKF在治療膝骨關(guān)節(jié)炎中發(fā)揮的作用與非甾體抗炎藥基本一致,鑒于中藥復(fù)方具有副作用較小、不良反應(yīng)發(fā)生率低,適合長(zhǎng)期服用的優(yōu)點(diǎn),這對(duì)KOA疾病治療藥物的選擇有一定意義。

Wnt/β-catenin信號(hào)通路在KOA的進(jìn)展中扮演著重要的調(diào)控角色,對(duì)于關(guān)節(jié)軟骨的形成、分化及軟骨細(xì)胞的凋亡和增殖具有至關(guān)重要的影響〔9〕。該信號(hào)通路不僅參與了多種組織病理過(guò)程如炎癥反應(yīng)及退行性改變,還影響著骨關(guān)節(jié)炎和骨性關(guān)節(jié)炎患者體內(nèi)細(xì)胞因子表達(dá)水平及基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)活性〔10〕。在軟骨增生期間,Wnt信號(hào)對(duì)軟骨細(xì)胞分化起重要的調(diào)節(jié)作用,根據(jù)研究結(jié)果,Wnt3a被認(rèn)為是關(guān)節(jié)軟骨領(lǐng)域中最具代表性的Wnt之一〔11〕。在KOA中,Wnt3a被激活,從而促進(jìn)了MMPs的表達(dá),導(dǎo)致軟骨組織的退化和炎癥反應(yīng)的發(fā)生〔12〕。目前認(rèn)為它參與了多種炎癥反應(yīng)及退變機(jī)制,并通過(guò)影響細(xì)胞因子和黏附分子等起著調(diào)節(jié)作用。而在Wnt/β-catenin信號(hào)通路中,β-catenin則扮演著不可或缺的角色〔13〕。本研究說(shuō)明,XBKF可能通過(guò)抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路激活,從而抑制細(xì)胞凋亡,延緩疾病進(jìn)程。

膝骨關(guān)節(jié)炎的主要特征在于軟骨組織中IL-1β、IL-6、TNF-α等細(xì)胞因子的增加,炎癥在骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生發(fā)展中起核心作用〔14〕。IL-1β通過(guò)抑制Ⅱ型膠原和聚集蛋白聚糖的分泌,誘導(dǎo)MMP-1、MMP-3、MMP13的表達(dá)上調(diào),從而阻斷軟骨細(xì)胞的合成并破壞軟骨組織〔15〕。此外,還可引起滑膜增生及關(guān)節(jié)腔積液。IL-6的作用在于刺激成纖維細(xì)胞的生成,同時(shí)促進(jìn)了OA中IL-1β和TNF-α等細(xì)胞因子的破壞能力,從而促進(jìn)了軟骨基質(zhì)的快速降解〔16〕。因此認(rèn)為,骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病機(jī)制可能與其炎性介質(zhì)及相關(guān)因子的過(guò)度釋放密切相關(guān)。在骨關(guān)節(jié)炎的進(jìn)展過(guò)程中,炎癥反應(yīng)持續(xù)存在,而由于炎性刺激所引起的疼痛則是其主要表現(xiàn)之一。因此,減輕炎癥損傷已成為治療該病的關(guān)鍵。近年來(lái),許多學(xué)者對(duì)緩解及預(yù)防KOA進(jìn)行了深入研究。大量研究表明,改善KOA的機(jī)制與降低關(guān)節(jié)液或血清中的IL-1β、IL-6和TNF-α水平有關(guān)〔8,17～20〕。目前臨床上對(duì)于膝骨關(guān)節(jié)炎患者常采用抗炎、鎮(zhèn)痛及改善關(guān)節(jié)功能的系統(tǒng)治療方案來(lái)控制病情的發(fā)展。本研究說(shuō)明XBKF對(duì)于膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎有較好的抗炎效果,且未發(fā)現(xiàn)對(duì)胃腸道等副作用。