基于MCP-1/CCR2通路研究miR-28-5p對老齡自發(fā)性高血壓大鼠的干預(yù)作用

張賢春 馮靜 陳海明 (海口市人民醫(yī)院全科醫(yī)學科,海南 ?？?570311)

高血壓中老年自發(fā)性高血壓為特殊類型,易引起老齡人群冠心病、心功能不全等疾病〔1〕。高血壓為心臟重構(gòu)誘發(fā)原因之一,炎癥是高血壓患者心臟重構(gòu)中的重要部分〔2〕。miR-28-5p位于染色體3q28上,參與炎癥及氧化還原反應(yīng)〔3〕。有研究顯示〔4〕,高血壓會刺激T細胞浸潤心臟,導致促炎和抗炎因子失衡,促進T細胞浸潤心臟,在高血壓心臟炎癥微環(huán)境中,從而加重心臟炎癥反應(yīng)。單核細胞趨化蛋白(MCP)-1具有促炎作用,由單核細胞分泌,通過與CC趨化因子受體(CCR)2結(jié)合,發(fā)揮生物學功能〔5〕。高血壓心臟重構(gòu)過程中,誘使巨噬細胞產(chǎn)生MCP-1,浸潤心臟,加重炎癥反應(yīng),MCP-1/CCR2信號軸在免疫缺陷性疾病、移植物免疫反應(yīng)、腫瘤等中具有廣泛的生物學效應(yīng),發(fā)揮重要作用〔6〕。本研究旨在探討基于MCP-1/CCR2通路miR-28-5p對自發(fā)性高血壓的干預(yù)及作用機制。

1 對象與方法

1.1動物與分組 6只SPF級雄性Wistar大鼠,體質(zhì)量250～280 g,鼠齡:15～18個月,由北京維通利華實驗技術(shù)有限公司提供,實驗動物許可證號為SCXK(京)2016-0006,設(shè)為正常組。18只雄性老齡自發(fā)性高血壓大鼠,體質(zhì)量240～270 g,鼠齡16～19個月;購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司,合格證號:SCXK(京)2015-0001。置于海南醫(yī)學院實驗動物中心正常喂養(yǎng),自由飲食飲水,光照12 h/12 h,適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后,進行實驗研究。將18只老齡自發(fā)性高血壓大鼠隨機分為模型組、對照組、miR-28-5p組。正常組不進行處理,模型組和對照組給予同等體積的生理鹽水干預(yù),對照組將1 μl的miR-28-5p腺相關(guān)病毒注射到大鼠體內(nèi),此腺相關(guān)病毒為無意義序列,miR-28-5p組將1 μl的miR-28-5p腺相關(guān)病毒注射到大鼠體內(nèi),所有大鼠連續(xù)干預(yù)2 w。

1.2miR-28-5p表達檢測 將大鼠固定,于隱靜脈處采血1 ml,miR-28-5p表達采用熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)法檢測,離心半徑為13.5 cm,3 000 r/min的轉(zhuǎn)速,離心15 min,將上層血清轉(zhuǎn)移到干凈的EP管中,-80 ℃封存,血清、變性溶液、酸化苯酚氯仿混勻1 min,在室溫下高速離心6 min,提取上清液并且記錄其體積,再往上清液中加入1/3體積濃度為100%的乙醇充分混勻以后通過第一個過濾柱,收集過濾液并記錄其體積,再次往過濾液中加入其體積2/3濃度為100%的乙醇,充分混勻后通過第二個過濾柱,清洗過濾柱,再用95 ℃無RNA酶水洗脫出miR-28-5p,循環(huán)參數(shù):95 ℃ 10 min,95 ℃ 15 ms,60 ℃ 1 min,一共40個循環(huán),使用2-ΔΔCt法計算miR-28-5p表達。

1.3心功能相關(guān)指標檢測 大鼠麻醉、固定,切開皮膚于頸部,分離皮膚、肌肉,暴露氣管和右頸動脈,切開氣管,行機械通氣,于切開右頸總動脈插入0.3%肝素生理鹽水的PE-50導管,連接生理記錄儀,導管插入大鼠左心室,記錄左室收縮壓(LVSP)、左室舒張末壓(LVEDP)、左室內(nèi)壓最大上升速率(+dp/dt)、左室內(nèi)壓最大下降速率(-dp/dt)水平。

1.4炎癥因子相關(guān)指標檢測 取材時端頭取血5 ml,待凝固后,低溫離心3 500 r/min,15 min分離血清,低溫保存待測。測定時,采用酶聯(lián)免疫法,酶聯(lián)免疫試劑盒:白細胞介素(IL)-1、IL-6、腫瘤壞死因子(TNF)-α,TSLP試劑盒(上海仁捷生物科技有限公司,規(guī)格型號:96t/48t),ECP試劑盒(上海烜雅生物科技有限公司,規(guī)格型號:96t,貨號:XY-SJH-XS1066)。具體步驟依照試劑盒說明書嚴格操作。

1.5采用Western印跡檢測MCP-1及CCR2 取各組大鼠血清,根據(jù)總蛋白體取試劑盒提取血清蛋白質(zhì)濃度。行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE),分離蛋白。轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜后,封閉2 h,洗膜10 min,共3次,MCP-1、CCR2的Ⅰ抗按適比例4 ℃孵育過夜,洗膜3次,加入辣根過氧化物酶,標記的大鼠抗兔MCP-1、CCR2孵育2 h,β-actin為內(nèi)參,洗膜3×10 min,顯色,膠片曝光,以目的條帶β-actin進行分析。

1.6病理學觀察 禁食不禁水12 h后處死大鼠,迅速鈍性剝離心臟組織,取左心室心肌組織,置入2.5%戊二醛中固定,4 ℃保存,行石蠟包埋、切片,進行蘇木素-伊紅(HE)染色。光學顯微鏡400倍拍照,分析圖片,計算心肌細胞面積。

1.7統(tǒng)計學處理 采用SPSS26.0軟件進行t檢驗和方差分析。

2 結(jié) 果

2.1各組miR-28-5p表達水平比較 與正常組相比,模型組、對照組、miR-28-5p組miR-28-5p表達明顯較高(P<0.05);與模型組相比,對照組、miR-28-5p組miR-28-5p表達明顯較低(P<0.05);與對照組相比,miR-28-5p組miR-28-5p表達明顯較低(P<0.05)。見表1。

表1 各組miR-28-5p表達及心功能相關(guān)指標水平

2.2miR-28-5p對老齡自發(fā)性高血壓大鼠心功能相關(guān)指標水平的影響 與正常組相比,模型組、對照組、miR-28-5p組LVSP、+dp/dtmax、-dp/dtmax水平明顯較低,LVEDP水平明顯較高(P<0.05);與模型組相比,對照組、miR-28-5p組LVSP、+dp/dtmax、-dp/dtmax水平明顯較高,LVEDP水平明顯較低(P<0.05);與對照組相比,miR-28-5p組LVSP、+dp/dtmax、-dp/dtmax水平明顯較高,LVEDP水平明顯較低(P<0.05)。見表1。

2.3miR-28-5p對肺炎支原體感染模型大鼠炎癥因子的影響 與正常組相比,模型組、對照組、miR-28-5p組IL-1、IL-6、TNF-α水平明顯較高(P<0.05);與模型組相比,對照組、miR-28-5p組IL-1、IL-6、TNF-α水平明顯較低(P<0.05);與對照組相比,miR-28-5p組IL-1、IL-6、TNF-α水平明顯較低(P<0.05)。見表2。

表2 各組炎癥因子、MCP-1/CCR2通路蛋白水平

2.4miR-28-5p對老齡自發(fā)性高血壓模型大鼠MCP-1/CCR2通路蛋白的影響 與正常組相比,模型組、對照組、miR-28-5p組MCP-1、CCR2水平顯著較高(P<0.05);與模型組相比,對照組、miR-28-5p組MCP-1、CCR2水平顯著較低(P<0.05);與對照組相比,miR-28-5p組MCP-1、CCR2水平顯著較低(P<0.05)。見表2、圖1。

圖1 Western印跡檢測各組MCP-1、CCR2表達

2.5各組心肌組織病理學 正常組心肌組織排列整齊、清晰,未見纖維化,間質(zhì)無充血腫脹,未見炎性細胞浸潤;模型組心肌組織排列紊亂、不清,細胞肥大,可見點狀壞死灶,纖維化明顯,間質(zhì)充血腫脹,炎性細胞浸潤;對照組病理改變較模型組改善;miR-28-5p組病理改變較對照組改善。見圖2。

圖2 各組心肌組織病理(HE染色,×200)

3 討 論

老年人常見的心血管疾病中,自發(fā)性高血壓在所有疾病死亡中居首位〔7〕。高血壓主要危害是造成靶器官的損害,而心臟是靶器官之一,高血壓發(fā)展中伴隨炎癥反應(yīng),損害心、腦、腎等器官,是心血管疾病發(fā)病的首要原因〔8,9〕。

miRNA具有調(diào)控功能,達到調(diào)控靶基因表達,可通過對靶mRNA的直接裂解或抑制靶基因翻譯,在機體各種疾病的發(fā)生、發(fā)展中具有重要的調(diào)節(jié)作用〔10〕。miR-28-5p是位于染色體3q27-28的LPP基因〔11〕。MCP-1/CCR2信號軸對多種炎癥細胞具有可趨化作用,通過作用于多種細胞至炎癥病灶,發(fā)揮免疫作用〔12〕。本研究說明,miR-28-5p與老齡自發(fā)性高血壓之間密切相關(guān)。通過介導MCP-1/CCR2通路來干預(yù)老齡自發(fā)性高血壓。

心臟事件中,心室肥厚和心肌纖維化是獨立危險因素〔13〕。本研究說明,老齡自發(fā)性高血壓大鼠模型存在心功能變化和左心室肥厚,即存在左心室結(jié)構(gòu)與功能上的重構(gòu)。經(jīng)miR-28-5p干預(yù)后,LVSP、+dp/dtmax、-dp/dtmax、LVEDP水平均顯著升高,改善大鼠的肺功能,高血壓左心室后負荷異常的狀態(tài)下,室壁張力降低、維持心臟功能代償性發(fā)生心肌肥厚,心肌順應(yīng)性下降,結(jié)締組織量增加,心臟舒張功能受損,心功能異?！?4,15〕。

有研究表明〔16〕,IL-1、IL-6分泌可由血管內(nèi)皮細胞和血管平滑肌細胞進行,參與心血管疾病的發(fā)生、發(fā)展,介導在血管內(nèi)的炎癥反應(yīng)及免疫應(yīng)答中發(fā)揮作用,在血管平滑肌細胞DNA促進合成及增殖,與原發(fā)性高血壓的發(fā)生有著密切的關(guān)系。TNF具有多方面功能,可引起組織出血壞死〔17〕。TNF不僅參與免疫調(diào)節(jié)和炎癥反應(yīng),而且對心血管系統(tǒng)產(chǎn)生一定的影響,在高血壓的病理進程中起重要作用〔18〕。本研究顯示,miR-28-5p介導MCP-1及其受體CCR2發(fā)生趨化作用,引起單核細胞浸潤進而引發(fā)高血壓炎癥的關(guān)鍵,是導致高血壓炎癥反應(yīng)的重要途徑。MCP-1和CCR2結(jié)合后,激活絲裂原活化蛋白激酶級聯(lián)反應(yīng),介導轉(zhuǎn)錄因子,急性心血管事件發(fā)生的主要原因是炎性細胞因子和基質(zhì)金屬蛋白酶導致的〔19,20〕。本研究進一步證明,miR-28-5p可能通過調(diào)控MCP-1/CCR2信號通路參與調(diào)控自發(fā)性高血壓進程中炎癥反應(yīng)。