基于p38MAPK/NF-κB信號(hào)通路探討針刺調(diào)控線粒體自噬促進(jìn)大鼠功能性消化不良發(fā)生發(fā)展的機(jī)制

郭炳濤 李雪松 黃亞蓉 范乾 雷旭東

(甘肅省腫瘤醫(yī)院 1血液病科,甘肅 蘭州 730050;2消化腫瘤內(nèi)一科;3慶陽市中醫(yī)院針灸推拿科;4甘肅省腫瘤醫(yī)院臨床營(yíng)養(yǎng)科)

功能性消化不良為臨床常見多發(fā)病,主要是由胃腸動(dòng)力紊亂導(dǎo)致的,患者長(zhǎng)期處于焦慮、抑郁狀態(tài),可導(dǎo)致功能性消化不良的發(fā)生〔1,2〕使線粒體結(jié)構(gòu)、數(shù)目、功能改變,對(duì)線粒體數(shù)量進(jìn)行控制,影響細(xì)胞的分化〔3〕。中醫(yī)認(rèn)為使用針刺治療,可對(duì)低度炎癥、腦腸軸、生態(tài)失調(diào)、胃酸分泌進(jìn)行調(diào)節(jié),使功能性失調(diào)患者胃腸道得到改善〔4〕。p38絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)/核因子(NF)-κB信號(hào)通路為機(jī)體內(nèi)重要通路,可對(duì)細(xì)胞周期進(jìn)行調(diào)節(jié),在多種細(xì)胞過程中具有重要作用〔5〕。臨床中暫未有研究顯示針刺可通過調(diào)控p38MAPK/NF-κB介導(dǎo)線粒體自噬對(duì)功能性消化不良造成影響。本文基于p38MAPK/NF-κB信號(hào)通路探討針刺調(diào)控線粒體自噬對(duì)功能性消化不良大鼠的影響。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:選取SPF級(jí)SD大鼠50只,體質(zhì)量(223.25±12.05)g,購(gòu)自深圳市領(lǐng)先醫(yī)療服務(wù)有限公司,動(dòng)物許可證號(hào):SYXK(粵)2022-0295,所有大鼠在相對(duì)濕度65%、室溫22～25 ℃下飼養(yǎng),每日光照12 h,飼養(yǎng)期間大鼠自由飲水。本次實(shí)驗(yàn)操作均嚴(yán)格參照動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理要求相關(guān)規(guī)定進(jìn)行。

1.2分組與建模 選取10只大鼠作為對(duì)照組,其余40只大鼠參照張萍等〔6〕研究中的方法構(gòu)建功能性消化不良模型,采用0.1%碘乙酰胺水溶液進(jìn)行灌胃,使用鉗夾夾住大鼠尾巴中外1/3處,使大鼠憤怒反抗、撕咬,注意避免大鼠尾部破皮,連續(xù)刺激大鼠30 min,后將大鼠放置與疲勞轉(zhuǎn)棒儀,以35 r/min轉(zhuǎn)動(dòng)10 min,3次/d,每次間隔4 h,連續(xù)造模10 d,造模過程中大鼠皮膚抓傷后使用碘伏消毒,防止感染,共有30大鼠建模成功,將建模成功大鼠分為模型組、藥物對(duì)照組、針刺組各10只。

1.3給藥干預(yù) 造模成功后,對(duì)大鼠進(jìn)行治療,對(duì)照組、模型組不接受治療,藥物對(duì)照組采用莫沙必利治療,針刺組選取大鼠太沖穴、足三里穴,將大鼠束縛,使用25、13 mm毫針進(jìn)針,太沖穴采用13 mm毫針進(jìn)針深度為3～5 mm,足三里穴采用25 mm毫針進(jìn)針深度為7～15 mm,1次/d,治療14 d。

1.4樣本采集 采集大鼠尾靜脈血,取3 ml,設(shè)置離心半徑5 cm,以3 000 r/min的轉(zhuǎn)速進(jìn)行離心處理15 min,將上層血清分離,-80 ℃保存。

1.5一般情況、病理組織學(xué)觀察 處死前對(duì)各組大鼠活動(dòng)、形態(tài)、納食、毛發(fā)光澤度等一般情況進(jìn)行觀察,后將大鼠斷頸處死,取大鼠胃組織,剪取0.5 g腎臟組織,于-80 ℃儲(chǔ)存,在多聚甲醛固定4 h,進(jìn)行脫水處理,石蠟包埋,制作5 μm切片,再次脫蠟、脫水,采用蘇木素-伊紅(HE)染色試劑盒染色,光學(xué)顯微鏡觀察其病理變化。

1.6飲水量、進(jìn)食量、胃腸動(dòng)力檢測(cè) 末次治療后,對(duì)大鼠禁食、禁水24 h,給予大鼠飼料、水,大素飲水、進(jìn)食后,測(cè)量剩余水量、食量,飲水量=給予量-剩余量,進(jìn)食量=給予量-剩余量。在200 ml蒸餾水中加入10 g羧甲基纖維素鈉,后加入奶粉16 g、淀粉、糖各8 g、碳墨4 ml,攪拌均勻,制成黑色半固體營(yíng)養(yǎng)糊,以10 ml/kg灌胃,30 min后,對(duì)大鼠進(jìn)行麻醉、開腹,將其胃賁門、幽門結(jié)扎,取大鼠胃部,使用濾紙吸干,進(jìn)行稱重,沿胃部大彎將胃體剪開,清洗干凈內(nèi)容物,即為胃凈重。胃排空率=1-(胃全重-胃凈重)/胃全重×100%。同時(shí)將小腸分割,測(cè)量幽門、盲腸距離,并測(cè)量幽門、黑色半固體糊前沿距離。小腸推進(jìn)率=(小腸全長(zhǎng)-推進(jìn)長(zhǎng)度)/小腸全長(zhǎng)×100%。

1.7炎癥因子水平檢測(cè) 取各組大鼠靜脈血清,采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)白細(xì)胞介素(IL)-6、IL-1β、腫瘤壞死因子(TNF)-α水平,使用碳酸鹽緩沖液,將待測(cè)液稀釋,后倒入孔中,4 ℃下過夜處理,后棄去,洗凈,孔中加入1%牛血清白蛋白(BSA),37 ℃孵育60 min,后棄去,洗凈,稀釋抗血清,每孔加入0.1 ml,37 ℃下進(jìn)行輕微搖晃40 min,后棄去,沖洗干凈,使用四甲基聯(lián)苯胺(TMB)進(jìn)行顯色處理,后在450 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)OD值,查出IL-6、IL-1β、TNF-α表達(dá)水平。試驗(yàn)重復(fù)進(jìn)行5次。

1.8線粒體自噬檢測(cè) 取大鼠組織切片,放于pH為8.0的乙二胺四乙酸(EDTA)抗原修復(fù)盒,使用微波加熱8 min,8 min后使用低火微波加熱7 min,冷卻后,放入pH7.0磷酸鹽緩沖液(PBS),晃動(dòng)洗滌3次,使用組織化筆在周圍畫圈,后放入雙氧水溶液,室溫下孵育25 min,放于緩沖液洗滌,后加入BSA,封閉處理30 min,加入一抗、二抗、CY3-酪酰胺信號(hào)放大(TSA),進(jìn)行微波處理,后在切片圈滴加4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染液,放置5 min,進(jìn)行沖洗,顯微鏡下觀察切片情況。

1.9線粒體膜電位變化比例、ATP、ROS檢測(cè) 取大鼠胃組織,加入8 ml純水稀釋JC-1,后加入2 ml JC-1染色緩沖液配成JC-1染色工作液,按照1∶1 000的比例在細(xì)胞培養(yǎng)液中加入氧化磷酸化解耦聯(lián)劑,將其稀釋至10 μmol/L,對(duì)貼壁細(xì)胞、懸浮細(xì)胞、純化線粒體膜電位進(jìn)行檢測(cè),顯微鏡下進(jìn)行觀察。采用ELISA檢測(cè)三磷酸腺苷(ATP)、活性氧(ROS)水平,檢測(cè)方法同1.5。

1.10p38MAPK/NF-κB通路檢測(cè) 取各組胃組織,放置于冰上溶解25 min,加入9倍生理鹽水,放入組織勻漿中充分均漿,使用BCA試劑盒檢測(cè)p38MAPK、NF-κB蛋白含量,分析蛋白表達(dá)情況。試驗(yàn)重復(fù)進(jìn)行5次。

1.11統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS19.0軟件進(jìn)行方差分析。

2 結(jié) 果

2.1一般情況觀察 對(duì)照組活動(dòng)靈敏,毛發(fā)順滑、皮膚光亮,眼角未出現(xiàn)分泌物;模型組毛色暗淡,毛發(fā)雜亂,易驚、易怒,且形體消瘦,對(duì)外界聲音較為敏感;藥物對(duì)照組、針刺組皮毛較為順滑、光亮,對(duì)外界聲音敏感狀態(tài)好轉(zhuǎn),眼部分泌物正常,活動(dòng)量增加。

2.2組織學(xué)觀察 如圖1所示,對(duì)照組胃黏膜表面平整光滑,具有少量的中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞,腺體規(guī)則排列;模型組胃黏膜表明受到損傷,出現(xiàn)炎性浸潤(rùn),中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞增加,腺體排列不規(guī)則;藥物對(duì)照組、針刺組胃黏膜表面光滑,炎性浸潤(rùn)減輕,中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞減少,腺體較為規(guī)則,且針刺組改善程度>藥物對(duì)照組。

圖1 各組胃黏膜組織病理特征(HE染色,×100)

2.3各組飲水量、進(jìn)食量對(duì)比 如表1所示,與對(duì)照組相比,模型組、藥物對(duì)照組、針刺組飲水量、進(jìn)食量明顯下降(P<0.05);與模型組相比,藥物對(duì)照組、針刺組飲水量、進(jìn)食量明顯增加(P<0.05);與藥物對(duì)照組相比,針刺組飲水量、進(jìn)食量明顯增加(P<0.05)。

表1 各組飲水量、進(jìn)食量胃腸動(dòng)力、炎癥因子水平對(duì)比

2.4各組胃腸動(dòng)力對(duì)比 如表1所示,與對(duì)照組相比,模型組、藥物對(duì)照組、針刺組胃排空率、小腸推進(jìn)率明顯下降(P<0.05);與模型組相比,藥物對(duì)照組、針刺組胃排空率、小腸推進(jìn)率明顯增加(P<0.05);與藥物對(duì)照組相比,針刺組胃排空率、小腸推進(jìn)率明顯增加(P<0.05)。

2.5各組炎癥因子水平對(duì)比 如表1所示,與對(duì)照組相比,模型組、藥物對(duì)照組、針刺組IL-6、IL-1β、TNF-α明顯升高(P<0.05);與模型組相比,藥物對(duì)照組、針刺組IL-6、IL-1β、TNF-α明顯降低(P<0.05);與藥物對(duì)照組相比,針刺組IL-6、IL-1β、TNF-α明顯降低(P<0.05)。

2.6各組線粒體自噬對(duì)比 如表2所示,與對(duì)照組相比,模型組、藥物對(duì)照組、針刺組細(xì)胞色素(CYT)-C、微管結(jié)合蛋白1A/1B-輕鏈(LC)3B表達(dá)明顯升高(P<0.05);與模型組相比,藥物對(duì)照組、針刺組CYT-C、LC3B表達(dá)明顯降低(P<0.05);與藥物對(duì)照組相比,針刺組CYT-C、LC3B表達(dá)明顯降低(P<0.05)。

表2 各組線粒體自噬、膜電位變化、ATP、ROS水平及p38MAPK/NF-κB通路蛋白表達(dá)對(duì)比

2.7各組線粒體膜電位變化比例、ATP、ROS對(duì)比 如表2所示,與對(duì)照組相比,模型組、藥物對(duì)照組、針刺組線粒體膜電位變化比例、ROS水平明顯升高,ATP水平明顯降低(P<0.05);與模型組相比,藥物對(duì)照組、針刺組線粒體膜電位變化比例、ROS水平明顯降低,ATP水平明顯升高(P<0.05);與藥物對(duì)照組相比,針刺組線粒體膜電位變化比例、ROS水平明顯降低,ATP水平明顯升高(P<0.05)。

2.8各組p38MAPK/NF-κB通路蛋白表達(dá)量對(duì)比 如表2、圖2所示,與對(duì)照組相比,模型組、藥物對(duì)照組、針刺組p38MAPK、NF-κB蛋白表達(dá)量明顯升高(P<0.05);與模型組相比,藥物對(duì)照組、針刺組p38MAPK、NF-κB蛋白表達(dá)量明顯降低(P<0.05);與藥物對(duì)照組相比,針刺組p38MAPK、NF-κB表達(dá)量明顯降低(P<0.05)。

圖2 各組p38MAPK/NF-κB信號(hào)通路蛋白表達(dá)

3 討 論

功能性消化不良為臨床常見功能性胃腸病,該病的發(fā)生與內(nèi)臟敏感性增高、胃腸激素、神經(jīng)遞質(zhì)變化、胃腸動(dòng)力障礙、自主神經(jīng)功能紊亂、遺傳基因等有關(guān)〔7〕。功能性消化不良反復(fù)發(fā)作,可對(duì)患者生理、身體健康造成影響,臨床常用治療藥物,可導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)、消化道不良反應(yīng),故尋找新的治療方式較為重要〔8,9〕。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為〔10〕,功能性消化不良屬于“胃脘痛”“痞滿”范疇,主要為脾胃受損、肝氣不達(dá)導(dǎo)致的,臨床應(yīng)以治療脾胃、肝為主。中醫(yī)針灸為非藥物治療方式,采用針灸對(duì)足三里、太沖穴進(jìn)行刺激,可對(duì)胃腸功能進(jìn)行調(diào)節(jié),使大鼠胃腸動(dòng)力得到改善,機(jī)體內(nèi)炎癥反應(yīng)降低,修復(fù)黏膜屏障,臨床使用效果較好〔11〕。本研提顯示,采用針刺對(duì)功能性消化不良大鼠進(jìn)行治療,可提高大鼠的飲水、進(jìn)食量,促進(jìn)大鼠的線粒體自噬,使大鼠胃腸動(dòng)力得到改善,臨床使用效果較好。

臨床研究顯示〔12〕,在功能性消化不良發(fā)病過程中,多為胃動(dòng)力障礙,機(jī)體發(fā)病后,可降低胃腸道平滑肌細(xì)胞的能量代謝。細(xì)胞內(nèi)重要的能力代謝主要發(fā)生于線粒體,線粒體氧化磷酸化可合成ATP,并在ROS的產(chǎn)生中具有重要作用,線粒體自噬后,可對(duì)細(xì)胞內(nèi)線粒體數(shù)量進(jìn)行調(diào)節(jié),使線粒體功能保持正?！?3〕。機(jī)體內(nèi)ATP的合成下降,ROS生成過多后,可促進(jìn)機(jī)體內(nèi)氧化應(yīng)激損傷,使線粒體過度自噬,減弱胃腸動(dòng)力,使胃腸節(jié)律發(fā)生紊亂〔14〕。本研究結(jié)果表明,針刺可減少線粒體自噬,減輕線粒體功能損傷,改善胃腸動(dòng)力障礙。

功能性消化不良臨床發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,主要為內(nèi)臟超敏導(dǎo)致的胃腸道功能下降,使胃腸道運(yùn)動(dòng)、感覺功能發(fā)生異常,增加胃腸道黏膜的通透性,并引發(fā)胃腸道局部炎癥反應(yīng)〔15〕。機(jī)體內(nèi)胃腸道黏膜下神經(jīng),多發(fā)生炎癥反應(yīng),引發(fā)胃腸道平滑肌異常,導(dǎo)致機(jī)體的消化不良,且黏膜出現(xiàn)炎癥反應(yīng),可使胃黏膜組織肥大細(xì)胞密度增加,促進(jìn)機(jī)體內(nèi)炎癥介質(zhì)的釋放,使胃電節(jié)律發(fā)生紊亂,造成胃排空發(fā)生異?！?6〕。IL-6為炎癥細(xì)胞因子,其表達(dá)水平與胃腸道功能障礙呈正相關(guān),IL-6表達(dá)水平降低后,患者胃腸動(dòng)力逐漸恢復(fù),IL-1β可對(duì)機(jī)體內(nèi)炎癥反應(yīng)進(jìn)行反應(yīng),并可對(duì)炎癥細(xì)胞、免疫細(xì)胞造成刺激,促進(jìn)機(jī)體內(nèi)炎癥介質(zhì)的釋放,使炎癥反應(yīng)加重,IL-1β可對(duì)機(jī)體的水、鈉吸收能力下降,導(dǎo)致患者腹瀉,使胃腸功能發(fā)生紊亂,TNF-α在炎癥過程中具有重要作用,可使中性粒細(xì)胞的吞噬能力提高,并促使其黏附能力,使細(xì)胞的炎癥反應(yīng)加重,可誘發(fā)腸黏膜炎癥反應(yīng)〔17〕。本研究顯示,采用針刺治療,可使功能性消化不良大鼠的機(jī)體免疫功能增強(qiáng),降低炎癥反應(yīng),改善大鼠胃黏膜炎癥反應(yīng)。

胃腸道功能障礙可導(dǎo)致功能性消化不良的發(fā)生,胃腸道功能障礙包括胃排空延遲、餐后胃運(yùn)動(dòng)障礙、胃肌電異?！?8〕。p38MAPK為MAPK家族成員,p38MAPK激活后,可轉(zhuǎn)移至機(jī)體內(nèi)細(xì)胞核。研究顯示,p38MAPK可使蛋白質(zhì)發(fā)生磷酸化,其蛋白質(zhì)底物包括磷酸酶、生長(zhǎng)因子受體、蛋白激酶、細(xì)胞骨架蛋白,且底物可介導(dǎo)p38信號(hào)在細(xì)胞周期調(diào)節(jié)、存活、增殖、死亡等多種功能〔19〕。NF-κB可對(duì)免疫應(yīng)答、炎癥反應(yīng)進(jìn)行調(diào)節(jié),在機(jī)體胃腸系統(tǒng)中,NF-κB可使受損腸上皮再生,抑制腸損傷、壞死〔20〕。本研究顯示,采用針刺治療,可抑制p38MAPK/NF-κB通路的激活,改善胃黏膜炎癥反應(yīng)。

綜上,功能性消化不良可引發(fā)線粒體自噬,促進(jìn)炎癥因子表達(dá),對(duì)患者胃黏膜造成損傷,經(jīng)針刺治療后,功能性消化不良大鼠線粒體自噬、胃腸動(dòng)力改善,炎癥因子水平降低,其機(jī)制可能與調(diào)控p38MAPK/NF-κB通路有關(guān)。