肝郁脾虛證腹瀉型IBS模型大鼠結(jié)腸緊密連接蛋白、AQP3及AQO4的變化

劉澤偉 于嬌嬌 馬曉蕊 趙光奧 宋艷琪 劉玉玲 王迎寒

(1承德醫(yī)學(xué)院中藥系2018級(jí),河北 承德 067000;2河北省中藥研究與開(kāi)發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 承德醫(yī)學(xué)院中藥研究所 河北省中醫(yī)藥抗癡呆重點(diǎn)研究室)

腹瀉型腸易激綜合征(D-IBS)是以“腹瀉”為主要臨床癥狀的一種功能性消化道疾病,是腸易激綜合證(IBS)的一種常見(jiàn)類(lèi)型。近年來(lái),隨著生活負(fù)擔(dān)加重及工作壓力的增大,D-IBS發(fā)病率呈現(xiàn)逐漸上升趨勢(shì)〔1〕。D-IBS屬于中醫(yī)學(xué)中“泄瀉”“濡瀉”“飧泄”等范疇〔2〕,且病位在腸,與肝、脾、腎三臟密切相關(guān)。中醫(yī)臨床上將其分為濕熱阻滯型、肝郁脾虛型、脾腎陽(yáng)虛型及脾氣虛弱型,其中肝郁脾虛型是最為常見(jiàn)的一種〔3〕。中醫(yī)認(rèn)為:脾氣虛是D-IBS發(fā)病之根本——脾虛則運(yùn)化無(wú)權(quán),使水液聚而成濕,濕盛則濡瀉;肝氣郁結(jié),橫逆犯脾,肝木乘土,是為本病的主要病機(jī)。水通道蛋白(AQPs)廣泛分布于腸道黏膜,具有維持腸道細(xì)胞內(nèi)外環(huán)境穩(wěn)態(tài)和調(diào)控腸神經(jīng)功能的作用〔4〕。隨著研究的不斷深入,有學(xué)者發(fā)現(xiàn)AQP在腸道表達(dá)變化與腸道水液吸收之間可能存在著重要關(guān)系〔5,6〕,因此,結(jié)腸AQPs表達(dá)變化成為研究D-IBS的新熱點(diǎn)〔7,8〕。本研究揭示肝郁脾虛證D-IBS模型大鼠結(jié)腸緊密連接蛋白表達(dá)、AQP3及AQP4變化。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性SD大鼠90只,體質(zhì)量(200 ±20)g,SPF級(jí),購(gòu)自北京華阜康實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司,合格證號(hào)為SCXK(京)2019-0008。實(shí)驗(yàn)前1 w,所有大鼠飼養(yǎng)于承德醫(yī)學(xué)院屏障環(huán)境動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室,使大鼠適應(yīng)實(shí)驗(yàn)環(huán)境。本實(shí)驗(yàn)獲得承德醫(yī)學(xué)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn),批準(zhǔn)日期2020年10月10日,批準(zhǔn)編號(hào)為CDMULAC-20201008-003。

1.2藥品與試劑 番瀉葉(安國(guó)市昌達(dá)藥業(yè)有限公司,批號(hào)1305001)。兔抗大鼠緊密連接蛋白抗體、AQP3抗體、AQP4抗體、β-actin抗體(北京博奧森生物技術(shù)有限公司,貨號(hào)分別為:bs-10011R、bs-1253R、bs-10713R、bs-0061R);兔免疫組化(SP)試劑盒(北京康為世紀(jì)生物科技有限公司,批號(hào)54140);山羊抗兔IgG-HRP二抗(北京博奧森生物技術(shù)有限公司,貨號(hào):bs-0295G-HRP);二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒(北京普利萊基因技術(shù)有限公司,貨號(hào):P1511);還原型5×十二烷基硫酸鈉(SDS)上樣緩沖液(碧云天生物研究所,貨號(hào):P0015);脫脂奶粉(BD公司,批號(hào):4239539);化學(xué)發(fā)光試劑(Thermo Scientific,P1020);TEMED(sigma,M146);30%丙烯酰胺(碧云天生物技術(shù)研究所,批號(hào)20201021);過(guò)硫酸銨(索萊寶,批號(hào):1024D0313);預(yù)染Marker(Thermo Scientific,批號(hào):00389282);0.45 μm聚偏氟乙烯(PVDF)膜(Millipore)。

1.3儀器 KD-TS3A自動(dòng)組織脫水機(jī)(浙江省金華科迪儀器設(shè)備有限公司);KD-BMIII生物組織冷凍包埋機(jī)、KD-2258組織切片機(jī)、KD-P攤片機(jī)(金華科迪儀器設(shè)備有限公司);GZX-9240MBE電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海博遠(yuǎn)實(shí)業(yè)有限公司);BX53顯微醫(yī)學(xué)影像工作站(奧林巴斯);Sceintz-48高通量組織研磨器(寧波新芝生物科技股份有限公司);Velocity18r臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(Dynamica);WD-9405B水平搖床、DYY-7C轉(zhuǎn)印電泳儀電源、DYCZ-40D迷你轉(zhuǎn)印電泳儀、DYCZ-24DN迷你雙垂直電泳儀(北京市六一儀器廠);CP214電子分析天平〔奧豪斯儀器(上海)有限公司〕;Tanon 6100電化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(北京原平皓生物技術(shù)有限公司)。

1.4D-IBS大鼠模型的復(fù)制〔9〕隨機(jī)將90只大鼠分為9組,每組10只,分別為正常組,脾虛組(1,2,3,4組),肝郁組(1,2組)和肝郁脾虛組(1,2組)。實(shí)驗(yàn)前1 d禁食不禁水,從實(shí)驗(yàn)第1天開(kāi)始,脾虛組和肝郁脾虛組大鼠每天給予番瀉葉煎劑(生藥6 g/kg)灌胃;肝郁組大鼠則用透明膠帶束縛前上肢及胸部,每天1 h。第7天脾虛1組給予番瀉葉,檢測(cè)5 h內(nèi)稀便級(jí)后處死取結(jié)腸;肝郁1組在檢測(cè)完稀便級(jí)(檢測(cè)時(shí)間與脾虛組一致)后處死取結(jié)腸。第14天脾虛2組和肝郁2組在檢測(cè)稀便級(jí)后處死取結(jié)腸;從第15天開(kāi)始,肝郁脾虛組在給予番瀉葉后,立即用透明膠帶束縛大鼠前上肢,胸部及肩部持續(xù)1 h。第21天肝郁脾虛1組與脾虛3組在檢測(cè)稀便級(jí)后處死取結(jié)腸;第28天,肝郁脾虛2組、脾虛4組和正常組在檢測(cè)稀便級(jí)后處死取結(jié)腸。正常組全程給予等體積的生理鹽水。

1.5番瀉葉灌胃后5 h內(nèi)的稀便級(jí)的測(cè)量〔10〕用稀便級(jí)表示大鼠腹瀉的程度,以稀便污染濾紙形成的污跡的大小定級(jí),從0～7共8個(gè)等級(jí)(污跡直徑<1 cm為0級(jí),1～2 cm為1級(jí),依次類(lèi)推),統(tǒng)計(jì)時(shí)逐個(gè)統(tǒng)計(jì)每堆稀便的級(jí)數(shù),然后將所有級(jí)數(shù)相加除以稀便的個(gè)數(shù)即稀便級(jí)。

1.6取材與處理 分別于建模前、建模7,14,21,28 d處死相對(duì)應(yīng)組(D0,D7,D14,D21,D28)大鼠,取結(jié)腸。各組結(jié)腸分為若干小段,每組3只大鼠的一小段結(jié)腸經(jīng)4%多聚甲醛固定后,脫水,石蠟包埋,切片,用作免疫組織化學(xué)染色;其余結(jié)腸液氮速凍后-80 ℃凍存,后續(xù)用作Western印跡實(shí)驗(yàn)。

1.7緊密連接蛋白、AQP3、AQP4陽(yáng)性表達(dá) 采用免疫組織化學(xué)法進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)腸組織脫水包埋并切片后常規(guī)脫臘至水,抗原修復(fù)(95～98 ℃)30 min、正常山羊血清封閉(37 ℃)30 min,一抗孵育(一抗1∶200,PBS作為陰性對(duì)照)4 ℃過(guò)夜、二抗37 ℃孵育2 h,二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色,在顯微鏡下控制顯色時(shí)間。以胞質(zhì)中出現(xiàn)棕黃色反應(yīng)物為陽(yáng)性反應(yīng),無(wú)棕黃色的反應(yīng)物為陰性,棕黃色越深,說(shuō)明陽(yáng)性反應(yīng)越強(qiáng)。應(yīng)用IPP圖像分析軟件對(duì)目的蛋白的表達(dá)進(jìn)行半定量分析。每張片子隨機(jī)選取6個(gè)不相互重疊的高倍視野,拍照,計(jì)算積分吸光度(IA),均值作為該大鼠目的蛋白表達(dá)的數(shù)值。

1.8Western印跡檢測(cè)緊密連接蛋白、AQP3、AQP4表達(dá) 各組大鼠分別取結(jié)腸一段,重約100 mg,加入500 μl蛋白提取液,用高通量組織研磨器充分勻漿(50 Hz,30 s,6次),冰上震蕩裂解30 min,4 ℃,12 000 r/min離心5 min,取上清,分裝備用。用BCA蛋白定量試劑盒檢測(cè)各樣本蛋白濃度,每個(gè)樣本蛋白量上樣為50 μg(5%濃縮膠,12.5%分離膠),電泳至溴酚蘭剛跑出邊緣終止;電壓分別為:濃縮膠80 V,分離膠120 V。400 mA恒流轉(zhuǎn)膜3 h,一抗(緊密連接蛋白和AQP3為1∶200;AQP4為1∶1 000;β-actin為1∶2 000)4 ℃孵育過(guò)夜,二抗(1∶2 000)室溫下孵育2 h,滴加電化學(xué)發(fā)光液,充分反應(yīng)1 min后用Tanon 6100電化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)拍照,曝光時(shí)間10 s。圖片用WD-94BA凝膠成像系統(tǒng)自帶軟件進(jìn)行半定量分析,測(cè)定目的條帶光密度值。各目的蛋白的光密度與β-actin條帶光密度的比值乘以100%作為該蛋白表達(dá)水平。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS21.0軟件進(jìn)行方差分析,LSD-t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠灌服番瀉葉后5 h內(nèi)稀便級(jí)的變化 與正常組比較,除肝郁1組外,各模型組灌服番瀉葉后5 h內(nèi)稀便級(jí)顯著升高(P<0.01)。與脾虛3組、肝郁1組比較,肝郁脾虛1組灌服番瀉葉后5 h內(nèi)稀便級(jí)顯著升高(P<0.05,P<0.01)。與脾虛4組、肝郁2組比較,肝郁脾虛2組灌服番瀉葉后5 h內(nèi)稀便級(jí)顯著升高(P<0.01)。見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠灌服番瀉葉后5 h內(nèi)稀便級(jí)、結(jié)腸緊密連接蛋白、AQP3、AQP4陽(yáng)性表達(dá)及蛋白的變化

2.2各組結(jié)腸緊密連接蛋白、AQP3、AQP4陽(yáng)性表達(dá)的變化 與正常組比較,各模型組緊密連接蛋白、AQP3、AQP4陽(yáng)性表達(dá)顯著下降(P<0.05,P<0.01)。與脾虛3組、肝郁1組比較,肝郁脾虛1組緊密連接蛋白、AQP3、AQP4陽(yáng)性表達(dá)顯著降低(P<0.01)。與脾虛4組、肝郁2組比較,肝郁脾虛2組緊密連接蛋白、AQP3、AQP4陽(yáng)性表達(dá)顯著下降(P<0.05,P<0.01)。見(jiàn)表1。

2.3各組結(jié)腸緊密連接蛋白、AQP3、AQP4表達(dá)量的變化 與正常組、肝郁組比較,各模型組緊密連接蛋白、AQP3、AQP4表達(dá)量顯著下降(P<0.01)。與脾虛3組、肝郁1組比較,肝郁脾虛1組緊密連接蛋白、AQP3、AQP4表達(dá)量顯著降低(P<0.01,P<0.05)。與脾虛4組、肝郁2組比較,肝郁脾虛2組緊密連接蛋白、AQP3、AQP4陽(yáng)性表達(dá)顯著下降(P<0.05,P<0.01)。見(jiàn)表1,圖1。

1～9:正常組、脾虛1組、脾虛2組、脾虛3組、脾虛4組、肝郁1組、肝郁2組、肝郁脾虛1組、肝郁脾虛2組圖1 各組結(jié)腸緊密連接蛋白、AQP3,AQP4表達(dá)變化

3 討 論

眾多研究表明,D-IBS是IBS各亞型中發(fā)病率最高的一型〔11〕,本病的發(fā)生與患者素體脾胃虛弱、飲食不節(jié)、情志不遂、水濕不行、日久失治等因素所致脾運(yùn)化失司,腸道功能紊亂密切相關(guān)。中醫(yī)認(rèn)為:脾氣虛弱及肝氣郁結(jié)存在于D-IBS的整個(gè)病程,因此,肝郁脾虛是導(dǎo)致D-IBS的重要因素〔12〕。目前關(guān)于D-IBS的辨證分型并不完全一致,但肝郁脾虛為各分型中最為重要的一種。根據(jù)中醫(yī)理論,在生理上:脾主運(yùn)化、升清,一方面,對(duì)飲食物進(jìn)行消化和吸收,并轉(zhuǎn)輸其精微物質(zhì)以營(yíng)養(yǎng)全身;另一方面對(duì)進(jìn)入機(jī)體的水液進(jìn)行吸收、轉(zhuǎn)輸和布散。胃主受納與腐熟水谷,以降為和,即胃將食物腐熟后通降下行。脾與胃相表里,脾升胃降協(xié)調(diào)平衡,則消化功能正常,精微物質(zhì)及水液得以正常輸布。肝為將軍之官,主疏泄,調(diào)暢氣機(jī),喜條達(dá),惡遏郁,肝的疏泄功能正常,是脾胃正常升降的重要條件。在病理上,素體脾虛或思慮傷脾或飲食不節(jié)、勞逸失調(diào),藥、食損脾或患者濕邪久居,脾胃為濕邪所傷,納化不健,精微不布,清濁不分,合污而下,致成瀉泄,出現(xiàn)納呆腹脹,便溏不爽,腸鳴矢氣,大便溏薄等癥。《內(nèi)經(jīng)》云“濕勝則濡瀉”,《難經(jīng)》謂“濕多成五泄”,故前人有“無(wú)濕不成瀉”之說(shuō)。肝在志為怒,如憂郁惱怒,精神緊張等情志的過(guò)激會(huì)傷及肝,引起肝氣郁結(jié)。脾屬土,肝屬木,二者是相克的關(guān)系,一旦出現(xiàn)脾土虛弱,則“土虛木乘”的病理變化隨即發(fā)生,使脾不升清、胃不降濁,從而加重脾虛癥狀,出現(xiàn)“胸脅脹滿竄痛,善太息,情懷抑郁,或急躁易怒,或納呆腹脹,便溏不爽,腸鳴矢氣,或腹痛欲瀉,瀉后痛減,或便溏不爽,舌苔白,脈弦或緩弱”等癥狀。如《醫(yī)方考》中云:“瀉責(zé)之脾,痛責(zé)之肝,肝責(zé)之實(shí),脾責(zé)之虛,脾虛肝實(shí),故令痛瀉”。上述即肝郁脾虛證的發(fā)生及主要癥狀,與D-IBS癥狀相符。

目前,D-IBS肝郁脾虛證的動(dòng)物模型構(gòu)建思路可大致概括為:根據(jù)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)理論復(fù)制疾病模型,然后在疾病模型的基礎(chǔ)上根據(jù)中醫(yī)理論復(fù)制證候模型〔13〕。所采用的方法有母嬰分離、束縛應(yīng)激、番瀉葉灌胃及乙酸灌腸或幾種因素聯(lián)合應(yīng)用等,均能復(fù)制出符合D-IBS某種癥狀或病機(jī)的動(dòng)物模型,與人類(lèi)D-IBS存在著或多或少的差異。其中,番瀉葉聯(lián)合束縛應(yīng)激的方法建立的D-IBS大鼠模型符合肝郁脾虛證病機(jī)及腹瀉癥狀,適于本實(shí)驗(yàn)研究。

AQPs廣泛分布于機(jī)體中,目前在消化系統(tǒng)中至少發(fā)現(xiàn)了9種AQPs亞型〔14〕,它們可參與水液轉(zhuǎn)運(yùn)、分泌、吸收及調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、遷移、凋亡、吞噬,并調(diào)控神經(jīng)功能〔15〕。研究發(fā)現(xiàn),AQP3可調(diào)節(jié)結(jié)腸中的糞便含水量并參與介導(dǎo)腸腔與血管之間的水液轉(zhuǎn)運(yùn),AQP4參與了跨細(xì)胞水液轉(zhuǎn)運(yùn);AQP3和AQP4表達(dá)的變化可影響胃腸道分泌、吸收功能〔14,16〕,它們參與了D-IBS的發(fā)病過(guò)程。由腸上皮緊密連接蛋白(claudins)與閉合蛋白(occludin),連接黏附分子(JAMs)及閉合小環(huán)蛋白(ZO)-1、ZO-2和ZO-3等組成的緊密連接,對(duì)腸黏膜起保護(hù)作用。如緊密連接受損,則腸黏膜受損,導(dǎo)致腸黏膜通透性增加,這是包括腹瀉在內(nèi)的多種腸道疾病的共同特征〔17〕。

前期研究發(fā)現(xiàn),在模型建立過(guò)程中,不同時(shí)間點(diǎn)大鼠結(jié)腸運(yùn)動(dòng)指數(shù)、內(nèi)臟敏感性、5-羥色胺,促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素及其受體的表達(dá)均有顯著變化〔18〕。本研究結(jié)果提示,大鼠經(jīng)給予番瀉葉灌胃后,苦寒的番瀉葉引起腹瀉,長(zhǎng)期應(yīng)用(28 d),損及脾氣,出現(xiàn)脾氣虛證,而從第15天開(kāi)始聯(lián)合束縛應(yīng)激,持續(xù)14 d,模擬了人類(lèi)工作生活中的精神刺激因素,從而逐漸形成肝郁脾虛證,且在肝郁脾虛證形成過(guò)程中,肝郁對(duì)脾虛證在癥狀上起到了加重作用。本研究結(jié)果推測(cè):肝郁脾虛證候引起的腹瀉癥狀與緊密連接蛋白及AQPs之間存在密切聯(lián)系,且束縛應(yīng)激可通過(guò)影響AQPs來(lái)增加脾虛模型大鼠的腹瀉程度。但是,對(duì)D-IBS肝郁脾虛證的研究還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠,就本課題而言,尚有許多與腸黏膜屏障功能相關(guān)指標(biāo)還未檢測(cè),這也是課題組今后的重點(diǎn)工作。