基于Keap1/Nrf2信號(hào)通路探討葛根芩連湯治療潰瘍性結(jié)腸炎小鼠腸黏膜損傷機(jī)制

張兆鵬 李秋英 于子晴 張茹 李婷 郭軍鵬 (長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué),吉林 長(zhǎng)春 130117)

潰瘍性結(jié)腸炎(UC)是臨床上常見胃腸道炎癥性疾病之一,近些年其發(fā)病率呈逐年增加的趨勢(shì)〔1〕。目前除了傳統(tǒng)的皮質(zhì)類固醇和氨基水楊酸治療外,臨床上新出現(xiàn)的一些治療藥物對(duì)于UC的治療效果仍然不是很理想〔2〕。而且,UC反復(fù)發(fā)作的特性使得很多藥物作用效果明顯降低,給患者造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)和精神壓力。葛根芩連湯(GGQL)由葛根、黃連、黃芩、炙甘草四味中藥組成,臨床常用于醫(yī)治與濕熱證相關(guān)的腹瀉患者〔3〕。但是,GGQL治療UC的具體作用機(jī)制還不清楚。本研究通過觀察疾病指數(shù)、結(jié)腸形態(tài)學(xué)、血清炎癥因子和氧化應(yīng)激信號(hào)通路蛋白表達(dá)情況,探討GGQL對(duì)UC的治療作用及機(jī)制,為臨床應(yīng)用GGQL治療UC提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料與試劑 葡聚糖硫酸鈉(DSS)購(gòu)自MP Biomedicals公司;葛根、黃連、黃芩、炙甘草購(gòu)自長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院;柳氮磺吡啶腸溶片(SASP)購(gòu)自上海福達(dá)制藥有限公司(批號(hào):22200107);白細(xì)胞介素(IL)-1β、IL-6、腫瘤壞死因子(TNF)-α試劑盒購(gòu)于北京華英生物試劑有限公司;抗體Kelch-樣ECH相關(guān)蛋白(Keap)1、核因子-E2相關(guān)因子(Nrf)2、ERK1/2、p-ERK1/2、β-肌動(dòng)蛋白(actin)均購(gòu)自Proteintech生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.2藥品及制備 依據(jù)藥典及臨床用藥確定葛根芩蓮湯劑量:葛根15 g、黃連9 g、黃芩9 g、甘草6 g。根據(jù)人與小鼠體表面積換算用藥劑量。水煎煮2次,合并濾液,減壓濃縮,4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3動(dòng)物分組及給藥 50只雄性BALB/C小鼠,隨機(jī)分為正常(Normal)組、模型(Model)組、GGQL低(GGQL-L)、高(GGQL-H)劑量組、SASP組。2.5%DSS水溶液自由飲用連續(xù)7 d,制備病理模型。造模成功后,Normal組和Model 組給予生理鹽水,GGQL-L、GGQL-H組分別灌胃給予50、150 g/kg GGQL藥物濃縮液,SASP組每日灌胃給予SASP 200 mg/kg,連續(xù)7 d。

1.4疾病活動(dòng)指數(shù)(DAI)評(píng)分 每天定時(shí)測(cè)量小鼠體質(zhì)量,觀察大便性狀、血便狀態(tài),并根據(jù)其狀態(tài)進(jìn)行賦分:體質(zhì)量下降0%,大便正常,無大便隱血,計(jì)0分;體質(zhì)量下降1%～5%,大便松散,大便隱血陽性,計(jì)1分;體質(zhì)量下降6%～10%,稀便,隱血強(qiáng)陽性,計(jì)2分;體質(zhì)量下降11%～15%,稀水樣腹瀉,肉眼輕微血便,計(jì)3分;體質(zhì)量下降≥16%,水樣腹瀉,肉眼血便,計(jì)4分。

1.5酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)血清中炎癥因子表達(dá) 取材前12 h禁食不禁水,取血清,按照試劑盒說明檢測(cè)血清IL-1β、IL-6、TNF-α含量。

1.6結(jié)腸組織病理形態(tài)學(xué)檢測(cè) 取回腸末端至直腸遠(yuǎn)端區(qū)域,測(cè)量其長(zhǎng)度。取部分結(jié)腸制備病理切片,觀察形態(tài)學(xué)變化。

1.7Western印跡法檢測(cè)結(jié)腸組織相關(guān)蛋白表達(dá) 縱向打開結(jié)腸,用磷酸鹽緩沖液輕輕沖洗干凈,置于-80 ℃冷凍保存。Western印跡法檢測(cè)Keap1、Nrf2、ERK1/2、p-ERK1/2的表達(dá)情況。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS26.0和GraphPadPrism8.01 軟件進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1各組體質(zhì)量變化比率、DAI評(píng)分、結(jié)腸長(zhǎng)度比較 與Normal組比較,Model組體質(zhì)量變化比率顯著降低,DAI評(píng)分顯著升高,結(jié)腸長(zhǎng)度顯著縮短(P<0.05)。與Model組比較,GGQL-L、GGQL-H、SASP組體質(zhì)量變化比率顯著升高,DAI評(píng)分顯著降低,結(jié)腸長(zhǎng)度顯著增長(zhǎng)(P<0.05)。見表1、圖1。

圖1 各組結(jié)腸長(zhǎng)度

表1 各組體質(zhì)量變化比率、DAI評(píng)分、結(jié)腸長(zhǎng)度、血清相關(guān)指標(biāo)比較

2.2GGQL對(duì)UC小鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α的影響 與Normal組比較,Model組IL-1β、TNF-α、IL-6顯著升高(P<0.05)。與Model組比較,GGQL-L、GGQL-H、SASP組IL-1β、TNF-α、IL-6顯著降低(P<0.05,P<0.01)。見表1。

2.3GGQL對(duì)UC小鼠結(jié)腸組織形態(tài)學(xué)的影響 Normal組結(jié)腸組織正常,細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整。Model組結(jié)腸組織水腫,單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞浸潤(rùn),有的形成淋巴濾泡,嚴(yán)重者黏膜脫落。GGQL-L組、GGQL-H組、SASP組結(jié)腸組織炎癥反應(yīng)減輕,細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整。見圖2。

圖2 各組結(jié)腸組織形態(tài)(HE染色,大圖×10,小圖×40)

2.4GGQL對(duì)UC小鼠結(jié)腸組織Nrf2、Keap1、ERK1/2、p-ERK1/2蛋白的影響 與Normal組比較,Model組Keap1表達(dá)明顯升高,Nrf2、p-ERK1/2表達(dá)顯著降低(P<0.05)。與Model組相比,GGQL-L組、GGQL-H組、SASP組Keap1表達(dá)明顯降低,Nrf2、p-ERK1/2表達(dá)顯著升高(P<0.05)。各組ERK1/2表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖3、表2。

圖3 GGQL對(duì)UC小鼠結(jié)腸組織NRF2、Keap1、ERK1/2、p-ERK1/2蛋白的影響

表2 GGQL對(duì)UC小鼠結(jié)腸組織Nrf2、Keap1、ERK1/2、p-ERK1/2蛋白的影響

3 討 論

目前臨床上5-氨基水楊酸(ASA)是治療UC的常用藥物〔4,5〕。然而,5-ASA副作用明顯且復(fù)發(fā)率很高〔6〕。包括中草藥在內(nèi)的補(bǔ)充和替代藥物最近在治療UC方面引起了廣泛的關(guān)注。中藥因其具有多靶點(diǎn)功能和多途徑作用機(jī)制等特點(diǎn),臨床上利用中藥治療UC取得較好療效〔7〕。

葛根、黃芩、甘草中含有豐富的黃酮類化合物,其藥理作用主要有解熱、降壓、抑制血小板聚集、松弛胃腸平滑肌的作用,而且具有很強(qiáng)的抗炎、抗菌和抗病毒的療效。黃連中含有大量的小檗堿,具有抗?jié)?、抑制胃酸分泌、保護(hù)胃黏膜、抗炎鎮(zhèn)痛功效〔8〕。本實(shí)驗(yàn)研究也表明GGQL能夠有效減輕UC小鼠結(jié)腸黏膜炎癥,降低DAI評(píng)分,明顯改善結(jié)腸黏膜形態(tài)學(xué)改變,改善腹瀉癥狀、恢復(fù)腸黏膜損傷。

IL-1β、IL-6、TNF-α是機(jī)體受到刺激后產(chǎn)生的致炎細(xì)胞因子,其主要作用是可促進(jìn)炎細(xì)胞浸潤(rùn),加劇炎癥反應(yīng)。Keap1/Nrf2是氧化應(yīng)激信號(hào)通路關(guān)鍵分子。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,GGQL能夠促進(jìn)Nrf2入核,靶向抗氧化基因,通過抗氧化而發(fā)揮抗炎作用〔9〕,具有很強(qiáng)的抗炎特性〔10〕。絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號(hào)通路與UC的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)〔11〕。細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)是MAPK信號(hào)通路系統(tǒng)重要成員,其活性形式p-ERK在炎癥反應(yīng)過程中具有非常重要的地位〔12〕。本研究發(fā)現(xiàn),ERK1/2分子參與了結(jié)腸黏膜抗氧化和抗炎作用。

綜上所述,GGQL能夠改善UC小鼠結(jié)腸黏膜損傷,其機(jī)制可能通過Keap1/Nrf2信號(hào)通路降低細(xì)胞炎性因子IL-1β、IL-6、TNF-α的水平來改善DSS對(duì)結(jié)腸黏膜的炎癥反應(yīng)。