溫針聯(lián)合桃紅四物湯對腰椎骨折大鼠骨愈合能力、骨礦化及Smad4通路的影響

高宇 王曉云 文培培 池紅萬

(鄭州市骨科醫(yī)院 1頸肩腰腿痛科Ⅱ,河南 鄭州 450052;2康復醫(yī)學科)

脊柱骨折包括頸椎、胸椎、胸腰段及腰椎的骨折,胸腰段最常見〔1,2〕。腰椎骨折是指外傷或病理等原因致使腰段脊柱骨質(zhì)的完整性或連續(xù)性受到破壞,主要有腰部疼痛、腰背部肌肉痙攣、翻身困難等表現(xiàn)〔3〕。腰椎骨折除腰椎損傷外還經(jīng)常伴有脊髓、馬尾等損傷,致殘率高,但是經(jīng)過及時治療,多數(shù)患者預后較好。造成腰椎骨折的病因較多,暴力外傷是主要原因,有骨質(zhì)疏松者、腰椎骨腫瘤或結(jié)核的患者是主要好發(fā)人群〔4,5〕。骨折愈合是一個復雜的過程,主要分為骨損傷早期、肉芽組織形成期、骨痂形成期、板層狀骨痂形成期、重建和塑形期。骨折愈合過程中許多因素如血液循環(huán)狀態(tài)、組織細胞代謝、骨礦化等多種因素均可影響骨折愈合。其中骨基質(zhì)礦化是新骨形成的重要環(huán)節(jié),骨質(zhì)疏松、軟骨病等多種骨代謝疾病或骨結(jié)構(gòu)和骨功能的病理狀態(tài)均與骨礦化緊密相關(guān)〔6,7〕。 Smads蛋白家族是轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β1細胞內(nèi)傳導信號的唯一轉(zhuǎn)導分子,Smads能夠與其他轉(zhuǎn)錄分子結(jié)合將應答信號由細胞膜轉(zhuǎn)至細胞核,Smad4是TGF-β1各種信號轉(zhuǎn)導所需的共同分子。腰椎骨折患者主要通過復位固定方式治療,解除脊髓神經(jīng)的壓迫,恢復腰胸椎的生理功能。雖然手術(shù)復位治療短期效果較好,但是易引發(fā)遲發(fā)性脊髓及神經(jīng)的損傷,存在一定的危險性。骨折中醫(yī)治療具有副作用小,價格低廉等優(yōu)點。桃紅四物湯中含有桃仁、紅花、川芎等成分,是活血化瘀的代表方,具有活血化瘀、養(yǎng)血補血的雙重功效〔8〕。有研究表明溫針對骨質(zhì)疏松錐體壓縮性骨折患者有較好的療效〔9〕。本文探討針灸聯(lián)合桃紅四物湯對腰椎骨折大鼠骨愈合能力、骨礦化及Smad4信號通路的影響。

1 材料與方法

1.1實驗大鼠 45只SD雄性大鼠,由上海雷根生物科技公司提供,體質(zhì)量190～220 g,分4籠飼養(yǎng),溫度(22±1)℃,濕度45%～55%,大鼠活動飲水自由,術(shù)前禁食12 h,嚴格按照《實驗動物管理條例》規(guī)定進行實驗,本實驗經(jīng)醫(yī)院動物倫理委員會審核批準(批準編號為2018011),動物許可證號:SYXK(滬)2019-0036。

1.2藥物、試劑與儀器 桃紅四物湯(桃仁15 g,紅花8 g,熟地黃15 g,當歸10 g,白芍10 g,川芎8 g)中所有中藥從醫(yī)院中藥局采購,在醫(yī)院中藥局采用傳統(tǒng)煎煮方法,浸泡、過濾、離心、水煎煮,濃縮配置成生藥含量1.0 g/ml的水煎液備用。蘇木素-伊紅(HE)染色試劑盒來自北京索萊寶科技公司;全自動生化分析儀來自廣州市艾貝泰生物科技;低溫離心機來自濟南云騰醫(yī)療器械;電針治療儀來自廣州康軒醫(yī)療器械;華佗牌銀針來自河北喜樂福醫(yī)療器械;磷酸鹽緩沖液(PBS)來自北京伊塔生物科技;蛋白電泳儀來自江蘇博美達生命科學;TGF-β1抗體來自上海博湖生物科技;Smad4抗體來自深圳海思安生物技術(shù);辣根根過氧化物酶標記羊抗兔免疫球蛋白(Ig)G來自武漢亞科因生物。

1.3分組與模型制備 分組:隨機將45只大鼠分為5組,假手術(shù)(CO)組、模型(MO)組、針灸(AC)組、桃紅四物湯(PE)組、聯(lián)合(JO)組每組9只。建模:用2%戊巴比妥鈉麻醉大鼠,腹部向下固定,通過大鼠脊柱下段兩側(cè)可觸及的一對鈍性突起髖結(jié)節(jié),對應腰6錐體,向上一節(jié)為腰5錐體,椎體L5部位剃毛備皮3 cm×6 cm、消毒?？v行切開大鼠L5椎體皮膚、暴露腹膜后間隙、分離背闊肌、背最長肌、棘間肌和韌帶、鈍性分離椎前軟組織,暴露L5,從椎體側(cè)前方剪斷L5,術(shù)后不做內(nèi)固定,剪斷的椎體斷端骨小梁會因相互擠壓、扭曲而導致L5椎體變短,在多種外力下壓縮成模,術(shù)畢用生理鹽水對骨折處進行沖洗,逐層縫合肌肉層、皮下、皮膚,所有操作遵守無菌操作。假手術(shù)組只暴露L5部位,不造成腰椎骨折。術(shù)后大鼠均肌肉注射青霉素10萬U,治療3 d。

1.4干預方法 建模成功后,AC組大鼠給予溫針,大鼠針灸穴位為主穴:大杼、大椎、命門、懸鐘、膈俞、足三里。用銀針針刺穴位(針刺深度為2～5 mm)后,接電針治療儀,溫度45 ℃,留針30 min,電流100 mA,刺激10 min/次,隔天1次,共28 d。PE組大鼠按成人(體質(zhì)量70 kg)臨床用量的10倍換算〔10〕,給予桃紅四物湯6 ml/kg灌胃。JO組在PE組的基礎(chǔ)上給予針灸。CO組和MO組均給予等量生理鹽水灌胃。每天給藥和生理鹽水均1次/d,連續(xù)給藥28 d。

1.5標本采集及處理 各組大鼠在末次灌胃給藥后禁食12 h,給予2%戊巴比妥鈉(30 mg/kg)麻醉大鼠,將大鼠固定于潔凈干燥的操作臺上,腹部酒精消毒后,剖開腹部,采腹主動脈取血,血液靜置30 min后,于低溫低速離心機以3 000 r/min,離心15 min,取血清/血漿保存于-80 ℃冰箱中,用于后續(xù)鈣和磷水平的檢測。取血后在腰椎骨折處取腰椎組織、脊髓組織放置凍存管內(nèi)后,放置在液氮內(nèi)超低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6骨礦化檢測

1.6.1比色法測定血清鈣(Ca)濃度 血清中的Ca離子在堿性溶液中與甲基百里香粉藍結(jié)合,生成藍色絡(luò)合物,靜置5 min,置于分光光度610 nm波長處,1 cm光徑,空白試管調(diào)零,測定吸光度。通過比色之后與同樣處理的鈣標準進行比較,計算出樣品中Ca的含量。計算公式:血清中Ca含量(mmol/L)=測定OD值/標準OD值×標準濃度(2.5 mmol/L)×樣本測定前稀釋倍數(shù)。

1.6.2磷鉬酸法測定血清磷(P)濃度 血清中的P和鉬酸發(fā)生反應生成磷鉬酸,磷鉬酸被還原成鉬藍,在波長660 nm處被吸收,測定各管吸光度,通過比色可以計算P的含量,計算公式:血清中P含量(mmol/L)=測定OD值-空白OD值/標準OD值-空白OD值×標準濃度(0.5 mmol/L)×樣本測定前稀釋倍數(shù)。

1.7檢測堿性磷酸酶(ALP)、骨鈣素(BGP)水平 將血清樣本2 ml放在全自動生化分析儀檢測ALP水平。放射免疫法檢測BGP水平,并嚴格按照說明書操作。

1.8脊髓組織病理學觀察 取大鼠脊髓組織將標本置于4%多聚甲醛液固定24 h,取出已經(jīng)固定好的組織,梯度酒精脫水,透明,浸蠟包埋、切片取4 μm厚度,用二甲苯脫蠟,梯度酒精水化,水洗5 min,置于蘇木素染色10 min,水洗,置于伊紅染色10 min,再次梯度酒精脫水,二甲苯透明,中性樹膠封片。觀察脊髓組織變化。

1.9免疫組化檢測內(nèi)皮生長因子(VEGF)表達 取大鼠腰椎組織石蠟切片制作為4 μm厚度,脫蠟至水,檸檬酸鹽緩沖液高壓熱修復3 min,10%過氧化氫(H2O2)室溫封閉10 min,PBS洗滌后加入一抗MC,濃度為 1∶200,用磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗做陰性對照,4 ℃孵育過夜,二抗室溫孵育30 min,鏡下二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色、蘇木素復染、梯度酒精脫水、封片。在光學顯微鏡200倍下,每切片選取3個高倍視野,拍攝腰椎組織圖像。醫(yī)學圖像分析軟件(Image Pro-plus6.0)分析測定每張圖像的積分光密度(IOD)值。

1.10Western印跡檢測TGF-β1、Smad4蛋白的表達 取大鼠腰椎組織用PBS洗滌后切碎,再加1 ml細胞裂解液裂解30 min,14 000 r/min 4 ℃離心5 min,取上清液,用5×上樣緩沖液混合于PBS稀釋蛋白樣品中,按照4∶1的比例進行,然后在沸水浴中煮沸5 min,采用二喹啉甲酸(BCA)法測總蛋白濃度,每孔上樣蛋白量20 μg,凝膠電泳。轉(zhuǎn)印緩沖液配制好后要放入4 ℃冰箱內(nèi)預冷,然后全部轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上,加入脫脂奶粉,全程封閉時長為1 h。加入兔抗鼠TGF-β1(稀釋比例1∶200)、Smad4一抗(稀釋比例1∶500)后,TTBS漂洗3次,每次10 min;4 ℃過夜,加入辣根根過氧化物酶標記羊抗兔IgG二抗(稀釋比例1∶2 500),37 ℃孵育45 min,TTBS漂洗10 min×3次,用DAB試劑盒,在1 ml水中加A、B、C液各一滴,再加于膜上,電化學發(fā)光(ECL)試劑后凝膠成像系統(tǒng)分析目標條帶的光密度值。

1.11統(tǒng)計學分析 采用SPSS22.0軟件進行單因素方差分析、t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1各組血清中Ca、P水平 與CO組相比,MO組血清中 Ca、P水平均顯著降低(P<0.05),與MO組相比,AC組、PE組和JO組 Ca、P 水平均顯著升高(P<0.05),AC組和PE組比較無統(tǒng)計學差異(P>0.05),與AC組相比,JO組 Ca、P 水平均明顯升高(P<0.05)。見表1。

表1 各組血清中Ca、P、ALP、BGP水平及腰椎組織中VEGF、TGF-β1和Smad4蛋白表達比較

2.2各組血清中ALP、BGP水平 與CO組相比,MO組血清中ALP、BGP水平均明顯降低(P<0.05),與MO組相比,AC組、PE組和JO組ALP、BGP水平均明顯升高(P<0.05),AC組和PE組比較無統(tǒng)計學差異(P>0.05),與AC組相比,JO組ALP、BGP水平均明顯升高(P<0.05)。見表1。

2.3各組腰椎組織中TGF-β1、Smad4蛋白表達 與CO組相比,MO組腰椎組織中TGF-β1、Smad4表達顯著降低(P<0.05),與MO組相比,AC組、PE組和JO組TGF-β1、Smad4表達顯著升高(P<0.05),AC組和PE組相比,組間比較無統(tǒng)計學差異(P>0.05),與AC組相比,JO組TGF-β1、Smad4表達顯著升高(P<0.05)。見表1、圖1。

圖1 各組腰椎組織中TGF-β1、Smad4蛋白表達

2.4各組腰椎組織中VEGF陽性表達 與CO組相比,MO組腰椎組織中VEGF陽性表達顯著降低(P<0.05),與MO組相比,AC組、PE組和JO組VEGF陽性表達顯著升高(P<0.05),AC組和PE組相比,組間比較無統(tǒng)計學差異(P>0.05),與AC組相比,JO組VEGF表達顯著升高(P<0.05)。見表1、圖2。

圖2 各組腰椎組織中VEGF炎性表達(免疫組化染色,×200)

2.5各組神經(jīng)組織HE染色 CO組顯示灰白質(zhì)邊界清楚,神經(jīng)元豐富;MO組顯示出以為灰白質(zhì)邊界不清及神經(jīng)元數(shù)目顯著降低為特征的嚴重損害;與MO組相比,AC組、PE組神經(jīng)元數(shù)目明顯增加,但灰白質(zhì)邊界欠清;與AC組、PE組相比,JO組神經(jīng)元數(shù)目增加更明顯,脊髓的結(jié)構(gòu)更好。見圖3。

圖3 各組神經(jīng)組織(HE染色,×100)

3 討 論

腰椎骨折是一種比較常見的脊柱損傷,多發(fā)于成年人,75%為穩(wěn)定性壓縮型骨折,20%為不穩(wěn)定性骨折〔11〕。腰椎骨折后患者會出現(xiàn)腰部疼痛、腫脹、腰部活動受限等典型癥狀,有些患者甚至會并發(fā)腹膜后血腫、脊髓損傷等癥狀。近年來對腰椎骨折的治療主要通過腰椎復位進行治療,但是存在復位不理想的情況,導致錐體后移等不良后果,引給患者帶來不必要的痛苦同時還增加了經(jīng)濟負擔?，F(xiàn)代藥理學研究表明桃紅四物湯具有擴張血管增強冠脈血流、調(diào)節(jié)免疫功能、補充微量元素等作用。

本研究說明,針灸和桃紅四物湯可以提高鈣磷含量,促進鈣鹽的沉積,促進骨折的愈合。骨基質(zhì)礦化是成骨細胞合成并分泌骨的有機成分,在一定條件下無機鹽有秩序地沉積,使鈣和磷形成羥基磷灰石,再與有機質(zhì)形成螯合物,變?yōu)檎９琴|(zhì)的過程。鈣、磷作為骨骼中最為重要的礦物質(zhì)與血液中的鈣、磷維持著動態(tài)平衡,當機體發(fā)生骨折時,這種平衡就會被打破,從而影響鈣磷沉積。骨鈣、磷含量是檢測骨量、反映骨骼是否存在骨質(zhì)疏松狀態(tài)的指標,同時還用于評定骨脆性和預測骨折的風險指標〔12〕。針灸可以通過神經(jīng),體液和免疫系統(tǒng)等對機體的各系統(tǒng)、各器官的生理病理狀態(tài)進行影響和調(diào)整,針灸相關(guān)穴位,可以激發(fā)經(jīng)絡(luò)之氣,啟動機體自身內(nèi)在的調(diào)和能力,從而達到對骨折的治療作用。有研究發(fā)現(xiàn)大杼穴與骨代謝有關(guān),針灸大杼穴可以提高血鈣的含量〔13〕。針灸腎之背俞穴有補腎壯骨的功效,同時對下丘腦-垂體-腎上腺皮質(zhì)系統(tǒng)有調(diào)節(jié)作用。桃紅四物湯可以減輕骨折愈合過程中患者的疼痛感,促進骨質(zhì)的鈣化,縮短骨折愈合的時間。有學者通過對75例骨折患者進行研究發(fā)現(xiàn),桃紅四物湯不但可以提高患者血清中鈣磷比例,還可以提高VEGF、ALP的表達,改善骨代謝的指標,減少并發(fā)癥,促進患者骨折的愈合〔14〕,本研究和上述研究一致。

本研究說明,針灸聯(lián)合桃紅四物湯可以升高VEGF、ALP、BGP表達,促進骨愈合。VEGF是一種促血管形成的關(guān)鍵因子,是骨折愈合過程的一種重要因子。VEGF在骨形成過程的作用通過對內(nèi)皮細胞的特異性作用,促使內(nèi)皮細胞增殖分化形成血管,提高血管通透性,促血管生成參與骨發(fā)育形成,參與骨形成及骨愈合〔15〕。ALP和BGP都是成骨細胞分泌的物質(zhì),兩者均是與骨形成有關(guān)的代謝指標,均具有調(diào)節(jié)和維持骨鈣的功能,同時還在骨愈合和骨重建中起到關(guān)鍵性作用〔16〕。中醫(yī)認為骨折后局部氣血瘀滯導致全身血液運行不暢,瘀阻不通,形成血瘀證。有研究發(fā)現(xiàn)針灸可以更好地發(fā)揮行氣血、調(diào)和陰陽的作用,抑制骨吸收,促進骨形成〔17〕。桃紅四物湯具有補血而不滯血,和血的同時還不傷血的功效,其中當歸、川芎活血祛瘀,消腫止痛,配桃仁、紅花加強其破瘀血、生新血之功效。對于骨折來說,桃紅四物湯是通過祛腐生新,使骨折局部淤血減輕,促進血液循環(huán),為骨折愈合創(chuàng)造良好的內(nèi)環(huán)境,促進骨折愈合。陳海波等〔18〕通過對106例脛骨骨折患者進行研究,發(fā)現(xiàn)經(jīng)過桃紅四物湯干預后,患者血清中BGP水平明顯升高、ALP水平明顯下降,改善局部的血液循環(huán),提高了患者的膝關(guān)節(jié)功能,有利于病情恢復,本研究和上述研究一致。

本研究說明,針灸聯(lián)合桃紅四物湯增加TGF-β1、Smad4表達,從而促進骨愈合。TGF-β是個龐大的家族,其中TGF-β1是一種重要多肽類生長因子,在骨重建過程中有重要調(diào)節(jié)作用〔19〕。Smads蛋白直接參與TGF-β家族中信號轉(zhuǎn)導,包括受體調(diào)節(jié)型 Smad(Smad1,2,3,5,8)、通用型Smad(Smad4)和抑制型Smad(Smad6,7),其中Smad4S可在骨髓板的全區(qū)廣泛表達,Smad4可通過成熟成骨細胞中的線粒體途徑調(diào)節(jié)成骨細胞及多種細胞的凋亡,參與調(diào)節(jié)成骨細胞及成軟骨細胞的分化,調(diào)節(jié)成骨細胞對骨組織的修復和重建〔20〕。中醫(yī)認為一般發(fā)生骨折后局部血瘀形成,因此治療骨折的基本原則為活血化瘀。桃紅四物湯活血化瘀同時又可補氣養(yǎng)血,行氣而不傷正,該方中的熟地黃與當歸甘溫以滋陰補肝、 養(yǎng)血調(diào)經(jīng),兩者配伍可增強當歸補血,活血的功效。吳震〔21〕有對脛骨骨折大鼠進行研究,結(jié)果經(jīng)過桃紅四物湯干預后,X線結(jié)果顯示,大鼠的骨痂密度均勻,接近正常骨組織密度,Western印跡檢測TGF-β信號通路上相關(guān)蛋白Smad2 及Smad4的蛋白表達明顯增加,說明桃紅四物湯可以調(diào)控TGF-β/Smad信號通路,促進骨折的愈合。本文和上述研究一致。

綜上所述,溫針聯(lián)合桃紅四物湯可以抑制骨礦物質(zhì)的流失及增強骨吸收,加快鈣鹽的沉積,上調(diào)Smad4水平,促進骨愈合。