富血小板血漿通過(guò)抑制P53/Caspase-3途徑改善脂多糖誘導(dǎo)的BV2細(xì)胞凋亡

王應(yīng)輝 張婭 朱紫馨 牟秋菊 祝麗麗

(1貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院輸血科,貴州 貴陽(yáng) 550004;2貴州省黔南州人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)科)

富血小板血漿(PRP)是通過(guò)從全血富集而來(lái)富含血小板的血漿成分,在外科手術(shù)中如難愈合的創(chuàng)口修復(fù)、皮膚修復(fù)、美容修復(fù)等已被運(yùn)用于臨床〔1,2〕。然而PRP在中樞神經(jīng)細(xì)胞凋亡抑制作用與分子機(jī)制方面尚未闡明。細(xì)胞凋亡廣泛存在于各種病理或生理環(huán)境中,老年神經(jīng)退行性疾病如帕金森病(PD)和阿爾茨海默病(AD)等的發(fā)生正是由于神經(jīng)細(xì)胞長(zhǎng)期處在持續(xù)慢性炎癥反應(yīng)中導(dǎo)致的細(xì)胞毒性反應(yīng)〔3,4〕,這類疾病目前尚未有良好的治療方法,因此探索能抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡的新藥物對(duì)神經(jīng)退行性疾病的治療具有重要意義。研究發(fā)現(xiàn),當(dāng)神經(jīng)系統(tǒng)損傷時(shí),小膠質(zhì)細(xì)胞被激活從而促進(jìn)炎癥細(xì)胞因子和趨化因子的表達(dá)〔5〕,進(jìn)一步誘導(dǎo)神經(jīng)炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡,最后導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞死亡〔6,7〕。磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)是參與細(xì)胞凋亡的重要信號(hào)通路,AKT活化調(diào)控下游信號(hào)分子P53等促進(jìn)細(xì)胞凋亡水平〔8,9〕。此外,小膠質(zhì)細(xì)胞釋放的炎癥因子可促進(jìn)細(xì)胞線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡〔10,11〕。因此,通過(guò)抑制凋亡來(lái)改善或逆轉(zhuǎn)其病理過(guò)程可能是治療神經(jīng)系統(tǒng)炎癥反應(yīng)的有效策略。脂多糖(LPS)是能誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)的革蘭陰性菌內(nèi)毒素成分,而B(niǎo)V2細(xì)胞有似于原代小膠質(zhì)細(xì)胞的總體反應(yīng)模式,經(jīng)常被用來(lái)構(gòu)建體外細(xì)胞模型進(jìn)而研究神經(jīng)元損傷的分子機(jī)制〔12,13〕。本研究以LPS誘導(dǎo)的BV2細(xì)胞模型為對(duì)象,旨在探討PRP通過(guò)P53/胱天蛋白酶(Caspase)-3途徑抑制神經(jīng)凋亡的分子機(jī)制,為神經(jīng)退行性疾病的治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1主要試劑 DMEM/F12高糖培養(yǎng)基(C11330500BT)購(gòu)自美國(guó)Gibco公司;LPS(L-6529)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司;胎牛血清(04-001-1ACS)、磷酸鹽緩沖液(PBS,02-024-1ACS)購(gòu)自以色列Biological Industries;TUNEL試劑盒(E-CK-A320)購(gòu)自武漢Elabscience公司。相關(guān)抗體:抗P53(ab26)、抗AKT(ab8805)、抗p-PI3K(ab182651)購(gòu)自ABCAM;抗Caspase-3(19677-1-AP)、抗p-AKT(66444-1-Ig)、抗B細(xì)胞淋巴瘤(Bcl)-2相關(guān)X蛋白(Bax,60267-1-Ig)、抗Bcl-2(26593-1-AP)、抗Caspase-9(66169-1-Ig)購(gòu)自武漢山鷹生物;單克隆內(nèi)參抗體磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH,AB-P-R001)購(gòu)買于杭州賢至,辣根過(guò)氧化酶(HRP)標(biāo)記二抗(PKM-014-090S)購(gòu)自武漢普美克。

1.2主要儀器 高速離心機(jī)(德國(guó) Eppendorf 公司),超純水儀(英國(guó) ELGA Classic UF 公司),一體式化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng) (中國(guó)上海 Clinx ChemiScope有限公司),濕轉(zhuǎn)電泳槽、電泳儀(美國(guó)伯樂(lè)公司),倒置熒光顯微鏡 (日本Olympus公司),激光共聚焦顯微鏡 (重慶君瀾醫(yī)療器械有限公司)。

1.3PRP的制備 SD大鼠(3～4月齡雄性,SPF級(jí),180～230 g),從貴州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心購(gòu)買,正常飼料喂養(yǎng),正常飲水,不做任何刺激。麻醉后心臟采血,通過(guò)二次離心法〔14〕(800 r/min,離心10 min;2 000 r/min,離心12 min)分離PRP,與凝血酶體積比為9∶1混勻激活后,12 000 r/min離心15 min取上清備用。將BV2小膠質(zhì)細(xì)胞分成正常組(不做干預(yù)),10%PRP組(加入10%濃度PRP),LPS組(1 μg/ml LPS激活)和不同濃度PRP(3%、5%和10%)+LPS組(1 μg/ml LPS激活后加入不同濃度PRP)。

1.4BV2細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化 將BV2細(xì)胞(5×105細(xì)胞/孔)接種于6孔板中,用不同濃度PRP預(yù)處理1 h,然后用LPS(1 μg/ml)〔15〕刺激4 h,用PBS洗滌兩次10 min后,在光鏡下觀察BV2細(xì)胞形態(tài)改變。

1.5BV2細(xì)胞凋亡測(cè)定 用不同濃度PRP預(yù)處理BV2細(xì)胞1 h,再用LPS(1 μg/ml)刺激24 h,收集細(xì)胞進(jìn)行涂片,按TUNEL說(shuō)明書(shū)用4%多聚甲醛將細(xì)胞固定、PBS清洗和0.2% Triton-100通透與洗滌,TUNEL染色和4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)核染,使用激發(fā)波長(zhǎng)為450～500 nm的熒光顯微鏡觀察。

1.6Western印跡分析 將BV2細(xì)胞5×105細(xì)胞/ml密度種到6孔板中,在LPS(1 μg/ml)刺激之前,用不同濃度PRP預(yù)處理1 h,共培養(yǎng)24 h后用含有蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA緩沖裂解液在冰上處理45 min,并在4 ℃下以12 000 r/min離心20 min。 通過(guò)二喹啉甲酸(BCA)蛋測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。 在分離膠為12%的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)上分離出等量的蛋白質(zhì)(40 μg),并轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。 然后將膜與5%脫脂牛奶在室溫環(huán)境下封閉1 h。 4 ℃過(guò)夜用特異性的一抗(1∶1 000)孵育,洗滌3遍后,將印跡膜與HRP耦聯(lián)的二抗(1∶10 000)在室溫下孵育1.5 h。 Tris鹽酸緩沖液吐溫(TBST)洗滌3遍后,用增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光試劑盒(Thermo)檢測(cè)膜相關(guān)蛋白的表達(dá)。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用GraphPad Prism8.0.1軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1各組PRP對(duì)BV2細(xì)胞形態(tài)改變的影響 與正常組比較,10%PRP組細(xì)胞形態(tài)處于非活化狀態(tài),胞體較小,呈菱形,且具有細(xì)長(zhǎng)的突起;與正常組及10%PRP組比較,LPS組活化率顯著增高(P<0.01),胞體增大,突起消失或回縮變短,呈圓形或橢圓形,形態(tài)類似阿米巴樣(圖1箭頭處)。與LPS組比較,不同濃度PRP(3%、5%、10%)預(yù)處理BV2細(xì)胞后,活化的細(xì)胞數(shù)量明顯減少(P<0.01)。見(jiàn)圖1、表1。

表1 各組BV2細(xì)胞活化率、TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)比較

圖1 各組BV2細(xì)胞形態(tài)(DAPI,×200)

2.2各組PRP對(duì)BV2細(xì)胞凋亡的影響 與正常組比較,10%PRP組TUNEL染色無(wú)明顯變化,而LPS組TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯增加(P<0.01)。與LPS組比較,不同濃度PRP(3%、5%、10%)預(yù)處理后,BV2細(xì)胞凋亡水平明顯降低(P<0.01)。見(jiàn)表1、圖2。因10%PRP干預(yù)后BV2活化細(xì)胞數(shù)量和細(xì)胞凋亡水平改善最為顯著(P<0.01),故后續(xù)使用10%PRP濃度進(jìn)行研究。

圖2 TUNEL檢測(cè)各組BV2細(xì)胞凋亡(×400)

2.3各組細(xì)胞p-PI3K、p-AKT和P53表達(dá)比較 與正常組比較,10%PRP組p-PI3K和p-AKT蛋白表達(dá)明顯增加(P<0.01)。與正常組及10%PRP組比較,LPS組p-PI3K和p-AKT表達(dá)明顯減低,而P53表達(dá)明顯增加(P<0.01)。與 LPS組比較,10%PRP+LPS組p-PI3K和p-AKT表達(dá)均顯著增加,P53表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.01)。見(jiàn)表2、圖3。

表2 各組BV2細(xì)胞線粒體凋亡相關(guān)蛋白、p-PI3K、p-AKT、P53及LCⅡ表達(dá)

1～4:正常組、10%PRP組、LPS組、10%PRP+LPS組;下圖同圖3 各組BV2細(xì)胞p-PI3K、p-AKT和P53表達(dá)

2.4各組細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(LC3)Ⅱ表達(dá)比較 與正常組比較,LPS組及10%PRP+LPS組LC3Ⅱ蛋白表達(dá)明顯增加(P<0.01)。與 LPS組比較,10%PRP+LPS組LC3Ⅱ蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.01)。見(jiàn)表2、圖4。

圖4 各組BV2細(xì)胞LC3Ⅱ蛋白表達(dá)

2.5各組細(xì)胞線粒體凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)比較 與正常組比較,10%PRP組Bcl-2表達(dá)顯著增加(P<0.01),Bax、Cleaved-Caspese9、Cleaved-Caspese3蛋白表達(dá)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與正常組及10% PRP組比較,LPS組Bax、cleaved-Caspese9、cleaved-Caspese3蛋白表達(dá)明顯增加(P<0.01),Bcl-2蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.01)。與 LPS組比較,10%PRP+LPS組Bax、Cleaved-Caspese-9、Cleaved-Caspese-3蛋白表達(dá)明顯降低,而B(niǎo)cl-2蛋白表達(dá)明顯上調(diào)(P<0.01)。見(jiàn)表2、圖5。

圖5 各組BV2細(xì)胞線粒體凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)

3 討 論

PRP是富含血小板的血漿成分〔16〕。PRP中的血小板一旦被激活,α顆粒將會(huì)釋放血小板衍生生長(zhǎng)因子(PDGF)、胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGF)-Ⅰ和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)-β等多種生長(zhǎng)因子〔17〕,這些豐富的生長(zhǎng)因子可以為損傷的細(xì)胞提供修復(fù)和營(yíng)養(yǎng)支持功能,從而減少神經(jīng)細(xì)胞的損傷和凋亡〔18,19〕。此外,小膠質(zhì)細(xì)胞的過(guò)度激活可分泌過(guò)量的炎性介質(zhì)(如腫瘤壞死因子-α、白細(xì)胞介素-6、環(huán)氧合酶-2等),產(chǎn)生免疫反應(yīng)和神經(jīng)炎癥,最后導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞發(fā)生凋亡〔20,21〕。因此,通過(guò)抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的過(guò)度激活進(jìn)而降低免疫介質(zhì)的產(chǎn)生和減少細(xì)胞病理性凋亡是研究抗神經(jīng)炎的核心問(wèn)題。

本研究結(jié)果提示,細(xì)胞已被激活形成了炎癥模型,但多數(shù)細(xì)胞形態(tài)改變不明顯,這可能是細(xì)胞與LPS干預(yù)時(shí)間或敏感性有關(guān)且本研究還提示PRP可以減輕LPS誘導(dǎo)的BV2細(xì)胞凋亡水平。以上結(jié)果顯示,10%PRP+LPS在降低BV2細(xì)胞形態(tài)的改變和DNA片段的生成效果最顯著,因此本研究使用此濃度進(jìn)行探索其可能的抗凋亡機(jī)制。

PI3K/AKT介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)是調(diào)節(jié)細(xì)胞存活、增殖、分化和凋亡最關(guān)鍵的途徑之一〔22〕。生長(zhǎng)因子等條件觸發(fā)PI3K分子磷酸化,進(jìn)而協(xié)調(diào)細(xì)胞的生長(zhǎng)和細(xì)胞存活〔23〕。P53表達(dá)上調(diào)可抑制Bcl2表達(dá),從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡〔24〕。本研究提示,PRP可降低LPS誘導(dǎo)的BV2細(xì)胞炎癥反應(yīng)所致的細(xì)胞凋亡,可能是通過(guò)激活PI3K/AKT信號(hào)通路從而降低P53表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。

線粒體是參與細(xì)胞凋亡的重要調(diào)控者。當(dāng)受病理或生理信號(hào)刺激后,Bcl-2和Bax表達(dá)失衡,致使線粒體功能改變,凋亡誘導(dǎo)因子被釋放到線粒體外,激活下游Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng),最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡〔25,26〕。本研究結(jié)果提示,PRP能降低LPS誘導(dǎo)BV2細(xì)胞炎癥反應(yīng)誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡,其機(jī)制可能與PRP降低線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡有關(guān)。此外,本文發(fā)現(xiàn)PRP能降低自噬標(biāo)志物L(fēng)C3Ⅱ的活化水平,但其機(jī)制需要進(jìn)一步探索。