基于JAK/STAT-3通路探究右美托咪定對神經(jīng)痛大鼠鎮(zhèn)痛及星形膠質(zhì)細胞活性的作用機制

周啟 雷華娟 寧彧 張慧芳

(1湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院麻醉科,湖南 長沙 410007;2長沙市第三醫(yī)院麻醉科)

神經(jīng)性病理疼痛是由于機體疾病或損傷時影響了軀體感覺神經(jīng)系統(tǒng)而導致的疼痛表現(xiàn),可分為周圍性疼痛、炎癥性疼痛和中樞性疼痛等不同類型。神經(jīng)性疼痛與其他疼痛有所不同,在排除相關(guān)誘因后仍能夠長期存在,具有頑固性、難治愈性等特點,且目前尚無有效的治療方法,是現(xiàn)階段醫(yī)學研究中需重點解決的問題之一〔1〕。右美托咪定(Dex)作為臨床中的常見的醫(yī)用麻醉藥物,是一種高選擇性的α-2腎上腺素受體激動劑,對急性炎癥疼痛、術(shù)后疼痛、阿片類藥物不敏感的神經(jīng)病理性疼痛等有較好的緩解作用〔2〕。也因其對中樞與周圍神經(jīng)系統(tǒng)具有較好的鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛、抗焦慮作用而被廣泛應用于臨床治療當中。于鞘內(nèi)注射Dex可抑制去甲腎上腺素的生成和分泌,進而緩解相關(guān)病理性疼痛,現(xiàn)階段主要用于手術(shù)中的麻醉輔助及重癥患者鎮(zhèn)痛〔3〕。星形膠質(zhì)細胞在神經(jīng)病理性痛的發(fā)生和維持中起重要作用,且當坐骨神經(jīng)等受到壓迫性損傷時可導致?lián)p傷側(cè)脊髓背角星形膠質(zhì)細胞的增殖活化,進而增加疾病的疼痛并影響治療效果〔4〕。Janus激酶/信號轉(zhuǎn)導與轉(zhuǎn)錄激活子(JAK/STAT)信號通路可將細胞外信號傳遞至細胞核內(nèi)進行轉(zhuǎn)錄,并通過由細胞因子激活的信號轉(zhuǎn)導通路參與細胞增殖、分化,不僅表現(xiàn)在記憶形成、神經(jīng)退行性變、突觸可塑性等方面,還可參與神經(jīng)病理性疼痛的形成過程〔5〕。本文主要通過基于JAK/STAT-3探究Dex對神經(jīng)痛大鼠鎮(zhèn)痛及星形膠質(zhì)細胞活性的作用機制,意在為日后臨床中神經(jīng)疼痛的治療提供有力依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實驗大鼠 選取SD雌雄各半大鼠40只,體質(zhì)量150～250 g,由湖南中醫(yī)藥大學動物學部提供,使用許可證號:SCXK(湘)2019-0075。室溫25 ℃飼養(yǎng),濕度約為50%,正常光照,喂養(yǎng)條件為標準飼料和自來水自由攝取,所有操作嚴格按照實驗動物倫理委員會動物管理與使用指南執(zhí)行。

1.2藥物、試劑與儀器 0.9%生理鹽水(重慶天圣制藥有限公司),Dex(揚子江藥業(yè)集團有限公司),氯胺酮(陜西健民制藥有限公司),多聚甲醛、生理鹽水(武漢博士德公司),PCR試劑盒(伊萊瑞特生物科技有限公司),JAK2、STAT3抗體(萊比信生物技術(shù)公司),von Frey纖維絲、石蠟切片機(上海醫(yī)用儀器廠),包埋儀(長沙益廣制藥機械公司),外科手術(shù)器械(江蘇拜爾斯醫(yī)療科技有限公司),熱痛刺激儀(中國醫(yī)學科學院)。

1.3模型制作 采用50 mg/kg氯胺酮對大鼠進行腹腔內(nèi)注射麻醉,待麻醉完全后將大鼠俯臥固定,剔除左后肢毛發(fā),備皮、消毒,于無菌環(huán)境下采用克氏針觸及大鼠坐骨結(jié)節(jié)部位,在大鼠股骨外側(cè)0.5 cm處進行切口,分離二頭肌與半腱肌等肌肉組織,暴露股段高位右側(cè)坐骨神經(jīng),用小止血鉗夾住神經(jīng)背側(cè),勿將神經(jīng)擠壓在其下的組織上,用3-0硅制絲線間隔1 mm縫入神經(jīng)干內(nèi)結(jié)扎神經(jīng)背側(cè)1/3和1/2處,以左后肢輕度顫動為最佳結(jié)扎強度,完成后依次用絲線縫合皮膚,為建模成功。

1.4分組與給藥 將40只大鼠隨機分為4組,每組10只,分別為正常組、模型組、Dex組、Ket組,除正常組外,其余大鼠均建立坐骨神經(jīng)結(jié)扎病理性疼痛模型,建模成功后,Dex組采用0.2 ml/kg右美托咪定進行大鼠坐骨神經(jīng)周圍注射,Ket組采用10 mg/kg氯胺酮進行腹腔注射,模型組與正常組采用10 ml/kg的生理鹽水進行注射,均每天一次,連續(xù)干預30 d。

1.5各組疼痛行為機械性縮足反射閾值(MWT)、熱縮腿潛伏期(TWL)檢測 MWT測定:將大鼠放于1.0 cm×1.0 cm的金屬網(wǎng)格內(nèi)將玻璃罩蓋好靜置30 min后,采用不同力度的纖維絲對大鼠的右后爪足底部進行5次/min刺激,刺激力度由小到大,若刺激部位出現(xiàn)抬腿、縮足等反應視為有效,將大于3次的最低力度記為反應閾值。TWL測定:將大鼠放于玻璃箱中適應30 min后,對大鼠后爪底部行照射刺激,計時為每次大鼠表現(xiàn)出快速縮足、回避或抬腿等反應時暫停刺激,將基礎強度設為10 s,自動斷開時間為20 s,每5 min測定1次,共測定3次取平均值。

1.6蘇木素-伊紅(HE)染色 大鼠處死后剔除腰背脊髓組織表面肌肉進行坐骨神經(jīng)組織提取,浸泡于3%多聚甲醛溶液中固定,將石蠟切片置于60 ℃的保溫箱中1 h,再經(jīng)二甲苯及60%～100%不同濃度的酒精反復脫蠟至水3次后用蒸餾水清洗,置入蘇木素中染色15 min,將浮色沖洗,行1%鹽酸酒精分色數(shù)秒,待切片褪色適中后用蒸餾水漂洗15 min,伊紅酒精中復染后撈出切片放置于蒸餾水下,用90%和100%乙醇脫水2次1 min/次,侵入二甲苯溶液中15 min透明,樹膠封固,于顯微鏡下觀察病理組織。

1.7TUNEL檢測脊髓背角星形膠質(zhì)細胞凋亡 將坐骨神經(jīng)組織脫蠟及水化后0.7%鹽水及磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗3次5 min/次,根據(jù)TUNEL檢測說明書取TUNEL反應液,恒溫下孵育2 h,將玻片置于PBS中在沖洗5 min×3次,將切片浸入濃度為3%過氧化氫中5 min后用PBS脫色,進行酶標反應后再用PBS浸洗10 min,將切片置于二氨基聯(lián)苯胺(DAB)混合液,出現(xiàn)淺棕色背景時采用去離子水反復沖洗3次,5 min后蘇木素進行復染,用濃度為1%的酒精分化,氨水反藍后沖洗,將坐骨神經(jīng)切片依次放入濃度為70%、80%酒精和無水乙醇梯度脫水15 min,在二甲苯中脫水透明5 min進行樹膠封片,于高倍鏡下拍攝細胞凋亡情況。

1.8Western印跡檢測坐骨神經(jīng)中JAK2、STAT3蛋白表達 取已處死大鼠的脊髓背角,加入0.15%胰蛋白裂解液,離心機運轉(zhuǎn)15 000 r/min離心30 min后取上清液,用7%十二烷基硫酸鈉(SDS)聚丙酰胺凝膠分離蛋白,血清樣品中加入樣孔進行電泳,聚偏氟乙烯(PVDF)膜緩沖鹽溶液浸泡15 min后PBS反復沖洗,5 min/次,分別加入JAK2(1∶500)、STAT3(1∶1 000)、β-actin抗體(1∶1 000),辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠IgG作為二抗(1∶2 000),分別雜交后進行PBS沖洗,以β-actin為內(nèi)參指標,采用顯色劑進行顯色和灰度掃描分析掃描條帶,計算JAK2、STAT3蛋白表達量。

1.9PCR檢測坐骨神經(jīng)中JAK2、STAT3 mRNA表達 取大鼠的脊髓背角組織,用Trizol提取總RNA后,核酸定量儀檢測提取RNA的濃度和純度,按照第一鏈合成系統(tǒng)說明書進行逆轉(zhuǎn)錄制備cDNA,以β-actin為內(nèi)參進行熒光定量PCR擴增檢測各組JAK2、STAT3 mRNA的表達水平,60 ℃預處理3 min,循環(huán)1次,80 ℃預變性15 min,循環(huán)1次,95 ℃變性15 s,50 ℃退火30 s,70 ℃延伸30 s,循環(huán)30次,每組設置3個復孔,用2%瓊脂糖凝膠電泳,紫外燈下觀察并拍照和圖像分析,PCR產(chǎn)物量以光密度×面積表示,根據(jù)2-ΔΔCt值計算相對表達,引物序列:JAK2正向:5′-AAGTGCGTGCGAGCGAAGA-TC-3′,反向:5′-TGCTGAATGAACCTGCGGAATCTG-3′;STAT3正向:5′-CCAGTCGTGGTGATCTCCAACATC-3′,反向:5′-CGCTTGGTGGTGGACGAGAAC-3′;β-actin正向:5′-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3′,反向:5′-TCCACCACCCTGTTGCTGTAC-3′。

1.10星形膠質(zhì)細胞培養(yǎng) 打開大鼠皮膚和脊髓組織收集組織,在PBS中清洗組織一次,將組織置于無血清DMEM/F12培養(yǎng)基中,將組織分割成小塊組織轉(zhuǎn)移至干凈離心管中,加入0.12%胰蛋白酶,在37 ℃恒溫水浴中消化組織15 min,加入血清溶液停止胰蛋白酶化,沉淀后收集上清液,將剩余組織勻漿經(jīng)胰蛋白酶消化,將組織溶解液固定,過濾后的溶液以2 000 r/min離心10 min取出上清液,將細胞重新懸浮在完整的培養(yǎng)基中進行細胞計數(shù),每2 d更換一次細胞培養(yǎng)基,10 d后觀察分層細胞層,下層細胞是星形膠質(zhì)細胞,將覆蓋著膠質(zhì)細胞的培養(yǎng)瓶放置于振蕩器上,以200 r/min的速度混合15 min,收集培養(yǎng)基并用PBS清洗非黏附細胞,將細胞以1 500 r/min離心5 min,用完整的培養(yǎng)基重新懸浮細胞顆粒,去除上清液在37 ℃下用5%的CO2培養(yǎng)15 min,更換培養(yǎng)基后,將培養(yǎng)瓶中的黏附細胞純化為所需膠質(zhì)細胞。

1.11MTT檢測星形膠質(zhì)細胞增殖 取星形膠質(zhì)細胞以0.25%胰酶消化并計數(shù),接種于96孔板中培養(yǎng),使每孔細胞密度為1×106個,每組設5個平行孔并設不含細胞的空白對照,37 ℃培養(yǎng)過夜使細胞貼壁,加入Dex 0.2 ml/L(Dex組)、AG490 10 μmol/L(JAK2抑制劑組)、WP1066 5 μmol/L(STAT3抑制劑組),分別培養(yǎng)24、48、72 h后,棄去原培養(yǎng)液,每孔加入MTT 5 mg/ml試劑繼續(xù)培養(yǎng)3 h,在500 nm波長下檢測OD值,細胞抑制率=(1-實驗組平均OD值/對照組平均OD值)×100%。

1.12統(tǒng)計學方法 采用GraphPad Prism8.0軟件進行單因素方差分析、t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1各組疼痛行為比較 與正常組比較,模型組MWT、TWL表達顯著降低(P<0.05),與模型組比較,Dex組MWT、TWL表達顯著升高(P<0.05),與Dex組比較,Ket組MWT、TWL表達顯著降低(P<0.05)。見表1。

表1 各組疼痛行為、星形膠質(zhì)細胞凋亡率、坐骨神經(jīng)中JAK2、STAT3蛋白及mRNA比較

2.2HE染色 正常組坐骨神經(jīng)的神經(jīng)纖維結(jié)構(gòu)完整且均勻分布,排列整齊有序,外模和形態(tài)完整,髓鞘緊密圍繞軸突結(jié)構(gòu)明確;模型組出現(xiàn)髓鞘腫脹的現(xiàn)象,有部分神經(jīng)鞘膜水中及軸突現(xiàn)象產(chǎn)生導致排列密集紊亂;Dex組神經(jīng)纖維結(jié)構(gòu)不清晰現(xiàn)象有所緩解,軸突逐漸清晰,水腫現(xiàn)象好轉(zhuǎn),外膜形態(tài)有所顯現(xiàn);Ket組仍有排列紊亂,髓鞘和軸突結(jié)構(gòu)不清晰現(xiàn)象。見圖1。

圖1 各組坐骨神經(jīng)組織(HE染色,×200)

2.3各組脊髓背角星形膠質(zhì)細胞凋亡比較 與模型組比較,Dex組星形膠質(zhì)細胞凋亡率顯著升高(P<0.05),與Dex組比較,Ket組星形膠質(zhì)細胞凋亡率顯著降低(P<0.05)。見表1、圖2。

圖2 各組星形膠質(zhì)細胞凋亡(TUNEL染色,×200)

2.4各組坐骨神經(jīng)中JAK2、STAT3蛋白及mRNA表達比較 與正常組比較,模型組坐骨神經(jīng)中JAK2、STAT3蛋白及mRNA表達顯著升高(P<0.05),與模型組比較,Dex組JAK2、STAT3蛋白及mRNA表達顯著降低(P<0.05),與Dex組比較,Ket組JAK2、STAT3蛋白及mRNA表達顯著升高(P<0.05)。見表1、圖3。

圖3 各組JAK2、STAT3蛋白表達

2.5各組星形膠質(zhì)細胞增殖率比較 干預24、48及72 h時,JAK2抑制劑組、STAT3抑制劑組星形膠質(zhì)細胞增殖率均顯著高于Dex組(P<0.05),JAK2抑制劑組與STAT3抑制劑組比較無顯著差異(P>0.05)。見表2。

表2 各組星形膠質(zhì)細胞增殖率比較

3 討 論

以往研究認為,疼痛是機體組織在一定程度上受損或由于存在潛在性損傷而造成的,可在一定程度上衡量患者的健康水平。隨著對疼痛研究的逐漸深入,有學者認為,疼痛不僅是神經(jīng)功能紊亂的一種表現(xiàn)也是疾病的一種〔6〕。在疼痛發(fā)生的初始階段,會有脊髓星形膠質(zhì)細胞異常現(xiàn)象的產(chǎn)生,而隨著損傷的逐漸恢復,細胞的異常狀況也隨之改善。在病理性神經(jīng)疼痛的治療中,常用的藥物主要為抗癲癇類、三環(huán)類及去甲狀腺素再攝取等抑制類藥物〔7〕。而右美托咪定作為一種新型、高選擇性的腎上腺受體激動劑,在臨床中具有鎮(zhèn)靜、止痛及抑制交感神經(jīng)興奮等效果,其作用時間長且能在患者的手術(shù)期維持相對穩(wěn)定狀態(tài)〔8〕。

MWT和TWL作為反映疼痛程度的重要指標,在探究神經(jīng)病理疼痛和反映神經(jīng)刺激及骨外周神經(jīng)激活等方面具有一定意義〔9〕。本研究結(jié)果表明,Dex可發(fā)揮改善神經(jīng)痛大鼠的作用進而影響MWT、TWL的表達。相關(guān)研究表示,Dex在神經(jīng)疼痛中可能通過激動突觸前膜受體,抑制去甲腎上腺素等血漿兒茶酚胺及興奮性神經(jīng)遞質(zhì)和谷氨酸鹽的釋放,進而終止疼痛信號的傳導〔10〕。周斌等〔11,12〕研究表示,Dex通過增強神經(jīng)元興奮,使機體內(nèi)環(huán)境中環(huán)磷酸腺苷(cAMP)濃度升高,在抑制介導疼痛的電流中發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用。Dex并通過麻醉作用減輕神經(jīng)根周圍炎性引起的痛覺反應,使受體激動劑介導作用增強,并增加根神經(jīng)活動空間和加大內(nèi)源性物質(zhì)的釋放,進而降低機體對疼痛刺激的敏感性和改善疼痛反應。

本研究結(jié)果表明,Dex對促進坐骨神經(jīng)疼痛大鼠星形膠質(zhì)細胞凋亡具有一定相關(guān)性。相關(guān)研究表示,正常生理條件下,星形膠質(zhì)細胞可幫助神經(jīng)元與環(huán)境間進行物質(zhì)交換,利于為神經(jīng)元提供營養(yǎng)物質(zhì)和保持周圍環(huán)境的穩(wěn)定,并可通過相互作用形成復合體樣結(jié)構(gòu),起到維持正常機體微環(huán)境的作用〔13,14〕。而疾病中活化的星形膠質(zhì)細胞參與了多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病的損傷過程,如阿爾茨海默病、帕金森病和肌萎縮側(cè)索硬化癥等,且活化星形膠質(zhì)細胞的毒性作用高于其支持組織修復的作用〔15〕。研究表明,Dex對神經(jīng)的保護作用可能與下調(diào)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激特異性蛋白及上調(diào)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激激活細胞凋亡水平有關(guān),并通過麻醉作用降低神經(jīng)損傷發(fā)生率,促進神經(jīng)組織中星形膠質(zhì)細胞的凋亡,進而抑制其在疾病中的細胞活性及坐骨神經(jīng)的毒性反應,起到改善神經(jīng)疼痛的作用〔16,17〕。

JAK/STAT信號通路是細胞因子信號轉(zhuǎn)導的重要途徑,可參與機體的免疫調(diào)節(jié)、細胞活性及疾病發(fā)展,神經(jīng)痛發(fā)生時可使磷酸化的JAK2、STAT3信號通路被激活進而參與疾病的進程〔18〕。本研究結(jié)果表明,Dex對抑制疾病中JAK2、STAT3表達具有一定積極影響。相關(guān)研究表示,STAT通過與酪氨酸相關(guān)受體結(jié)合與酪氨酸殘基反應,并通過吸引STAT結(jié)合到受體上,使磷酸化的JAK2、STAT3轉(zhuǎn)位到細胞核內(nèi),調(diào)控相關(guān)疼痛因子轉(zhuǎn)錄從而參與神經(jīng)疼痛病疾病發(fā)展過程〔19〕。Pan等〔20〕研究表示,Dex能夠緩解神經(jīng)性疼痛可能與其抑制相關(guān)蛋白酶的表達具有一定相關(guān)性,并可能在多途徑調(diào)節(jié)細胞因子的釋放和通過介導JAK2、STAT3使下游的蛋白轉(zhuǎn)錄合成效應底物,JAK2、STAT3發(fā)生核易位,使疼痛因子得到抑制,以降低神經(jīng)痛引起的機體不良反應〔20〕。因此本研究推測,Dex可能通過JAK2、STAT3信號通路級聯(lián)介導進而抑制疼痛反應。本研究結(jié)果表示,Dex可通過與JAK2、STAT3等抑制星形膠質(zhì)細胞的增殖,且抑制效果高于JAK2、STAT3抑制劑。近來研究證實,JAK2、STAT3通路的激活或抑制對氧化損傷過程有重要作用,Dex可通過激活JAK2、STAT3通路對損傷神經(jīng)起保護作用,另外,抑制JAK2、STAT3通路轉(zhuǎn)導可緩解神經(jīng)損傷因子對膠質(zhì)細胞、血管內(nèi)皮細胞的損傷影響〔21〕。

綜上所述,Dex對改善神經(jīng)疼痛大鼠疼痛表達、病理水平,促進脊髓星形膠質(zhì)細胞凋亡,抑制JAK2、STAT3蛋白表達具有一定改善作用。