慢性阻塞性肺疾病相關(guān)性氣管支氣管軟化癥模型建立及評(píng)價(jià)

李雪蓮 余薇 周鵬程

(1四川省第二中醫(yī)醫(yī)院急診科,四川 成都 610031;成都中醫(yī)藥大學(xué) 2臨床醫(yī)學(xué)院;3附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科)

世界衛(wèi)生組織關(guān)于病死率和死因的預(yù)測數(shù)字顯示,在未來40年里慢性阻塞性肺疾病(COPD)的患病率將繼續(xù)上升,預(yù)測至2060年死于COPD及相關(guān)疾病的患者數(shù)超過540萬/年〔1～3〕。COPD相關(guān)流行病學(xué)數(shù)據(jù)顯示,我國患者數(shù)約1億〔4〕,40歲以上人群患病率高達(dá)13.7%,且發(fā)生急性加重平均為0.5～3.5次/年〔5〕,24.4%～24.8%的患者處于極高經(jīng)濟(jì)風(fēng)險(xiǎn),因其年人均疾病經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)高達(dá)20 107.58元〔6〕。氣管支氣管軟化癥以反復(fù)肺部感染、呼吸衰竭和肺功能加速惡化為主要表現(xiàn),可導(dǎo)致猝死,危害巨大。其病因主要為慢性炎癥,病理改變?yōu)闅獾儡浌菈乃阑蜃冃?從而使管壁失去支撐作用,因此氣管管腔隨胸內(nèi)外壓力改變及呼吸運(yùn)動(dòng)呈動(dòng)態(tài)性狹窄〔7〕。目前研究顯示 COPD 是導(dǎo)致氣管支氣管軟化癥最常見的危險(xiǎn)因素之一〔8,9〕,同時(shí)氣管支氣管軟化癥也可加速 COPD 病情進(jìn)展,增加患者死亡等風(fēng)險(xiǎn)。近年來,針對絲裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)信號(hào)通路的研究發(fā)現(xiàn),p38MAPK信號(hào)通路在關(guān)節(jié)軟骨的破壞中處于一個(gè)樞紐地位,與軟骨炎性細(xì)胞因子、軟骨細(xì)胞凋亡的產(chǎn)生等都有密切關(guān)系〔10〕。本研究探討COPD相關(guān)性氣管支氣管軟化癥模型構(gòu)建方法,并評(píng)價(jià)了p38MAPK抑制劑的作用效果。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 Wistar大鼠12只,雄性,8周齡,體質(zhì)量230～270 g,SPF級(jí),購于遼寧長生生物技術(shù)股份有限公司,許可證號(hào)SCXK(遼)2020-0001。

1.2試劑、耗材及儀器 脂多糖(Lot.No.426Y0-39,北京索萊寶科技有限公司);伊紅染色液(G1100,Solarbio);超凈高級(jí)封片膠(YZB,BASO);Scott藍(lán)化液(G1865,Solarbio);DMEM/F-12,GlutaMAXTM(10565018,Gibco);胰蛋白酶-乙二胺四乙酸(EDTA)消化液(T1300,Solarbio);青鏈霉素混合液(100X)細(xì)胞培養(yǎng)專用(P1400,Solarbio);胎牛血清(FBS,E600001-0500,BBI Life Sciences);Ⅱ膠原酶(C8150,Solarbio);白細(xì)胞介素(IL)-1β(LC13AP1902,SB);SB203580(GC13595,GLPBIO);CCK-8法細(xì)胞增殖檢測試劑盒(KGA317,凱基生物);軟骨染色液(甲苯胺藍(lán)法;8101A16,LEAGENE);Ⅱ型膠原(AF-1035,Affinity);辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L;ZB-2301,中杉金橋);二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑盒(CW0125,CWBIO);中性樹脂(CW0136,CWBIO);蘇木素染液(AR1180-1,博生德);Collagen Ⅱ(ab188570 abcam);HiScript Ⅱ Q RT SuperMix for熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qPCR,+gDNA wiper;R223-01,Vazyme 諾唯贊);2×SYBR Green PCR Master Mix(A4004M,Lifeint 生命互聯(lián));miRNA 1st Strand cDNA Synthesis Kit(by stem-loop;MR101-02,諾唯贊);miRNA Universal SYBR qPCR Master Mix(MQ101-02,諾唯贊);RIPA細(xì)胞裂解液(C1053,北京普利萊基因技術(shù)有限公司);二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒(CW0014S,康為世紀(jì));30% 丙烯酰胺(A1010,Solarbio);內(nèi)參一抗:Mouse Monoclonal Anti-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH;TA-08,中杉金橋,1/2 000);二抗:辣根酶標(biāo)記山羊抗鼠IgG(H+L;ZB-2305,中杉金橋,1/2 000),目的一抗:兔抗caveolin-1(ab32577,Abcam,1/1 000),兔抗p-p38MAPK(af4001,Affinity,1/500),兔抗腫瘤壞死因子(TNF)-α(af7014,Affinity,1/500),兔抗IL-1β(af5103,Affinity,1/500),兔抗基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-13(af5355,Affinity,1/500),兔抗B細(xì)胞淋巴瘤(Bcl)-2相關(guān)X蛋白(Bax;50599-2-lg,Proteintech,1/5 000),兔抗Bcl-2(bs-34012R,Bioss,1/500);二抗:辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L;ZB-2301,中杉金橋,1/2 000)。

隔膜真空泵(GM-0.5A,天津市津騰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司);顯微鏡(CX41 OLYMPUS);切片機(jī)(2235,Leica);CO2培養(yǎng)箱(BPN-80CW,上海一恒科學(xué)儀器有限公司);倒置熒光顯微鏡(MF53,廣州市明美光電有限公司);全自動(dòng)酶標(biāo)(WD-2102B、蛋白垂直電泳儀(DYY-6C,北京市六一儀器廠);超高靈敏度化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)〔Chemi DocTM XRS+,伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品(上海)有限公司〕。

1.3COPD大鼠模型建立 實(shí)驗(yàn)分為空白對照組、COPD模型組。每組隨機(jī)分配6只大鼠,COPD模型組在飼養(yǎng)第1、8、15、22天用10%水合氯醛按照3 ml/kg的比例腹腔注射麻醉,頸部剃毛,碘伏消毒頸部皮膚,用手術(shù)剪剪開頸部皮膚,鈍性分離頸部肌肉,暴露氣管,用1 ml注射器刺入氣管,緩慢注入0.2 ml脂多糖(LPS)溶液,注射完將大鼠直立旋轉(zhuǎn)1 min,使藥液在肺部均勻分布,肌肉和皮膚分別縫合,縫合完畢后碘伏消毒。在前4 w每天放入染毒箱被動(dòng)吸煙30 min(給藥當(dāng)天不用吸煙),在第5～10周隔天放入染毒箱被動(dòng)吸煙30 min,按照6只大鼠每天8只香煙的比例吸煙?？瞻讓φ战M采用相同方法在氣管內(nèi)滴入等量生理鹽水,正常飼養(yǎng)不予煙熏。

1.4COPD大鼠模型鑒定 麻醉大鼠后取肺組織,生理鹽水沖洗后,使用甲醛溶液固定,再取出組織,流水沖洗數(shù)小時(shí),先后予70%、80%、90%各級(jí)乙醇脫水,純酒精、二甲苯(1∶1)混合液15 min,二甲苯Ⅰ 15 min、Ⅱ 15 min,將透明的肺組織放入石蠟、二甲苯(1∶1)的混合液15 min,再用石蠟Ⅰ透蠟50～60 min、石蠟Ⅱ透蠟50～60 min。然后依次進(jìn)行石蠟包埋、切片、烤片、脫蠟、水化,再使用蘇木素水溶液染色3 min,鹽酸乙醇分化液分化15 s后,水洗,返藍(lán)15 s,流水沖洗,伊紅染色3 min,再依次進(jìn)行流水沖洗、脫水、透明、封片、鏡檢。

1.5氣道軟骨細(xì)胞分離 將模型組斷頸處死后,采用75%酒精浸泡3 min,無菌取下大鼠的氣管及左右主支氣管,放在75%酒精浸泡10 s,取出用磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗兩遍,在體視鏡下取出支氣管軟骨,并剪成1 cm×1 cm大小的軟骨塊,1 000 r/min離心3 min,棄去上清,用0.2%Ⅱ膠原酶過夜消化,次日棄去上清,在加入0.2%Ⅱ膠原酶37 ℃消化30 min,之后加入完全培養(yǎng)基終止消化,1 000 r/min離心3 min,棄去上清加入新鮮配制的培養(yǎng)基,重懸組織塊,接種到培養(yǎng)瓶中進(jìn)行培養(yǎng)。

1.6氣管軟骨細(xì)胞鑒定 采用甲苯胺藍(lán)染色和免疫組織化學(xué)鑒定氣道軟骨細(xì)胞。去除培養(yǎng)基,加入PBS,清洗3次(5 min/次),于軟骨染色液中浸染15～20 min(根據(jù)細(xì)胞量的多少而定),自來水清洗2 min,吸干,加入丙酮,至紫藍(lán)色軟骨細(xì)胞清楚可見,逐級(jí)乙醇脫水,封片,鏡檢。在培養(yǎng)板中用PBS浸洗已爬好細(xì)胞的培養(yǎng)皿,再用4%的多聚甲醛固定15 min,細(xì)胞通透打孔后,加入新鮮配制的3% H2O2,室溫孵育10 min,PBS充分淋洗,非特異性封閉后,用移液槍吸干培養(yǎng)皿中的封閉液后,在每個(gè)培養(yǎng)皿中滴加足夠量的按1∶200比例稀釋好的一抗:Ⅱ膠原,然后放入濕盒中,4 ℃孵育過夜,次日取出在室溫靜置45 min,PBS浸洗玻片3次(5 min/次),滴加聚合辣根酶標(biāo)記抗兔IgG二抗工作液,37 ℃孵育30 min,再次PBS充分淋洗,顯色復(fù)染后脫水、透明、封片、鏡檢。

1.7CCK8法篩選傳代軟骨細(xì)胞及P38MAPK抑制劑(SB203580)劑量 將原代軟骨細(xì)胞傳代至1代,2代,3代,4代的細(xì)胞消化、重懸,計(jì)數(shù),鋪板,細(xì)胞密度為3×103個(gè)/孔;分別在0、1、2、3、4、5 d進(jìn)行CCK8檢測,待測細(xì)胞均更換為相同的培養(yǎng)基(100 μl/孔);每孔加入10 μl CCK8 試劑后,于培養(yǎng)箱中孵育2 h;用酶標(biāo)儀在450 nm波長處檢測每孔的吸光度(OD)值,經(jīng)過數(shù)據(jù)分析繪制細(xì)胞生長曲線,并選擇其中一代細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。將篩選得到的傳代支氣管軟骨細(xì)胞消化、重懸,計(jì)數(shù),鋪板,細(xì)胞密度為5×103個(gè)/孔;待細(xì)胞貼壁后,加入不同劑量的SB203580(5、10、20、30 μmol/L),繼續(xù)傳代培養(yǎng),分別在15、24、48 h進(jìn)行CCK8檢測。將待測的96孔板細(xì)胞的培養(yǎng)基換成每孔100 μl的相同培養(yǎng)基;加入CCK8(10 μl/孔)試劑,置于培養(yǎng)箱中孵育2 h,在450 nm波長處檢測每孔的OD值,經(jīng)過數(shù)據(jù)分析確定傳代軟骨細(xì)胞、SB203580劑量,用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.8建立COPD相關(guān)性氣管支氣管軟化癥(TBM)模型 將篩選出的傳代軟骨細(xì)胞培養(yǎng)至狀態(tài)良好,實(shí)驗(yàn)分為對照組、模型組、P38MAPK抑制劑(SB203580)組。對照組用含1% FBS的血清培養(yǎng)基干預(yù)軟骨細(xì)胞48 h;模型組用含1% FBS的血清培養(yǎng)基、10 ng/ml IL-1β干預(yù)軟骨細(xì)胞48 h;SB203580組加入SB203580處理30 min,再以含1% FBS的血清培養(yǎng)基、10 ng/ml IL-1β干預(yù)軟骨細(xì)胞48 h。

1.9檢測細(xì)胞凋亡率 收集細(xì)胞(1×106～3×106個(gè)),加入1 ml的PBS,1 500 r/min離心3 min,清洗兩遍后,用雙蒸水將5×結(jié)合緩沖液稀釋為1×結(jié)合緩沖液,然后取300 μl預(yù)冷的重懸細(xì)胞,每管各加入5 μl的膜聯(lián)蛋白Ⅴ-異硫氰酸熒光素(Annexin Ⅴ-FITC)和10 μl的碘化丙啶(PI),輕微混勻,室溫下避光孵育10 min,再加入預(yù)冷的1×結(jié)合緩沖液200 μl/管,混勻,采用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡。

1.10Western印跡檢測 將各組培養(yǎng)皿中的細(xì)胞培養(yǎng)液棄掉,加入細(xì)胞裂解液(100 μl/孔),放置于冰上20 min,將細(xì)胞刮至一側(cè),EP管做好標(biāo)記后,采用移液槍將細(xì)胞吸入EP管中。以12 000 r/min離心10 min,將上清液取出,移至新的EP管中,在-20 ℃下保存總蛋白。BCA試劑盒測定蛋白濃度,蛋白變性,進(jìn)行1.5 h的十二烷基苯磺酸鈉凝膠電泳(SDS-PAGE),然后再進(jìn)行1.5 h的300 mA恒流轉(zhuǎn)膜。用聚偏氟乙烯(PVDF)膜孵育一抗,在4 ℃條件下過夜,次日在室溫下用PVDF膜孵育二抗2 h,洗膜,然后用發(fā)光液浸濕,采用超高靈敏度化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)顯影成像。

1.11qPCR分析 收集各組細(xì)胞于培養(yǎng)皿中,加入Trizon Reagent(1 ml/皿)后,加入0.2 ml氯仿,分別采用miRNA提取試劑盒和mRNA超純提取試劑盒提取miRNA、mRNA,紫外可見分光光度計(jì)測定miRNA和mRNA的濃度和純度(OD260/OD280),通過miRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成micDNA、mRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA,然后定量PCR。反應(yīng)體系如下:10 μl 2×SYBR Green PCR Master Mix或10 μl miRNA Universal SYBR qPCR Master Mix、1 μl cDNA、0.4 μl上游引物、0.4 μl下游引物、8.2 μl雙蒸水RNase Free d H2O 。反應(yīng)步驟如下:10 min 95 ℃預(yù)變性;10 s 95 ℃變性;30 s 58 ℃退火;30 s 72 ℃延伸;以上進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。內(nèi)參為β-actin,根據(jù)2-△△Ct法計(jì)算基因的相對表達(dá)量。見表1。

表1 引物名稱及序列

1.12統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS23.0軟件進(jìn)行單因素方差分析和LSD分析。繪圖采用GraphPad Prism9軟件,Adobe Photoshop CS6軟件用于合成組圖,各條帶灰度值采用Image Pro Plus軟件分析。

2 結(jié) 果

2.1COPD大鼠模型鑒定 HE染色結(jié)果顯示:對照組支氣管管腔圓闊,無壞死細(xì)胞,肺泡結(jié)構(gòu)整齊,肺泡間隔無增厚,未見明顯炎癥細(xì)胞浸潤;模型組支氣管管腔明顯增厚,管腔狹窄,纖毛上皮細(xì)胞變性壞死脫落,肺泡間隔增寬,結(jié)構(gòu)融合或紊亂,可見大量巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等炎癥細(xì)胞浸潤。見圖1。表明COPD大鼠模型構(gòu)建成功。

圖1 兩組肺組織病理結(jié)構(gòu)(HE染色,×100)

2.2氣管軟骨細(xì)胞鑒定 甲苯胺藍(lán)染色和免疫組化分析結(jié)果顯示:經(jīng)甲苯胺藍(lán)特異性染色后細(xì)胞周圍有少量淺藍(lán)色異染顆粒,胞質(zhì)呈紫藍(lán)色,細(xì)胞核呈深藍(lán)色;Ⅱ型膠原免疫組織化學(xué)分析中胞質(zhì)被染成棕黃色,可見黃褐色顆粒,細(xì)胞外也可見到棕黃色,提示有Ⅱ型膠原的合成,表明分離得到的細(xì)胞為支氣管軟骨細(xì)胞。見圖2。

圖2 COPD大鼠支氣管軟骨細(xì)胞(×400)

2.3傳代軟骨細(xì)胞篩選 倒置顯微鏡下顯示,氣管軟骨分離、消化和培養(yǎng)后,3～5 d內(nèi)逐漸從軟骨組織塊邊緣長出為多角形或三角形的原代軟骨細(xì)胞,胞核為圓形或橢圓形,位于胞體中心,1～3個(gè)核仁,胞質(zhì)豐富,隨著細(xì)胞生長可見細(xì)胞成簇現(xiàn)象和重疊生長現(xiàn)象,細(xì)胞增殖明顯,細(xì)胞間開始有突起相連,周圍有基質(zhì)樣物質(zhì)沉積,細(xì)胞保持圓形或橢圓形生長狀態(tài),單層生長,約1 w鋪滿培養(yǎng)瓶。傳代后,第1代軟骨細(xì)胞貼壁時(shí)間較原代縮短,一般24 h即可完全貼壁。第2代軟骨細(xì)胞生長狀態(tài)較好,增殖較快,接種6 h后即可見部分細(xì)胞已經(jīng)貼壁,4～5 d后即可達(dá)到90%細(xì)胞匯合,細(xì)胞大小一致,呈多角形,胞質(zhì)多,胞體大,核仁2～3個(gè)。第3～4代軟骨細(xì)胞生長平穩(wěn),大約第4天即達(dá)到平臺(tái)期;傳至第5代及以后,軟骨細(xì)胞生長十分緩慢,多為長梭形,體積肥大伴較多空泡改變,邊界不清,稀疏平鋪培養(yǎng)瓶壁上。見圖3。大鼠支氣管軟骨細(xì)胞生長曲線顯示,第1、2代細(xì)胞在培養(yǎng)前4 d OD值增長迅速,而后變平穩(wěn),第3、4代整體的增長趨勢較為平穩(wěn),且第4代的OD450略高于第3代,最終確定選擇第4代細(xì)胞用于下一步實(shí)驗(yàn)。見表2。

圖3 大鼠支氣管軟骨細(xì)胞傳代(×100)

表2 不同時(shí)間傳代骨細(xì)胞生長OD值

2.4COPD相關(guān)性TBM軟骨細(xì)胞模型鑒定 COPD大鼠模型制備成功后,分離并培養(yǎng)氣管軟骨,將IL-1β加入第4代軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)細(xì)胞退變,以此建立COPD相關(guān)性TBM模型,對照組僅以1% FBS的血清培養(yǎng)基干預(yù)。結(jié)果顯示:倒置顯微鏡下,對照組細(xì)胞生長平穩(wěn),4～5 d即可鋪滿瓶底,細(xì)胞呈多角形,胞質(zhì)多,胞體大,大小較一致;模型組細(xì)胞生長速度減慢,一般要9～10 d才能長滿瓶底,細(xì)胞變狹長,多為單層生長,胞質(zhì)內(nèi)可見大量空泡,細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則。甲苯胺藍(lán)特異性染色后,對照組細(xì)胞核染成深藍(lán)色,胞質(zhì)呈紫藍(lán)色,細(xì)胞形態(tài)規(guī)則,核仁清晰,以1～3個(gè)核仁多見,細(xì)胞周圍也可見淺藍(lán)色異染顆粒;模型組中染色淺而稀疏,細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則,僅殘存的軟骨細(xì)胞及簇集的細(xì)胞核藍(lán)染。免疫組織化學(xué)分析顯示:對照組胞質(zhì)呈棕黃色,見較多黃褐色顆粒,細(xì)胞外也被染成棕黃色,提示有Ⅱ型膠原的合成;模型組顯示胞質(zhì)黃褐色顆粒型稀疏,提示Ⅱ膠原含量明顯降低。以上表明IL-1β成功誘導(dǎo)了COPD模型中軟骨細(xì)胞退變,從而建立COPD相關(guān)性TBM軟骨細(xì)胞模型。見圖4、表3。

圖4 COPD相關(guān)性TBM細(xì)胞模型鑒定

表3 不同劑量SB203580處理對氣管軟骨細(xì)胞增殖活性的影響

2.5不同劑量SB203580篩選 與0 μmol/L濃度SB203580相比,5 μmol/L處理的細(xì)胞活性顯著升高(P<0.05),且細(xì)胞活性在15、24、48 h時(shí)均最高,且在處理48 h時(shí)提高細(xì)胞活性作用更明顯。因此選定5 μmol/L濃度SB203580處理48 h進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

2.6SB203580對細(xì)胞凋亡和增殖活性的影響 流式凋亡檢測顯示:模型組凋亡率顯著高于其他組。SB203580處理后凋亡率顯著低于模型組。見圖5。CCK8檢測顯示:模型組細(xì)胞增殖率〔(101.09±2.27)%〕顯著低于SB203580組〔(124.37±4.55)%,P<0.05〕。以上表明SB203580處理可以顯著降低細(xì)胞凋亡,增強(qiáng)細(xì)胞活性。

圖5 3組SB203580影響細(xì)胞凋亡

2.7Western印跡檢測caveolin-1-p38MAPK信號(hào)通路中蛋白表達(dá) 模型組caveolin-1、p38MAPK、MMP-13、1L-1β蛋白表達(dá)水平均顯著高于對照組,SB203580處理后能顯著降低上述蛋白表達(dá)水平(P<0.05)。以上表明在COPD相關(guān)性TBM細(xì)胞模型中,IL-1β激活了caveolin-1-p38MAPK信號(hào)通路,而SB203580處理可有效抑制caveolin-1-p38MAPK信號(hào)通路中caveolin-1、p38MAPK、MMP-13、1L-1β蛋白表達(dá)。見表4。

表4 各組caveolin-1-p38MAPK信號(hào)通路中相關(guān)蛋白及基因表達(dá)

2.8qPCR檢測caveolin-1-p38MAPK信號(hào)通路中基因表達(dá) 模型組caveolin-1、p38MAPK、MMP-13、1L-1β mRNA表達(dá)水平均顯著高于對照組,SB203580處理后能顯著下調(diào)上述基因表達(dá)。SB203580處理可以有效抑制caveolin-1-p38MAPK信號(hào)通路中MMP-13、p38MAPK、caveolin-1、IL-1β基因的表達(dá),從而發(fā)揮軟骨保護(hù)作用。見表4。

3 討 論

氣管支氣管軟化癥按病因不同分為先天性和繼發(fā)性。先天性氣管支氣管軟化癥多見于早產(chǎn)兒,其中男性患兒多見,常由氣道軟骨發(fā)育異常造成〔11,12〕。目前認(rèn)為COPD是繼發(fā)性氣管支氣管軟化癥最常見的危險(xiǎn)因素之一,多數(shù)學(xué)者認(rèn)為與COPD持續(xù)的氣道炎癥、肺氣腫彈性纖維減少和慢性咳嗽產(chǎn)生的氣道壓力改善等因素有關(guān),但其誘導(dǎo)氣管支氣管軟化癥的機(jī)制仍舊不明〔13〕。

臨床上并非所有COPD都合并有氣管支氣管軟化癥,因此需要建立一種穩(wěn)定且理想的COPD相關(guān)性氣管支氣管軟化癥模型,在前期研究中本團(tuán)隊(duì)通過在香煙提取物刺激離體氣管軟骨細(xì)胞基礎(chǔ)上加入IL-1β誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞退變,成功建立了一種造模方法〔14〕。盡管試驗(yàn)證實(shí)它能較好的模擬COPD相關(guān)性氣管支氣管軟化癥的病理過程。盡管研究顯示COPD造模方法有很多,如LPS或蛋白酶氣管滴入、煙熏、基因水平造模等〔15～17〕,但目前認(rèn)為采用多因素聯(lián)合的方式進(jìn)行COPD造模更為符合人類 COPD 病理改變及特征變化,其中煙熏聯(lián)合氣管內(nèi)滴入LPS是主要的方法之一〔18～20〕。因此,本課題組采用氣管內(nèi)滴入LPS加煙熏的方法建立COPD相關(guān)性氣管支氣管軟化癥模型〔21～23〕,研究結(jié)果證實(shí)該方法穩(wěn)定可靠,與前期研究結(jié)論一致。

研究表明,氣管支氣管軟化是由于具有支撐氣道作用的軟骨退化所致,并且在晚期軟骨環(huán)還可被吸收形成膜性組織〔24〕。研究發(fā)現(xiàn) p38MAPK 信號(hào)通路在關(guān)節(jié)軟骨的破壞中處于一個(gè)樞紐地位〔10〕。p38MAPK 是一種分子量為38 kD的絲裂原活化蛋白激酶,會(huì)參與細(xì)胞的生長、分化、退變、衰老及凋亡等多種生理病理過程〔25〕。本研究結(jié)果表明,p38MAPK信號(hào)通路參與了COPD氣管軟骨細(xì)胞退變和損傷過程?，F(xiàn)在認(rèn)為caveolin-1與肺氣腫、COPD和骨關(guān)節(jié)炎等衰老性疾病密切相關(guān)〔26〕。caveolin-1 蛋白是p38MAPK信號(hào)通路上游的關(guān)鍵信號(hào)分子〔27〕。本研究結(jié)果表明,caveolin-1通過激活p38MAPK信號(hào)參與了COPD氣管軟骨細(xì)胞退變。

MMP-13是降解軟骨細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的主要酶,通過對Ⅱ型膠原的不可逆降解,從而破壞關(guān)節(jié)軟骨〔28〕。有研究表明,IL-1β等激活p38MAPK,磷酸化的p38MAPK可以激活活化劑蛋白-1,活化的活化劑蛋白-1可以與MMP-13等相應(yīng)基因啟動(dòng)區(qū)相結(jié)合,從而啟動(dòng)MMPs過表達(dá),MMPs 的表達(dá)增加導(dǎo)致軟骨膠原的降解加強(qiáng)〔29,30〕。本研究表明,IL-1β激活了caveolin-1-p38MAPK信號(hào)通路,從而上調(diào)下游效應(yīng)因子MMP-13表達(dá),加重軟骨細(xì)胞的破壞。