CMTM6和PD-L1在宮頸鱗癌組織中的表達(dá)及臨床意義

馬 艷 李隆玉 敖梅紅 盧朝霞

宮頸鱗癌占宮頸癌75%～80%,惡性程度高、發(fā)病率和死亡率高[1-2]。盡管宮頸癌篩查不斷普及、手術(shù)與放療技術(shù)不斷進(jìn)步、化療藥物不斷更新,但宮頸癌的發(fā)病與死亡人數(shù)仍呈現(xiàn)出增長(zhǎng)趨勢(shì)[3]。目前宮頸癌以手術(shù)治療和放療為主,并輔以化療。近年來(lái)免疫治療是宮頸鱗癌新的研究熱點(diǎn),其中研究人員對(duì)程序性死亡配體1(Programed CellDeathLigand-1,PD-L1)和趨化素樣因子超家族蛋白6(CKLF-like MARVEL transmembrane domain containing 6,CMTM6)尤為關(guān)注。然而,有關(guān)CMTM6和PD-L1在宮頸鱗癌中表達(dá)的研究較少。

1 材料與方法

1.1 材料

選擇2015年1月至2016年12月江西省婦幼保健院病理科存檔的滿足實(shí)驗(yàn)條件的石蠟包埋組織,實(shí)驗(yàn)組納入標(biāo)準(zhǔn):我院初診,2009年國(guó)際婦產(chǎn)科聯(lián)盟(international Federation of Gynecology and Obstetrics,FIGO)臨床分期為Ⅰa～Ⅱa 期早期宮頸鱗癌患者,行宮頸癌根治術(shù),經(jīng)組織病理學(xué)確診;沒(méi)有合并其他系統(tǒng)的癌癥;術(shù)前未接受放射及化學(xué)藥物治療;無(wú)高血壓及心血管疾病;進(jìn)行過(guò)5年生存情況隨訪;資料完整。對(duì)照組納入標(biāo)準(zhǔn):入組患者為同期住院,年齡與實(shí)驗(yàn)組無(wú)明顯差異,正常宮頸組織來(lái)源于因子宮良性病變(如子宮肌瘤)行全子宮切除的病例,宮頸癌前病變?yōu)樾袑m頸錐切術(shù)的病例。全部病例經(jīng)組織病理學(xué)診斷證實(shí),臨床確診;既往無(wú)癌癥史,無(wú)高血壓及心血管疾病。本研究已經(jīng)獲得醫(yī)院倫理委員會(huì)的審查和批準(zhǔn)。

患者隨訪主要是通過(guò)查閱病歷及電話聯(lián)系,隨訪終點(diǎn)為患者手術(shù)日至疾病復(fù)發(fā)或(因任何原因)死亡,或隨訪時(shí)間滿5年。最終實(shí)驗(yàn)組共納入宮頸癌組織46例,對(duì)照組中宮頸癌前病變組織26例,正常宮頸組織20例。

1.2 方法

免疫組化染色:將石蠟包埋組織連續(xù)切片,常規(guī)脫蠟,微波抗原修復(fù),滴加稀釋好的一抗,室溫放置1 h后放入4 ℃恒溫箱中孵育過(guò)夜,加入酶標(biāo)二抗37 ℃孵育1 h,滴加現(xiàn)配的DAB顯色劑,蘇木精復(fù)染2 min,脫水,封片、晾干,顯微鏡檢。

1.3 結(jié)果判斷

首先,在低倍顯微鏡下觀察整個(gè)切片,并選擇表達(dá)最多的區(qū)域,當(dāng)細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞膜中呈現(xiàn)黃色至棕褐色時(shí),呈陽(yáng)性染色,結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)[4],陽(yáng)性細(xì)胞的染色強(qiáng)度分為:0分為無(wú)染色,1分為淺黃色,2分為棕黃色,3分為棕褐色。陽(yáng)性細(xì)胞密度的分級(jí)如下:陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)<10%為1分,10%～50%為2分,>50%為3分,兩個(gè)分?jǐn)?shù)相乘的結(jié)果≥3分為陽(yáng)性,即高表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

用SPSS 26.0建立數(shù)據(jù)庫(kù)并進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,計(jì)量資料用t檢驗(yàn),計(jì)數(shù)資料用χ2檢驗(yàn),采用McNemar檢驗(yàn)差異性,Kappa檢驗(yàn)一致性,用Kaplan-Meier曲線分析生存時(shí)間,P<0.05表示差異有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 一般情況

宮頸鱗癌組年齡(48.24±8.12)歲,癌前病變組年齡(49.35±10.78)歲,正常宮頸組年齡(48.92±9.78)歲,三者年齡差異無(wú)顯著性,t=2.253,P>0.05。宮頸鱗癌Ⅰa期3例、Ⅰb期31例、Ⅱa期12例;宮頸鱗癌伴有盆腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移15例,無(wú)盆腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移31例;有脈管癌栓29例,無(wú)脈管癌栓17例;有宮旁浸潤(rùn)7例,無(wú)宮旁浸潤(rùn)39例。

2.2 CMTM6、PD-L1在3組組織中的表達(dá)

CMTM6在正常宮頸、癌前病變和宮頸鱗癌組織中高表達(dá)分別為0%、11.54%、60.87%,PD-L1在3組高表達(dá)分別為10.00%、15.38%、71.74%,CMTM6和PD-L1在宮頸鱗癌中表達(dá)增高,差異有極顯著性(見(jiàn)表1)。進(jìn)行組間分析,CMTM6和PD-L1在宮頸鱗癌組織中的高表達(dá)都顯著高于癌前病變組織(χ2=31.081,P=0.00;χ2=32.581,P=0.00),差異有極顯著性;而CMTM6和PD-L1在正常宮頸和癌前病變組織中高表達(dá)都無(wú)顯著性差異(fisher's精確檢驗(yàn),P值分別為0.246、0.684)。結(jié)果進(jìn)一步說(shuō)明CMTM6和PD-L1在正常宮頸和癌前病變少有高表達(dá),而在宮頸鱗癌中表達(dá)增高。

表1 CMTM6和PD-L1在正常宮頸、癌前病變和宮頸鱗癌組織中的表達(dá)(例,%)

2.3 CMTM6、PD-L1表達(dá)在宮頸鱗癌中的相互關(guān)聯(lián)

采用McNemar檢驗(yàn)兩者差異性,提示CMTM6、PD-L1表達(dá)在宮頸鱗癌中差異無(wú)顯著性(P=0.227);Kappa檢驗(yàn)兩者一致性,提示CMTM6、PD-L1表達(dá)在宮頸鱗癌中呈一致性(P=0.001,Kappa值為0.472),提示CMTM6和PD-L1的表達(dá)在宮頸鱗癌中密切相關(guān)。見(jiàn)表2。

表2 CMTM6和PD-L1表達(dá)在宮頸鱗癌中的相互關(guān)聯(lián)/例

2.4 CMTM6、PD-L1表達(dá)與宮頸鱗癌分期情況

在早期宮頸鱗癌中,CMTM6、PD-L1表達(dá)與早期宮頸鱗癌FIGO分期無(wú)明顯關(guān)聯(lián)。見(jiàn)表3。

表3 CMTM6、PD-L1表達(dá)與宮頸鱗癌分期情況/例

2.5 CMTM6、PD-L1表達(dá)與宮頸鱗癌浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移情況

宮頸鱗癌患者出現(xiàn)脈管癌栓、宮旁浸潤(rùn)、淋巴轉(zhuǎn)移時(shí),CMTM6表達(dá)增高;但PD-L1高表達(dá)與宮頸鱗癌脈管癌栓、宮旁浸潤(rùn)、淋巴轉(zhuǎn)移無(wú)明顯關(guān)聯(lián)(P>0.05)。見(jiàn)表4。

表4 CMTM6表達(dá)與宮頸鱗癌浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移情況/例

2.6 CMTM6、PD-L1表達(dá)與早期宮頸鱗癌患者5年DFS的關(guān)系

通過(guò)Kaplan-Meier分析,CMTM6高表達(dá)組5年DFS均值為(46.04±3.70)月,低表達(dá)組均值為(56.89±2.17)月,Log Rank整體比較,P=0.04,2組整體的生存情況存在顯著性差異,繪制2組生存曲線(圖1),從生存曲線可見(jiàn),CMTM6低表達(dá)組的5年DFS要高于CMTM6高表達(dá)組。PD-L高表達(dá)組5年DFS均值為(49.76±3.27)月,低表達(dá)組均值為(51.62±3.32)月,Log Rank整體比較,P=0.51,2組整體的生存情況無(wú)顯著性差異,繪制2組生存曲線(圖2),從生存曲線可見(jiàn),PD-L1高表達(dá)和低表達(dá)組的5年DFS無(wú)顯著差異。

圖1 CMTM6表達(dá)與CSCC患者5年生存分析

圖2 PD-L1表達(dá)與CSCC患者5年生存分析

3 討論

宮頸癌是影響女性生殖系統(tǒng)健康的主要惡性腫瘤之一,危害非常大,因此針對(duì)宮頸癌的病因、診斷、治療等方面的研究從未停止。目前,宮頸癌的主要治療方法有手術(shù)、放療或化療,但部分宮頸癌的治療效果和預(yù)后較差,這些療法尤其對(duì)復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移性宮頸癌患者的收益有限。因此,探索治療宮頸癌的新方法,尋找宮頸癌的新分子靶點(diǎn),對(duì)宮頸癌患者的治療和生存率提高具有重要意義。

程序性死亡受體1(programmed cell death proteinl,PD-1)為活化T淋巴細(xì)胞上的誘導(dǎo)型基因,可以介導(dǎo)各種腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸,PD-1/PD-L1是一對(duì)重要的負(fù)性共刺激分子,在免疫系統(tǒng)中抑制免疫反應(yīng)、調(diào)節(jié)免疫耐受和維持免疫平衡。PD-L1在許多類型的腫瘤組織中表達(dá)是上調(diào)的,而在癌旁組織和正常組織中表達(dá)較低,甚至不表達(dá)。有研究結(jié)果顯示[5]PD-L1在宮頸癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率為 81.3%,本研究發(fā)現(xiàn)PD-L1在正常宮頸、癌前病變和宮頸鱗癌組織中高表達(dá)分別為10%、15.38%、71.74%,隨著病理分級(jí)的增加,PD-L1的高表達(dá)逐漸增加。徐苗[6]的研究結(jié)果也顯示隨著PD-L1表達(dá)增加宮頸上皮內(nèi)瘤變(cervical intraepithelial neoplasia,CIN)等級(jí)隨之增加。PD-L1在多種腫瘤細(xì)胞都有表達(dá),包括肺癌、口腔鱗癌等。PD-L1通過(guò)與PD-1結(jié)合,抑制T細(xì)胞遷移、增殖,以達(dá)到腫瘤免疫逃逸[7]。近年來(lái)PD-l/PD-L1信號(hào)通路在腫瘤治療領(lǐng)域受到了廣泛關(guān)注 。有研究表明[8]PD-l/PD-L1信號(hào)通路與乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后密切相關(guān),PD-l/PD-L1抑制劑在乳腺癌中具有良好的抗腫瘤活性[9]。PD-L1在腸癌中高表達(dá),且PD-L1 陽(yáng)性表達(dá)與較短的總體生存期相關(guān)[10-11]?？筆D-L1抗體可以治療黑色素瘤、腎細(xì)胞癌、肺癌,結(jié)腸癌,頭頸部腫瘤和胃癌等人類癌癥。Kim等研究顯示[12-13],宮頸鱗癌組織中PD-L1的高表達(dá),與腫瘤發(fā)生發(fā)展、腫瘤浸潤(rùn)深度有關(guān)。Rotman等[14]指出宮頸癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與PD-L1表達(dá)升高相關(guān),認(rèn)為 PD-L1 的陽(yáng)性表達(dá)對(duì)宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展與轉(zhuǎn)移有一定作用。而本研究PD-L1高表達(dá)與宮頸鱗癌臨床分期、脈管浸潤(rùn)、宮旁浸潤(rùn)、淋巴轉(zhuǎn)移無(wú)明顯關(guān)聯(lián),這可能與所選病例均為早期宮頸癌有關(guān)。Gibney等[15]認(rèn)為PD-L1的表達(dá)不影響晚期宮頸癌患者的生存期,本研究結(jié)果亦表明早期宮頸癌患者PD-L1高表達(dá)和低表達(dá)組的5年DFS無(wú)顯著差異。

PD-L1在腫瘤組織中特異性地高表達(dá),使其成為了腫瘤免疫治療的靶點(diǎn)。目前,美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)了5種抗PD-1/PD-L1抗體用于宮頸癌的治療。但單一的免疫治療并不敏感,PD-1/PD-L在宮頸癌的緩解率為13.3%～26.3%[16],因此聯(lián)合免疫治療至關(guān)重要。

CMTM6 是趨化素樣因子超家族成員,在腫瘤細(xì)胞免疫逃逸和免疫抑制中有著非常重要的作用。CMTM6在多種癌癥中均有異質(zhì)性表達(dá)[17]。本研究發(fā)現(xiàn)CMTM6在正常宮頸、癌前病變和宮頸鱗癌組織中高表達(dá)分別為0%、11.54%、60.87%,CMTM6的陽(yáng)性表達(dá)隨病理級(jí)別的升高而逐漸升高。CMTM6的表達(dá)與年齡、臨床分期無(wú)關(guān),而宮頸鱗癌患者出現(xiàn)脈管癌栓、宮旁浸潤(rùn)、淋巴轉(zhuǎn)移時(shí),CMTM6表達(dá)增高。Kaplan-Meier分析表明宮頸鱗癌患者CMTM6低表達(dá)組的5年DFS要高于CMTM6高表達(dá)組,CMTM6高表達(dá)的宮頸鱗癌患者生存期更短、預(yù)后更差。CMTM6在肺鱗癌的高表達(dá)與較差的無(wú)復(fù)發(fā)生存期顯著相關(guān)[18]。CMTM6過(guò)表達(dá)預(yù)示頭頸部鱗狀細(xì)胞癌患者預(yù)后不良[19]。胃癌[20-21]腫瘤組織中CMTM6高表達(dá),且患者預(yù)后較差。CMTM6表達(dá)與原發(fā)性肝癌(hepatic cell carcinoma,HCC)的轉(zhuǎn)移相關(guān),CMTM6陽(yáng)性組與CMTM6陰性組HCC患者的生存時(shí)間存在差異。而在肺腺癌[22]CMTM6高表達(dá)的患者生存期較好。非小細(xì)胞肺癌(non-small-cell carcinoma,NSCLC)CMTM6高表達(dá)與NSCLC患者預(yù)后較好相關(guān)[23]。CMTM6在結(jié)直腸癌(colorectalcancer,CRC)中表達(dá)上調(diào),預(yù)示著CRC患者預(yù)后良好[24]。這些均表示在不同類型的腫瘤中CMTM6可能有不同的表達(dá)和不同的調(diào)節(jié)。

CMTM6是PD-L1的關(guān)鍵調(diào)控因子[25],能夠促進(jìn)PD-L1的表達(dá),特異性保護(hù)PD-L1免受降解。在黑色素瘤中CMTM6的表達(dá)與PD-L1在蛋白水平和mRNA水平均呈正相關(guān),CMTM6和PD-L1的高表達(dá)與患者的較長(zhǎng)生存期顯著相關(guān)[26]。CMTM6與PD-L1共表達(dá)的粗梁實(shí)體型肝癌(macrotrabecular-massive subtype of hepatocellular carcinoma,MTM HCC)患者發(fā)生進(jìn)展和死亡的風(fēng)險(xiǎn)更高。CMTM6與PD-L1共表達(dá)對(duì)HCC患者,特別是MTM HCC患者的預(yù)后有不良影響[27-28]。在肺鱗癌(lung squamous carcinoma,LUSC)患者中,CMTM6與PD-L1在mRNA和蛋白水平上呈正相關(guān)[29-30]。胃癌組織中CMTM6的表達(dá)與PD-L1的陽(yáng)性表達(dá)顯著相關(guān)[31]。本研究的McNemar檢驗(yàn)提示CMTM6、PD-L1表達(dá)在宮頸鱗癌中差異無(wú)顯著性,Kappa檢驗(yàn)提示CMTM6、PD-L1表達(dá)在宮頸鱗癌中呈一致性,提示CMTM6和PD-L1的表達(dá)在宮頸鱗癌中密切相關(guān)。目前PD-l/PD-L1靶向治療是宮頸癌的重要治療方法之一,因此,CMTM6也有可能成為宮頸癌靶向治療的新靶點(diǎn)。

綜上可知,CMTM6和PD-L1在早期宮頸鱗癌患者中表達(dá)增高,對(duì)診斷和個(gè)性化治療有重要的臨床意義。CMTM6可作為早期宮頸鱗癌浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移預(yù)警及生存預(yù)后的評(píng)價(jià)指標(biāo)。

然而,本研究樣本量較小且局限于早期宮頸鱗癌,期望能進(jìn)一步擴(kuò)大研究范圍,包含宮頸癌不同病理類型、各個(gè)期別的大樣本或多中心研究,建立CMTM6與PD-L1表達(dá)對(duì)宮頸癌診斷和預(yù)后模型,幫助臨床醫(yī)生選擇更有效的宮頸癌治療方法及準(zhǔn)確評(píng)估預(yù)后。