氯胺酮預(yù)處理通過減輕炎癥反應(yīng)改善乳腺癌荷瘤小鼠放射性肺損傷的機制

李兵達 徐 怡

放療(Radiotherapy)是乳腺癌治療的常用手段,由于肺對輻射比較敏感,因此胸部放療往往會造成肺損傷,稱為放射性肺損傷(radiotherapy induced lung injury,RILI)[1]。雖然隨著調(diào)強放療、立體定向放射治療等高度個性化放射治療技術(shù)的發(fā)展,肺損傷已能夠最大限度地減少,但仍有高達20%的病例被報道了嚴重的肺毒性[2],RILI 的預(yù)防和治療已得到較廣泛的關(guān)注。氯胺酮(Ketamine)因其具有良好的鎮(zhèn)痛和麻醉作用成為臨床常用的全身麻醉藥。近年來研究還發(fā)現(xiàn)氯胺酮有器官保護作用,如氯胺酮預(yù)處理對肝臟缺血再灌注引起的急性肺損傷有明顯的保護作用[3],氯胺酮預(yù)處理對谷氨酸誘發(fā)大鼠的肺損傷有保護作用[4]等。氯胺酮預(yù)處理對乳腺癌小鼠放療導(dǎo)致的RILI的作用如何,目前尚無相關(guān)研究。有研究表明,氯胺酮可擴張支氣管,并抑制促炎細胞因子分泌,發(fā)揮抗炎作用[5]。本研究以氯胺酮腹腔注射預(yù)處理乳腺癌荷瘤小鼠后,以射線對小鼠胸部區(qū)域進行照射,觀察氯胺酮對RILI小鼠肺組織病理損傷和肺纖維化的影響,并通過檢測肺組織中炎癥因子的含量變化,探討氯胺酮對小鼠RILI的作用機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

鹽酸氯胺酮注射液(CAS No.1867-66-9,Sigma-Aldrich),HE染液(武漢谷歌生物科技有限公司),Masson染液(武漢谷歌生物科技有限公司),細胞裂解試劑盒(美國 Invitrogen 公司),TNF-αELISA試劑盒(南京建成生物),IL-6 ELISA試劑盒(南京建成生物)。

1.2 實驗動物

4～6周齡的IVC級成年雌性C57BL/6小鼠購自長沙天勤生物(長沙,中國),在屏障環(huán)境中飼養(yǎng),小鼠自由飲水和攝取飼料,飼養(yǎng)條件為22～25 ℃,正常晝夜循環(huán)各12 h。實驗按照美國國立衛(wèi)生研究院出版的《實驗動物護理和使用指南》進行,由南昌樂悠生物科技有限公司動物倫理委員會批準(zhǔn)并監(jiān)督(RYE2020091101)。

1.3 模型構(gòu)建與實驗方法

1.3.1 細胞培養(yǎng)和小鼠乳腺腫瘤模型的構(gòu)建 E0771乳腺腺癌細胞(上海富恒生物公司)在含有10%小牛血清的DMEM中培養(yǎng),培養(yǎng)環(huán)境為37 ℃,5% CO2。將對數(shù)生長期的細胞制成1×107/ml的細胞懸液,在小鼠左側(cè)第二對乳墊下注射100 μL的細胞懸液,接種成功后監(jiān)測腫瘤的生長情況。

1.3.2 動物分組和實驗方法 將30只成年雌性C57BL/6乳腺癌荷瘤小鼠(腫瘤體積為100～200 mm3)隨機分為3組:(1)單純放療組(R組,n=10),小鼠每日放療前腹腔注射生理鹽水,2 h后腹腔注射戊巴比妥鈉80 mg/kg麻醉小鼠。小鼠麻醉后仰臥位暴露整個胸部區(qū)域包括腫瘤,使用醫(yī)用直線加速器(Varian Trilogy,FL,USA)以5 Gy劑量、300 cGy/min劑量率的6 MV X射線能量照射整個胸部區(qū)域,源面距離設(shè)置為100 cm,輻射場設(shè)置為1 cm×1 cm。連續(xù)照射5天,每天1次。(2)氯胺酮預(yù)處理組(K組,n=10),小鼠以每日放療前以10 mg/kg氯胺酮腹腔注射預(yù)處理,2 h后以戊巴比妥鈉麻醉后,以5 Gy射線劑量照射小鼠胸部區(qū)域,連續(xù)照射5天,每天1次。(3)對照組(C組,n=10),小鼠每日僅腹腔注射生理鹽水,不予射線照射。

1.4 標(biāo)本處理與觀察指標(biāo)

1.4.1 小鼠肺標(biāo)本采集和肺濕/干重量比值測定 放療結(jié)束2周后,以戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉小鼠,麻醉成功后,用無菌解剖器械快速完整取出小鼠的左肺,左肺洗凈,濾紙吸干水和血液后稱取肺濕重,隨后將完整左肺烘干至質(zhì)量恒定,稱肺干重。

1.4.2 小鼠肺組織HE 染色以及病理損傷評分 取小鼠的部分右肺在多聚甲醛中固定24 h后,先對標(biāo)本進行脫水處理,然后用液體石蠟包埋固定后冷卻,用切片機做連續(xù)薄層切片,將合格無損傷的切片烘干備用。肺損傷病理評分方法參照文獻進行[6]。所有病理切片閱片和評分均由同一個人進行,光鏡下每個切片取3個視野,每個切片病理評分平均值記為該標(biāo)本的病理評分。

1.4.3 小鼠肺組織Masson 染色以及肺纖維化情況分析 取小鼠右肺組織石蠟切片,脫蠟,重鉻酸鉀染色,鐵蘇木精染色,麗春紅酸性品紅染色,磷鉬酸染色,苯胺藍染色后,再用冰醋酸分化脫水,最后透明封片后拍照,肺纖維化程度及膠原沉積面積用 Image J 分析。

1.4.4 小鼠肺組織IL-6、TNF-α 含量檢測 部分小鼠的右肺組織保存于-80 ℃冰箱,冰上自然解凍后充分研磨裂解后離心,取上清采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)法檢測小鼠肺組織中IL-6、TNF-α的含量。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 氯胺酮預(yù)處理對乳腺癌荷瘤小鼠放療后肺組織濕/干比的影響

與C組比較,R組和K組小鼠肺組織濕/干比值顯著升高(P<0.05);與R組比較,K組小鼠肺組織濕/干比比值顯著降低(P<0.05),結(jié)果見表1。

表1 各組小鼠肺組織濕重、干重和濕/干比值

2.2 氯胺酮預(yù)處理對乳腺癌荷瘤小鼠放療后肺組織損傷的影響

C組小鼠肺組織結(jié)構(gòu)正常,未見明顯充血、水腫及炎性細胞浸潤;與C組比較,R組小鼠肺組織結(jié)構(gòu)損傷較嚴重,可見肺間質(zhì)水腫,肺間質(zhì)內(nèi)見大量炎性細胞浸潤和炎性滲出,肺泡間隔明顯增厚;與R組比較,K組小鼠肺組織損傷程度明顯更輕,僅有少量炎性細胞浸潤、部分可見肺間質(zhì)水腫(圖1)。與C組比較,R組和K組小鼠肺組織病理損傷評分顯著升高(P<0.05);與R組比較,K組小鼠肺病理損傷評分明顯下降(P<0.05)。

*表示與C組比較,P<0.05;#表示與R組比較,P<0.05。

2.3 氯胺酮對乳腺癌荷瘤小鼠放療后肺纖維化的影響

與C組比較,R組和K組小鼠肺纖維化比例顯著升高(P<0.05);與R組比較,K組小鼠肺纖維化比例明顯下降(P<0.05),見圖2。

*表示與C組比較,P<0.05;#表示與R組比較,P<0.05。

2.4 氯胺酮對乳腺癌荷瘤小鼠放療后肺組織炎性因子含量的影響

與C組比較,R組和K組小鼠肺組織中IL-6、TNF-α含量顯著升高(P<0.05);與R組比較,K組小鼠肺組織中IL-6、TNF-α含量顯著下降(P<0.05),見表2。

表2 各組小鼠肺組織肺組織炎性因子IL-6、TNF-α含量

3 討論

盡管隨著放射治療技術(shù)的發(fā)展,肺損傷已能夠最大限度地減少,但放射性肺損傷并發(fā)癥仍不可避免,嚴重的放射性肺損傷甚至危及生命。如何盡可能降低放療對正常組織的損傷,尤其是對心肺系統(tǒng)的損傷,一直是放療領(lǐng)域的研究重點[7]。

肺在接受放療數(shù)分鐘后,部分受輻照的肺泡上皮細胞和血管內(nèi)皮細胞即發(fā)生損傷或凋亡,誘導(dǎo)單核細胞,淋巴吞噬細胞和粒細胞的趨化,分泌大量的炎性細胞因子、趨化因子和生長因子,例如TNF-α和IL-6等,炎癥因子增加會使更多炎癥細胞聚集[8],導(dǎo)致早期放射性肺炎(radiation pneumonitis,RP)的發(fā)生,當(dāng)肺泡上皮細胞和血管內(nèi)皮細胞的損害變?yōu)槁詴r,過多的細胞外基質(zhì)沉積最終促使肺纖維化發(fā)展為放射性纖維化(radiation fibrosis,RF),放射性肺炎和放射性纖維化是放射性肺損傷的常見病理變化[9]。

本研究發(fā)中,乳腺癌荷瘤小鼠接受5天的放療,2周后的肺組織病理也呈現(xiàn)出肺泡上皮細胞水腫、部分壞死,在肺泡腔中可見積聚大量的炎性滲出物和炎性細胞、成纖維細胞,并可見明顯的肺纖維化改變。而且,射線照射組(R組)小鼠肺組織中TNF-α和IL-6蛋白的含量也明顯高于正常小鼠。以上結(jié)果表明,小鼠肺組織被射線照射后,會發(fā)生明顯的放射性肺炎并可進展為肺纖維化,這種放射性病理損傷與肺組織細胞損傷后炎癥細胞堆積引發(fā)的炎癥反應(yīng)明顯相關(guān)。

目前放射性肺損傷的治療依據(jù)主要來自臨床經(jīng)驗,尚無明確規(guī)范和指南推薦,缺乏有效的治療靶點[10-11],放射性肺損傷發(fā)生后如何進行有效的治療仍是臨床上的難題[12]。

抗炎治療被認為是降低急性肺損傷的可靠方法,較多研究已證實氯胺酮具有抗炎作用[13]。氯胺酮的抗炎作用主要體現(xiàn)在直接抑制炎癥細胞釋放炎癥因子TNF-α和IL-6等的釋放、抑制NO合酶生成NO、增加細胞內(nèi)cAMP水平等[14]。研究發(fā)現(xiàn)隨氯胺酮劑量的增加其抗炎作用倍增[15],但有研究報道大劑量氯胺酮具有肝腎損害作用[16],研究認為中等劑量10 mg/kg氯胺酮對急性肺損傷大鼠有強效抗炎作用,且在治療安全性方面更具優(yōu)勢[17],因此本研究選擇氯胺酮預(yù)處理的劑量為10 mg/kg進行腹腔注射,探討其對RILI的作用。

本研究發(fā)現(xiàn),氯胺酮預(yù)處理組(K組)小鼠肺組織中TNF-α和IL-6的含量明顯低于單純放療組(R組),并且氯胺酮預(yù)處理組的肺組織損傷程度和肺纖維化比例明顯比單純放療組(R組)更低,表明氯胺酮預(yù)處理能顯著降低小鼠肺組織射線照射后的炎癥反應(yīng),從而改善放射性肺損傷。

綜上所述,氯胺酮預(yù)處理可通過減輕炎癥反應(yīng)從而改善乳腺癌小鼠放療導(dǎo)致的肺損傷。本研究著重從氯胺酮預(yù)處理減輕炎癥反應(yīng)的角度探討氯胺酮對RILI的影響,氯胺酮小鼠接受射線照射后再給予氯胺酮,是否能改善RILI,值得進一步研究。此外,本研究中氯胺酮采用的是腹腔注射,臨床還報道了氯胺酮霧化吸入能緩解急性肺損傷[18],而且其起效速率、減少全身不良反應(yīng)等方面更具優(yōu)勢,霧化吸入氯胺酮對RILI的作用效果如何,有待進一步研究闡明。