鼻咽原發(fā)腫瘤微環(huán)境中免疫反應(yīng)對鼻咽癌預(yù)后的影響

邵靜，魏鑫鑫，范栩嫚

（南陽市中心醫(yī)院耳鼻喉科，河南 南陽 473000）

鼻咽癌作為常發(fā)于鼻咽腔側(cè)壁或者頂端的惡性腫瘤， 常發(fā)于我國南方地區(qū)， 具有一定的地域性。 鼻咽癌發(fā)病較為隱匿，易發(fā)生轉(zhuǎn)移[1-2]。 腫瘤微環(huán)境一方面為腫瘤的發(fā)生、 發(fā)展等過程提供了條件， 另一方面腫瘤微環(huán)境也是機(jī)體免疫系統(tǒng)與腫瘤進(jìn)行博弈的場所[3]。 腫瘤微環(huán)境免疫反應(yīng)不僅能起到抑癌作用，還能起到促癌的作用，故腫瘤微環(huán)境中的免疫反應(yīng)在腫瘤的發(fā)展進(jìn)程中發(fā)揮著重要作用[4]。T 細(xì)胞是淋巴細(xì)胞中數(shù)量較多、功能較為復(fù)雜的一類細(xì)胞，其中CD4+與CD8+是成熟T 細(xì)胞亞群的主要標(biāo)志[5]。FOXP3 分子是作用于調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞（Treg）進(jìn)行細(xì)胞免疫的重要分子并且其具有特異性高等特點(diǎn)，具有作為分子標(biāo)志物的優(yōu)勢[6]，而TGF-β1 作為腫瘤分泌的炎性細(xì)胞因子，具有調(diào)節(jié)T 細(xì)胞作用，對腫瘤的發(fā)生、發(fā)展具有一定的抑制作用[7]。 目前研究表明原發(fā)腫瘤體積、發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、某些蛋白的表達(dá)（如LINC00161）是影響鼻咽癌預(yù)后的因素[8-9]，但是關(guān)于鼻咽原發(fā)腫瘤微環(huán)境中免疫反應(yīng)對鼻咽癌預(yù)后的影響尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2014 年6 月至2017 年6 月南陽市中心醫(yī)院收治的鼻咽癌患者50 例。 納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）患者組織病理學(xué)檢測證實(shí)為鼻咽癌；（2）符合鼻咽癌診斷標(biāo)準(zhǔn)[10]；（3）術(shù)前未接受過放化療、分子靶向治療等抗腫瘤治療；（4） 臨床病理資料完整；（5）患者及其家屬同意參與本研究，并簽署知情同意書。 排除標(biāo)準(zhǔn)：（1） 患有嚴(yán)重免疫疾病者；（2）伴有其他惡性腫瘤者；（3）患有嚴(yán)重心腎疾病者。 納入患者男性30 例，女性20 例；年齡25～72歲，平均年齡（55.92±4.21）歲；腫瘤TNM 分期Ⅰ～Ⅱ期39 例， Ⅲ～Ⅳ期11 例； 發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移23例，未發(fā)生轉(zhuǎn)移27 例；腫瘤分期T1+T2 30 例，T3+T4 20 例。 本研究經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，所有患者均知情同意。本研究隨訪截止時(shí)間：2020 年6 月30 日。

1.2 免疫組化方法 利用免疫組化雙染色法對分子標(biāo)志物FOXP3、CD4+/CD8+、TGF-β1 進(jìn)行檢測。將制備好的組織切片于56 °C 烘干30～60 min，按照常規(guī)方法進(jìn)行脫蠟及脫水。 利用雙內(nèi)源酶阻消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性。 按照1:10 000 的比例滴加一抗，4 °C 孵育過夜。 清洗3 次， 1：5 000的比例滴加二抗，37 °C 條件下孵育30 min， PBS清洗3 次， 每次10 min， 1:50 的比例滴加DAB 顯色劑顯色， 8 min，蒸餾水沖洗終止顯色反應(yīng)。 蘇木素復(fù)染15～30 min，流水沖洗，于含1%鹽酸的酒精中進(jìn)行分化2 s，利用蒸餾水沖洗，切片再次返藍(lán)。之后利用80%、95%及100%的乙醇對切片梯度脫水， 65 °C 恒溫箱干燥，二甲苯透明處理后，中性樹膠封片。

1.3 觀察指標(biāo) 采用雙盲的方式對免疫組化結(jié)果進(jìn)行判定， 選取對患者病情不知情的3 位病理學(xué)醫(yī)生對結(jié)果進(jìn)行判定。3 位醫(yī)生判定結(jié)果一致納入結(jié)果， 不一致則邀請其他病理學(xué)醫(yī)生進(jìn)行再一次判定。FOXP3 陽性信號定位于淋巴細(xì)胞核中，CD4+/CD8+陽性信號定位于淋巴細(xì)胞胞膜上，TGF-β1定位于淋巴細(xì)胞胞漿中。 首先在×100 低倍鏡下選取腫瘤淋巴細(xì)胞最豐富的區(qū)域， 在×400 高倍視野下隨機(jī)選取3 個(gè)不重復(fù)且具有代表性的視野，統(tǒng)計(jì)每個(gè)視野下陽性細(xì)胞的個(gè)數(shù)， 取其平均值即為高倍鏡視野陽性細(xì)胞百分率[11]。 計(jì)算Cut-off值將分子標(biāo)志物FOXP3、CD4+/CD8+、TGF-β1 分別分為高表達(dá)、低表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有研究數(shù)據(jù)均在SPSS 19.0 軟件上運(yùn)行處理，治療前后計(jì)量資料用（±s）表示，符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)組間比較采用t檢驗(yàn)，不符合正態(tài)分布數(shù)據(jù)比較采用Mann-Whitney秩和檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料用百分?jǐn)?shù) （%） 表示， 組間比較采用χ2與Fisher確切概率法（n<5）檢驗(yàn)。Cut-off值采用最小P值法計(jì)算，患者生存率采用Kaplan-Meier法進(jìn)行估計(jì)，影響預(yù)后的因素采用Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型，檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)設(shè)置為P<0.05。

2 結(jié)果

2.1 FOXP3、CD4+/CD8+、TGF-β1 在鼻咽原發(fā)腫瘤組織中的表達(dá)情況 在鼻咽原發(fā)腫瘤組織中FOXP3 在淋巴細(xì)胞核中表達(dá)，CD4+/CD8+在淋巴細(xì)胞胞膜上表達(dá)， TGF-β1 在淋巴細(xì)胞胞漿中表達(dá)，見圖1。

圖1 FOXP3、CD4+/CD8+、TGF-β1 在鼻咽原發(fā)腫瘤組織中的表達(dá)情況

2.2 單因素Cox生存分析 單因素Cox生存分析發(fā)現(xiàn)， 間質(zhì)與癌巢中FOXP3、CD4+/CD8+、、TGF-β1等免疫細(xì)胞浸潤較多的患者較數(shù)量少的患者發(fā)生轉(zhuǎn)移與死亡的風(fēng)險(xiǎn)較低（P<0.05），見表1。

表1 總生存與無瘤生存單因素Cox 生存分析

2.3 FOXP3、CD4+/CD8+、TGF-β1 數(shù)量對鼻咽癌患者預(yù)后的影響 以患者ROC曲線建立的Cut-off值作為臨界值， 將FOXP3、CD4+/CD8+、TGF-β1 分為高、低表達(dá)組，Cut-off值為3.0，Kaplan-Meier生存曲線和Log-rank統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，F(xiàn)OXP3、CD4+/CD8+、TGF-β1 細(xì)胞與鼻咽癌患者無瘤生存時(shí)間及總體生存時(shí)間呈現(xiàn)正相關(guān)， 表達(dá)量高者患者預(yù)后較好， 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （χ2=7.031，P=0.000，χ2=7.324，P=0.000），見圖2。

圖2 微環(huán)境中免疫反應(yīng)與患者的Kaplan-Meier 累計(jì)生存曲線

2.4 FOXP3、CD4+/CD8+、TGF-β1 與各項(xiàng)臨床參數(shù)之間的相關(guān)性 結(jié)果詳見表2。

表2 FOXP3、CD4+/CD8+、TGF-β1與各項(xiàng)臨床參數(shù)之間的相關(guān)性

3 討論

鼻咽癌是遭受EB 病毒感染后發(fā)生的一種惡性腫瘤， 鼻咽原發(fā)腫瘤組織局部存在大量的淋巴細(xì)胞，并且還存在其他的免疫浸潤[12]。 由于鼻咽癌發(fā)病較為隱匿，早期缺乏相應(yīng)的檢測方法，缺少有效的輔助治療手段， 易導(dǎo)致鼻咽癌患者較早的發(fā)生復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移[13]。 免疫微環(huán)境作為腫瘤的“第七大標(biāo)記性特征”，是腫瘤微環(huán)境有機(jī)整體的重要組成部分[14]。某些免疫細(xì)胞浸潤在腫瘤微環(huán)境中會對整個(gè)腫瘤微環(huán)境的免疫應(yīng)答產(chǎn)生影響， 從而影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展[15]。

CD4+T 細(xì)胞可以通過分泌不同的細(xì)胞因子，進(jìn)而對免疫系統(tǒng)進(jìn)行調(diào)節(jié)， 而CD8+T 細(xì)胞浸潤則對患者預(yù)后具有積極作用， 能夠通過釋放穿孔素等因子來殺死腫瘤細(xì)胞[16-17]。FOXP3 是一種編碼位于X 染色體上的， 該分子是調(diào)節(jié)Treg 免疫抑制功能的主要分子， 是一種具有特異性的較為可靠的分子標(biāo)志物[18]。 TGF-β1 作為腫瘤分泌的炎性細(xì)胞因子，其能夠誘導(dǎo)CD4+Treg 細(xì)胞的擴(kuò)增，同時(shí)其還能將非調(diào)節(jié)性CD4+T 細(xì)胞轉(zhuǎn)化為CD4+Treg，在一定程度上起到抗腫瘤的作用[19]。本研究結(jié)果表明，間質(zhì)與癌巢中FOXP3、CD4+/CD8+、TGF-β1 等免疫細(xì)胞浸潤較多的患者較數(shù)量少的患者發(fā)生轉(zhuǎn)移與死亡的風(fēng)險(xiǎn)較低且患者預(yù)后較好， 提示FOXP3、CD4+/CD8+及TGF-β1 在鼻咽癌患者免疫反應(yīng)中起著抗腫瘤的作用，并且能夠改善患者預(yù)后，減少復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移等風(fēng)險(xiǎn)的產(chǎn)生。 Treg 作為腫瘤免疫逃逸的重要機(jī)制之一， 其能夠通過抑制效應(yīng)細(xì)胞的免疫反應(yīng)來抑制機(jī)體的抗腫瘤免疫應(yīng)答[20]。Treg 細(xì)胞在鼻咽原發(fā)腫瘤微環(huán)境中表達(dá)量明顯升高， 陽性細(xì)胞中FOXP3、CD4+/CD8+數(shù)量明顯上升， 在微環(huán)境中被誘導(dǎo)分化后，發(fā)揮抗腫瘤作用[21]。有研究表明，在胰腺癌等腫瘤細(xì)胞中， 大量的Treg 能夠在胰腺導(dǎo)管組織中大量聚集，被腫瘤微環(huán)境招募，進(jìn)而發(fā)揮抗腫瘤作用， 影響患者預(yù)后[22]。 TGF-β1 是由Treg 細(xì)胞分泌的免疫抑制因子， 其能夠與白細(xì)胞介素等細(xì)胞因子共同發(fā)揮作用阻礙樹突狀細(xì)胞的分化以及抗原的提呈等作用， 影響細(xì)胞免疫在抗腫瘤過程中的作用，影響T 細(xì)胞亞群的分化，在免疫反應(yīng)過程中發(fā)揮作用，影響患者的預(yù)后[23]。 結(jié)腸癌研究中發(fā)現(xiàn)TGF-β1 能夠起到免疫抑制的作用[24]。 本研究結(jié)果表明，F(xiàn)OXP3、CD4+/CD8+、TGFβ1 表達(dá)與患者TNM 分期、發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及腫瘤分期相關(guān)。 鼻咽原發(fā)腫瘤惡化程度越高，其轉(zhuǎn)移趨勢逐漸變強(qiáng)， 鼻咽原發(fā)腫瘤微環(huán)境中免疫反應(yīng)FOXP3、CD4+/CD8+、TGF-β1 等可以通過調(diào)控淋巴管中的調(diào)控因子的表達(dá)，抑制淋巴管的生成，阻止鼻咽癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，發(fā)揮抗腫瘤的免疫反應(yīng)，是影響預(yù)后的良好指標(biāo)[20]。

綜上所述， 鼻咽原發(fā)腫瘤微環(huán)境中免疫反應(yīng)能夠促進(jìn)機(jī)體的免疫應(yīng)答，抑制腫瘤的發(fā)生、發(fā)展等過程，影響患者的預(yù)后。