系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者血清C5a、HMGB1、sCD163水平變化及其臨床意義

王磊，王元元，趙遠

（洛陽市第一人民醫(yī)院檢驗科，河南 洛陽 471000）

系統(tǒng)性紅斑狼瘡 （Systemic lupus erythematosus，SLE）是一種以累及多系統(tǒng)、多臟器的全身結(jié)締組織炎癥反應為表現(xiàn)的自身免疫性疾病。 一般認為與遺傳、環(huán)境、免疫和內(nèi)分泌異常等因素有關(guān)[1]。目前SLE 尚未治愈方法，隨著病情發(fā)展，SLE 患者出現(xiàn)繼發(fā)感染的比例也隨之增加。 極大影響SLE患者的生命質(zhì)量[2]。 血清過敏毒素由一個活性片段C5a 組成，其可在補體激活過程中產(chǎn)生并對炎癥介質(zhì)作出反應。 補體C5a 表達升高表示其可能參與到SLE 神經(jīng)系統(tǒng)損害的過程而介導炎性反應。HMGB1 屬于有致炎作用的核蛋白。 sCD163 屬于CD163 的脫落形式，在炎癥反應刺激下，外周血中sCD163 水平可明顯升高。既往研究表明，當補體活化過程中出現(xiàn)炎癥反應后，C5a 便趨化炎癥細胞活化、聚集，引起血管擴張、支氣管痙攣等炎癥反應，阻擋線粒體代謝引導糖尿病、 腎病、 腎損傷[3]。HMGB1 在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中可介導中樞的炎性反應， 且可能成為自身免疫治療的靶向分子[4]。sCD163 可能作為炎癥介質(zhì)參與SLE 的免疫病理機制[5]。 因此，本研究探究了系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者血清C5a、HMGB1、sCD163 水平變化及其臨床意義，旨在指導臨床對診斷、評估SLE 活動度及疾病嚴重程度。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2020 年1 月至2021 年1 月在本院確診的71 例SLE 患者設(shè)置為SLE 組，男11 例，女60 例，年齡18~61 歲，平均（34.58±4.77）歲。 選取2020 年1 月至2021 年1 月在本院接受體檢的健康志愿者35 例設(shè)置為對照組， 男4 例，女31 例，年齡18~55 歲，平均（34.29±4.29） 歲。

納入標準：（1） 本研究所有SLE 患者均符合SLE 診斷標準[6]；（2）年齡＞18 歲，有一定認知能力；（3）經(jīng)醫(yī)院倫理委員會通過，研究對象及家屬了解并知情同意。 排除標準：（1）本研究內(nèi)SLE 患者合并其他類型自身免疫性疾病者；（2）伴有重要器官嚴重疾病者；（3） 在研究時間內(nèi)伴有急慢性感染者；（4）伴有糖尿病、惡性腫瘤者。

選取2020 年1 月至2021 年1 月在本院確診的71 例SLE 患者，根據(jù)SLE 活動性指標評分結(jié)果分組， 選取SLEDAI 評分＜5 分的SLE 患者為無活動組（n=28 例），SLEDIA 評分≥5 分的SLE 患者為活動組（n=43 例），并選取同期在本院接受體檢的健康志愿者為對照組（n=35 例）。無活動組男3 例，女25 例，年齡20~61 歲，平均（33.97±4.92）歲；病程4 個月~7 年，平均（3.17±0.66）年。 活動組男8例，女35 例，年齡18~59 歲，平均（34.98±4.67）歲；病程5 個月~8 年，平均（3.41±0.56）年。 對照組男4例，女31 例，年齡18~55 歲，平均（34.29±4.29）歲。所有研究對象年齡、 性別等一般資料無明顯差異（P＞0.05）；無活動組與活動組患者病程無明顯差異（P＞0.05）。

1.2 檢測方法

1.2.1 主要設(shè)備與試劑盒 設(shè)備： 德國Hettich MIKRO220/220R 離心機、超低溫冰箱（深圳海思安生物技術(shù)有限公司）、ThermoFisher Multiskan GO全波長酶標儀 （450 nm）（北京賽百奧科技有限公司）、37 ℃恒溫箱、蒸餾水或去離子水、高精度加樣槍及槍頭：0.5~10 μ L、2~20 μ L、20~200 μ L、200~1 000 μ L。

試 劑 盒：HMGB1 ELISA 試 劑 盒、sCD163 ELISA 試劑盒、 人補體片斷5a （C5a）ELISA 試劑盒、96 孔 微 孔 酶 標 板，C5a 標 準 品0.3 mL*6 管、HMGB1 標準品400 ng/瓶， 人sCD163 酶標抗體、洗滌緩沖液、終止液、底物工作液、封板膜。

1.2.2 采集樣本與標本處理 分別采集三組研究人員清晨空腹狀態(tài)下外周靜脈血。 將血清、血漿用蒸餾水作1：10 倍稀釋 （取20 μ L， 加標本稀釋液180 μ L，稀釋10 倍）得到標本稀釋液。采用濃縮洗滌液與重蒸水配比呈1：20， 稀釋20 倍得到洗滌液。 配制標準品在使用前加入1 mL 蒸餾水混勻，得到400 ng/mL 的標準品液。

補體C5a： 選擇EDTA 或肝素作為抗凝劑，在標本采集30 min 內(nèi)位于2~8 ℃離心15 min， 取上清液置于－80 ℃或－20 ℃保存。

HMGB1：選擇EDTA 作為抗凝劑，在2~8 ℃保存48 h， 在-20 ℃或-70 ℃保存更長時間。 選取8根管作為標準管。 第一管加入標本稀釋900 μ L，第二至第八管加入標本稀釋500 μ L。 將100 μ L的400 ng/mL 標準溶液加入第一管， 混合均勻，然后用取樣器吸出500 μ L，移至第二管。 重復這樣做多次稀釋，從第七管虹吸出500 μ L 并棄掉。 第八管是空白對照。

sCD163：選擇EDTA 或檸檬酸鈉作為抗凝劑，混合10~20 min 后2 000~3 000 r/min 離心20 min。 收集血清，如在儲存過程中發(fā)生沉淀，應再次離心。

1.2.3 檢測步驟 補體C5a：取出恒溫下板條，在預先包被人C5a 捕獲抗體的包被微孔中，加入標本、不同濃度標準品，用封板膠紙封住反應孔，經(jīng)37 ℃恒溫箱孵育90 min 并徹底洗滌。洗板5 次，空白孔加入HRP 標記的檢測抗體稀釋液和抗體工作液，用新封板膠紙封住反應孔，37 ℃恒溫箱孵育60 min。洗板5 次，在空白孔中加入酶結(jié)合稀釋劑，在其他孔中加入酶結(jié)合工作液。 用新封板膠紙封住反應孔，37 ℃恒溫箱，避光孵育30 min。洗板5 次，采用底物TMB 顯色，避光36 ℃孵箱，避光孵育15 min。加入終止液混勻，采用酶標儀（450 nm）測定吸光度（OD 值），并計算最終標本濃度。

sCD163： 采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫法檢測sCD163 水平。 人sCD163 抗體預涂于微孔板上，再將標準品、樣品依次加入一排七孔中，一孔只加入標準稀釋液，其余孔加入待測樣品。 膠條覆蓋，室溫孵育2 h，每孔加入sCD163 與抗體結(jié)合，采用洗滌液洗板5 次，去除未結(jié)合的物質(zhì)后，將人sCD163 hrABS 添加到每個微孔中，形成抗體-抗原-hrABS復合物，膠條覆蓋，室溫孵育2 h。 采用洗滌液洗板5 次后，再加入底物溶液，室溫避光孵育30 min 使之顯色。 采用酶標儀（450 nm）測定OD 值，并計算最終標本濃度。

HMGB1：采用雙抗體夾心ABC-ELISA 法檢測HMGB1 水平。 每孔加入標準品或待測樣品，充分混合反應板，37 ℃靜置2 h。采用洗滌液洗板5 次，在濾紙上晾干。 在每孔中加入第一份抗體工作液。反應板充分混合，37 ℃靜置1 h。洗滌液洗板5 次。在每孔中加入酶標抗體工作液。 反應板37 ℃放置30 min。洗滌液洗板5 次。每孔加入基材工作液，置于37 ℃黑暗中15 min。 每孔加入終止液后，采用酶標儀（450 nm）測定OD 值，并計算最終標本濃度。

1.3 觀察指標 采用雙抗體夾心ELISA 法測定血清補體C5a、sCD163、HMGB1 水平。 本研究內(nèi)所有研究對象均收集24 h 尿液（二甲苯防腐劑），采用全自動生活分析儀和免疫比濁法測定尿總蛋白濃度并計算24 h 尿蛋白水平。 采用間接免疫熒光法測定抗雙鏈DNA 抗體（抗dsDNA）；采用比濁法測定補體C3、C4 水平。 采用系統(tǒng)性紅斑狼瘡疾病活動度評分表（SLEDAI）評價SLE 患者基本活動度。

1.4 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 18.0 統(tǒng)計學軟件分析數(shù)據(jù)，滿足正態(tài)分布的計量資料采用（±s）表示，兩樣本獨立t檢驗比較組間差異，單因素方差分析比較三組間差異，SNK-q 法比較三組兩兩組間差異；計數(shù)資料用率表示，采用χ2檢驗，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 SLE 組患者與對照組的C5a、sCD163、HMGB1水平比較 SLE 組患者C5a、sCD163、HMGB1 水平明顯高于對照組（P＜0.05），見表1。

表1 兩組研究對象的C5a、sCD163、HMGB1 水平比較（±s）

表1 兩組研究對象的C5a、sCD163、HMGB1 水平比較（±s）

組別對照組（n=35）SLE 組（n=71）t P C5a（ng/mL） sCD163（ng/mL）27.56±9.72 42.90±18.83 4.524 0.000 377.53±40.67 1 016.77±146.35 25.308 0.000 HMGB1（ng/mL）3.20±0.35 3.92±0.62 6.378 0.000

2.2 三組研究對象的C5a、sCD163、HMGB1 水平比較 活動組患者C5a、sCD163、HMGB1 水平明顯高于無活動組、 對照組（P＜0.05）； 且無活動組患者C5a、sCD163、HMGB1 水平明顯高于對照組 （P＜0.05）； 活動組患者SLEDAI 評分明顯高于無活動組患者（P＜0.05）；見表2。

表2 三組研究對象的C5a、sCD163、HMGB1 水平比較（±s）

表2 三組研究對象的C5a、sCD163、HMGB1 水平比較（±s）

注：與對照組比較，*P<0.05；與無活動組比較，#P<0.05。

組別 C5a（ng/mL） sCD163（ng/mL） HMGB1（ng/mL） SLEDAI 評分（分）對照組（n=35）無活動組（n=28）活動組（n=43）F/t P 27.56±9.72 36.15±14.10*50.43±21.72*#18.908 0.000 377.53±40.67 614.38±52.66*1 169.19±87.59*#19.913 0.000 3.20±0.35 3.68±0.71*4.89±0.90*#28.973 0.000 2.72±0.37 11.36±2.87 15.805 0.000

2.3 三組研究對象的補體C3、C4、 抗dsDNA、24 h尿蛋白定量比較 活動組患者C3、C4 水平明顯低于無活動組、對照組（P＜0.05）；活動組患者抗dsDNA、24 h 尿蛋白定量明顯高于無活動組、 對照組（P＜0.05）；見表3。

表3 三組研究對象的補體C3、C4、抗dsDNA、24 h 尿蛋白定量比較（±s）

表3 三組研究對象的補體C3、C4、抗dsDNA、24 h 尿蛋白定量比較（±s）

注：與對照組比較，*P<0.05；與無活動組比較，#P<0.05。

組別 C3（g/L） C4（g/L） 抗dsDNA（IU/mL） 24 h 尿蛋白定量（g/24 h）對照組（n=35）無活動組（n=28）活動組（n=43）FP 1.37±0.48 1.10±0.40*0.82±0.36*#17.149 0.000 1.42±0.60 0.96±0.33*0.70±0.14*#22.452 0.000 243.51±43.39 324.64±62.19*362.55±82.73*#25.446 0.000 0.62±0.11 1.22±0.37*1.43±0.54*#26.391 0.000

2.4 SLE 組患者與對照組的C5a、sCD163、HMGB1水平ROC分析 C5a、sCD163、HMGB1 與三者聯(lián)合檢 測SLE 的AUC分 別 為0.778、0.824、0.782 及0.917（P＜0.05）；見表4 及圖1。

圖1 C5a、sCD163、HMGB1 診斷SLE 的ROC 曲線

表4 C5a、sCD163、HMGB1 診斷SLE 的ROC 特征

2.5 C5a、sCD163、HMGB1 水平與補體C3、C4、抗dsDNA、24 h 尿蛋白定量的相關(guān)性 C5a、sCD163、HMGB1 與補體C3、C4 呈負相關(guān) （P＜0.05）；C5a、sCD163、HMGB1 與抗dsDNA、24 h 尿蛋白定量呈正相關(guān)（P＜0.05）；見表5。

表5 C5a、sCD163、HMGB1 水平與補體C3、C4、抗dsDNA、24 h 尿蛋白定量的相關(guān)性

2.6 C5a、sCD163、HMGB1 水平與SLEDAI 評分的相關(guān)性 C5a、sCD163、HMGB1 水平與SLEDAI 評分均呈正相關(guān)（P＜0.05），見表6。

表6 C5a、sCD163、HMGB1 水平與SLEDAI 評分的相關(guān)性

3 討論

SLE 是一種常發(fā)生在年輕女性的自身免疫性炎癥結(jié)締組織疾病。 患者體內(nèi)產(chǎn)生大量自身抗體增殖、活化。 HMGB1 在細胞外可介導炎癥反應，在類風濕患者的關(guān)節(jié)液及狼瘡性腎炎小鼠模型的腎組織中均發(fā)現(xiàn)HMGB1 異常增高[9]。 如不能及時發(fā)現(xiàn)SLE 的疾病活動，出現(xiàn)多系統(tǒng)損害，將嚴重影響患者的生活質(zhì)量和生存率， 為社會和家庭帶來巨大的負擔。 故本研究觀察并探討了系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者血清C5a、HMGB1、sCD163 水平變化及其臨床意義，旨在為臨床早期診斷、及時監(jiān)測疾病活動度，控制病情提供幫助。

本研究結(jié)果顯示，SLE 組患者C5a、sCD163、HMGB1 水平明顯高于對照組；ROC曲線顯示C5a、sCD163、HMGB1 及 三 者 聯(lián) 合 檢 測SLE 的AUC分別為0.778、0.824、0.782 及0.917。有學者研究報道， 健康對照組患者的血清C5a 水平顯著低于SLE 患者[10]，且有研究發(fā)現(xiàn)，血漿C5a 水平可反映患者病情程度[11]；有研究學者以C5a 為靶點，補體C5a 單克隆抗體可有效治療C5a 介導的炎癥疾病[12]。 經(jīng)治療后的SLE 患者的血清sCD163 明顯降低[13]。 SLE 患者的血清sCD163 明顯多于正常健康組， 且其皮膚、 腎臟中CD163 巨噬細胞也明顯增高；巨噬細胞也可直接參與炎癥反應；這些結(jié)果提示表達異常的巨噬細胞表面標志物水平可能與SLE 的發(fā)病有關(guān)[14]。有研究報道，活動期患者HMGB1導致免疫系統(tǒng)攻擊自身組織。 C5a 是一種包含74個氨基酸的糖蛋白， 具有過敏毒素樣及趨化炎性因子的作用。 研究顯示SLE 生物標志物C5a 參與SLE 發(fā)病過程，趨化炎癥細胞向腎臟遷移，參與炎癥反應[7]。 sCD163 是清道夫受體CD163 的脫落形式， 可溶于血清。 在炎性反應刺激下， 外周血sCD163 水平明顯升高[8]，且能抑制T 淋巴細胞的水平明顯高于健康對照組[15]，與本研究結(jié)果一致；報道內(nèi)仍顯示穩(wěn)定期患者與健康對照組的HMGB1 水平無明顯差異， 與本研究結(jié)果不一致，可能與樣本數(shù)量或采集方法有關(guān)。 但仍提示臨床C5a、sCD163、HMGB1 參與SLE 發(fā)病過程且在診斷SLE 上具有一定價值。

本研究結(jié)果顯示， 活動組患者C3、C4 水平明顯低于無活動組、對照組；活動組患者抗dsDNA、24 h 尿蛋白定量明顯高于無活動組、對照組；C5a、sCD163、HMGB1 與 補 體C3、C4 呈 負 相 關(guān)；C5a、sCD163、HMGB1 水平與抗dsDNA、24 h 尿蛋白定量、SLEDAI 評分呈正相關(guān)。 狼瘡腎炎是SLE 最普遍發(fā)生的并發(fā)癥， 其診斷標準包括蛋白尿持續(xù)大于3＋，提示24 h 尿蛋白定量與腎炎發(fā)生有關(guān)。C3、C4 曾作為實驗室評估SLE 活動的“金標準”，也較好反映SLE 的活動程度。 抗dsDNA 的存在對SLE的診斷價值非常大， 且狼瘡腎炎特征之一為自身存在抗dsDNA。 故抗dsDNA 可作為反應疾病活動度及腎臟受累的指標。 既往研究顯示，SLE 患者血清補體C5a 與SLEDAI 評分呈正相關(guān)[16]； 活動期SLE 患者血清C5a 水平與SLEDAI 評分的相關(guān)性高于C3 與SLEDAI 評分相關(guān)性[17]，結(jié)果提示，與補體C3 和C4 相比，C5a 可作為更敏感的SLE 疾病活動性指標。 HMGB1、C5a 水平與24 h 尿蛋白定量、 抗dsDNA 呈正相關(guān)，HMGB1 水平與補體C4呈負相關(guān)[18-19]，且國內(nèi)外研究結(jié)果均顯示狼瘡腎炎發(fā)生與抗dsDNA 水平有關(guān)[20-21]，提示HMGB1 可能與抗dsDNA 抗體誘導的腎小球免疫復合物結(jié)合，進而在狼瘡腎炎的發(fā)病機制中發(fā)揮作用。 既往研究結(jié)果與本研究結(jié)果一致， 提示HMGB1、C5a 與24 h 尿蛋白定量、抗dsDNA 同樣可反映SLE 腎臟受累情況。 抗dsDNA 抗體≥800 IU/mL 的SLE 患者血清sCD163 水平明顯升高，經(jīng)治療后SLE 患者SLEDAI 評分明顯減少[22]。 同樣提示血清sCD163具有一定評估SLE 嚴重程度的意義。

綜上所述，C5a、sCD163、HMGB1 可作為診斷SLE 的重要指標；且C5a、HMGB1 可較好評估SLE疾病活動度及腎損傷；sCD163 能反映SLE 疾病嚴重程度。 本研究僅初步探討了血清C5a、HMGB1、sCD163 水平在SLE 疾病不同活動度與健康對照組的變化，尚需進一步深入研究。