NF-κB、TGF-β1 與風濕性心臟病心房顫動患者心房纖維化的關(guān)系

陳剛，賀少功，李偉

（河南省平頂山市中醫(yī)院，河南 平頂山 467000）

RHD 是由急性風濕熱（Acute rheumatic fever,ARF）加重或反復發(fā)作導致的心臟瓣膜損傷引起的一種慢性瓣膜病變，ARF 是由遺傳易感個體對甲型鏈球菌引起的感染的自身免疫反應引起的[1-2]。AF 在心血管疾病患者中變得越來越常見， 包括RHD、高血壓、冠心病、先天性心臟病、心肌病和心包疾病等[3]。 AF 可能誘發(fā)惡性心律失常、附壁血栓的發(fā)生，出現(xiàn)主要不良心血管病變，將嚴重影響人體健康[4]。有研究表明，心房結(jié)構(gòu)重構(gòu)發(fā)生在AF 的發(fā)作和發(fā)展過程中， 將導致左心房擴張和左心室射血分數(shù)（LVEF）下降[5-6]。然而，預防或改善心肌纖維化可能會顯著降低AF 患者的左心房擴張并改善心功能[7]。 因此，抑制心房纖維化可能是預防AF發(fā)展的關(guān)鍵。 心肌纖維化是心臟病病變的一個重要組成特征， 其特征是細胞外基質(zhì)的過度表達和原纖維膠原的積累[8]。心肌中有五種膠原（即Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ型），其中Ⅰ型和Ⅲ型最常見[9-10]，主要導致心臟疾病進展中的心肌纖維化[11]。NF-κB 是一種轉(zhuǎn)錄因子，控制與免疫和炎癥反應、細胞生長和黏附有關(guān)的基因轉(zhuǎn)錄， 在大多數(shù)細胞中普遍表達[12]。TGF-β1 是迄今發(fā)現(xiàn)的最有效的促纖維化細胞因子， 也是導致心臟成纖維細胞活化和纖維化的關(guān)鍵介質(zhì)，屬于TGF-β 超家族的一個亞家族，能夠調(diào)節(jié)增殖、生長抑制、細胞遷移和侵襲、肌成纖維細胞轉(zhuǎn)化和細胞外基質(zhì)重塑[13]。本研究檢測并比較了兩組患者的NF-κB、TGF-β1 水平的變化， 分析RHD 伴發(fā)AF 患者的心房纖維化與NF-κB、TGFβ1 之間的關(guān)系，現(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 通過回顧分析2019 年1 月至2020年12 月于我院行心臟瓣膜置換術(shù)的RHD 患者100 例。 排除標準：（1） 冠狀動脈粥樣硬化性心臟病、慢性肺源性心臟病、感染性心內(nèi)膜炎等心臟病變患者；（2）甲狀腺功能亢進患者；（3）嚴重肝、腎或肺功能障礙或惡性腫瘤患者；（4）服用可以減輕心室重構(gòu)的藥物的患者， 包括血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑、 血管緊張素受體阻滯劑、β 受體阻滯劑和螺內(nèi)酯等。 其中AF 者62 例為AF 組，SR 者38 例為SR 組。 收集入組患者的一般臨床資料，如年齡、性別、左心房內(nèi)徑（LAD）、LVEF、心功能分級等。其中，SR 組患者最大年齡80 歲， 最小年齡63 歲，平均年齡（68.73±5.28）歲。

1.2 研究方法及觀察指標

1.2.1 采集標本 所有患者都進行了心臟瓣膜置換手術(shù)，在此期間從每個患者中收集約200 mg 右心房組織。每個樣品被分成兩部分。一部分迅速放入液氮容器中，然后放入-80 ℃冰凍保存；另一部分用鹽水溶液洗滌，隨后在室溫下浸泡在4%多聚甲醛溶液中用于病理分析。

1.2.2 HE 染色檢測心房肌細胞的形態(tài)學變化 右心房組織在室溫下固定在4%多聚甲醛溶液中至少24 h，并包埋在石蠟中。 將厚度約4 μm 的切片放在干凈的帶正電荷的顯微鏡載玻片上。 干燥后，將載玻片在60 ℃環(huán)境中加熱。在脫蠟和再水合后，洗滌載玻片，用蘇木精染色7 min，用0.3%酸性醇區(qū)分，在斯科特的自來水替代物中漂洗，用蘇木紅染色2 min，然后脫水、清除并固定。 所有上述實驗都在室溫下進行。 光學顯微鏡被用來觀察載玻片。

1.2.3 Masson 染色測定心房肌間質(zhì)和血管周圍的膠原沉積 在脫蠟和再水合后，載玻片被洗滌并在56 ℃的布恩溶液中重新固定1 h， 以提高染色質(zhì)量。 然后用韋格特的鐵蘇木精染色載玻片5 min，在酸性品紅溶液中染色8 min，然后在磷鉬酸溶液中染色5 min。 載玻片隨后用苯胺藍溶液染色，在1%乙酸中分化，快速脫水，在二甲苯中清除，并使用樹脂固定介質(zhì)固定。 Masson 染色的所有步驟都在室溫下進行。 藍色染色顯示膠原蛋白的存在，紅色染色顯示肌肉和細胞質(zhì)的存在。 使用光學顯微鏡拍攝高倍光學顯微照片。 使用image-Pro Plus 6.0（Media Cybernetics, Inc. Rockville, MD, USA）測定膠原蛋白體積分數(shù)（CVF）。

1.2.4 WB 測定心房肌中NF-κB 磷酸化水平 使用放射免疫沉淀分析裂解緩沖液從-80 ℃冰凍保存的右心房組織中提取總蛋白，BCA 蛋白檢測試劑盒用于測定蛋白濃度。 使用10% SDS-PAGE 加載和分離變性蛋白，然后轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。在室溫下，用5%非脂肪乳封閉60 min 后，將膜與初級抗體在4 ℃孵育過夜。 第二天，將膜與辣根過氧化物酶偶聯(lián)的山羊抗兔孵育， 作為第二抗體在室溫下放置2 h。ChemiDoc 觸摸成像系統(tǒng)用于檢測蛋白質(zhì)信號，并使用Bandscan 4.3 進行分析。

1.2.5 RT-qPCR 測定心房肌中TGF-β1 水平 使用TRIzol 試劑從-80 ℃冰凍保存的右心房組織中分離總RNA。 定量聚合酶鏈反應在Illumina-Eco機器上進行， 根據(jù)β 肌動蛋白基因表達對結(jié)果進行標準化。 反應條件為50 ℃2 min，95 ℃10 min，95 ℃30 s，60 ℃30 s。用1 g 總核糖核酸進行逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應實驗，然后進行40 個循環(huán)的聚合酶鏈反應擴增。 通過分析Cq值和標準曲線，使用熒光信號的變化來量化表達水平；使用RUO ViiA 7 軟件對起始模板進行定量分析。

1.3 統(tǒng)計學方法 將所采集數(shù)據(jù)輸入Excel 2013表建立量表數(shù)據(jù)庫。 將所有資料導入計算機，采用SPSS 20.0 軟件進行統(tǒng)計分析。 計數(shù)資料以頻數(shù)表和百分率表示，采用χ2檢驗；計量資料以（±s）表示，采用t檢驗；用Pearson相關(guān)進行相關(guān)性分析。以α=0.05 為統(tǒng)計學檢驗標準，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者的一般資料比較情況 AF 組患者的LAD 明顯大于SR 組患者，兩者之間比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。 見表1。

表1 兩組患者的一般資料比較

2.2 兩組患者的心肌組織比較情況 HE 染色顯示，AF 組心肌細胞大于SR 組。 AF 組表現(xiàn)出間質(zhì)膠原纖維排列紊亂。 此外，AF 組的CVF 值明顯高于SR 組，具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。 見圖1。

圖1 RHD 伴發(fā)AF 患者擴張的心房肌細胞和積聚的膠原

2.3 兩組患者的NF-κB、TGF-β1 水平比較情況與SR 組相比較，AF 組患者的NF-κB、TGF-β1 水平均明顯升高，兩者之間比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。 見表2。

表2 兩組患者的NF-κB、TGF-β1 比較

2.4 RHD 伴發(fā)AF 患者心房纖維化和NF-κB、TGF-β1 相關(guān)性情況 RHD 伴發(fā)AF 患者右心房CVF 與NF-κB、TGF-β1 水平呈正相關(guān)關(guān)系， 差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。 見表3。

表3 RHD 伴發(fā)AF 患者心房纖維化和NF-κB、TGF-β1 相關(guān)性

3 討論

ARF 是遺傳易感個體對GAS 咽部感染的自身免疫反應的結(jié)果， 鏈球菌抗原由抗原呈遞細胞如巨噬細胞和樹突狀細胞識別、加工和呈遞，導致B細胞產(chǎn)生抗體，B 細胞與人成分交叉反應， 導致多個宿主部位的損傷[14]。心臟瓣膜的長期損傷是ARF更嚴重的并發(fā)癥。

有研究報道RHD 的免疫反應可能與膠原自身免疫有關(guān)，宿主內(nèi)皮產(chǎn)生抗基底膜膠原（Ⅳ型）自身抗體是病理過程的觸發(fā)步驟。 在鏈球菌感染中，M 蛋白與Ⅳ型膠原的CB3 區(qū)結(jié)合，導致形成一種復合物，促進膠原結(jié)構(gòu)的構(gòu)象變化，從而啟動抗膠原反應[15]。 因此，一種普遍存在的蛋白質(zhì)可以成為自身抗原， 導致膠原沉積和膠原降解之間的不平衡，最終導致RHD 的纖維化。 與非風濕性二尖瓣對照相比， 風濕性心臟病患者的二尖瓣顯示出較高的Ⅰ型和Ⅲ型膠原沉積， 這是纖維化的證據(jù)[16]。

為探討AF 對心房結(jié)構(gòu)重構(gòu)的影響， 采用HE染色和Masson 染色評估心肌纖維化程度。 HE 染色顯示，AF 組心肌細胞大于SR 組。 通過測量心肌組織間質(zhì)中膠原的總量和測定CVF 來評價心肌纖維化。 與SR 組相比，AF 組表現(xiàn)出間質(zhì)膠原纖維排列紊亂。 此外，AF 組的CVF 值明顯高于SR 組，有統(tǒng)計學意義 （P＜0.05）。 這些結(jié)果表明，RHD 伴發(fā)AF 患者具有擴張的心房肌細胞， 并在心房肌中顯示廣泛的膠原沉積。 心房纖維化是心房結(jié)構(gòu)重塑發(fā)生的主要過程，在AF 的發(fā)生發(fā)展過程中起著關(guān)鍵作用， 減輕心房纖維化以抑制心房結(jié)構(gòu)重塑對預防AF 的發(fā)生和發(fā)展至關(guān)重要[17]。 此外，心房纖維化是由心臟成纖維細胞和上皮細胞介導的，內(nèi)皮細胞可以轉(zhuǎn)化為成纖維細胞， 這在心臟肥大和心臟纖維化中發(fā)揮重要作用[18]。 因此，抑制心肌間質(zhì)轉(zhuǎn)化以減輕心肌纖維化可能是預防AF 發(fā)展的重要途徑。

本研究相關(guān)性分析結(jié)果顯示，RHD 伴發(fā)AF患者的NF-κB、TGF-β1 水平與右心房CVF 呈正相關(guān)，考慮是因為TGF-β1 能夠通過上皮細胞和間充質(zhì)細胞在培養(yǎng)中促進纖連蛋白和膠原蛋白的產(chǎn)生，并通過相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄激活NF-κB，是心房纖維化的潛在關(guān)鍵驅(qū)動因素[19-20]。

綜上所述，RHD 伴發(fā)AF 患者心肌組織中NF-κB 激活可能促進分泌TGF-β1，引起細胞外基質(zhì)沉積，導致心房纖維化。