晚期非小細(xì)胞肺癌組織中AURKA 表達(dá)與含鉑化療療效及預(yù)后的關(guān)系

馬改玲，吳博通，劉孟孟，張俊濤

（1.登封市人民醫(yī)院病理科，河南 登封 452470；2.登封市人民醫(yī)院腫瘤科，河南 登封 452470）

肺癌是一種高發(fā)病率和高死亡率的惡性腫瘤，據(jù)報(bào)道是中國(guó)死亡率最高的癌癥，其中非小細(xì)胞肺癌（Non-small-cell lung cancer，NSCLC）幾乎占所有肺癌病例的85%， 大部分患者在確診時(shí)已處于晚期[1]。 化療是這些患者的主要治療選擇之一，盡管廣泛使用化學(xué)療法， 例如鉑類藥物， 晚期NSCLC 患者的預(yù)后仍然很差，5 年生存率始終低于15%[2-3]。 AURKA 是一種細(xì)胞周期調(diào)節(jié)激酶，參與中心體成熟、有絲分裂進(jìn)入、雙極紡錘體組裝和染色體分離，在許多癌癥類型中經(jīng)常有報(bào)道AURKA表達(dá)升高[4]。 AURKA 單獨(dú)或與其他因素聯(lián)合可引發(fā)細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化并促進(jìn)癌細(xì)胞的惡性表型[5]。 AURKA 通過調(diào)節(jié)多種致癌和抑癌蛋白顯示致癌活性：AURKA 在Ser215 和Ser315 處對(duì)磷蛋白p53腫瘤抑制蛋白（Tumor protein p53，TP53）的磷酸化分別通過鼠雙微體2 基因（Murine doubleminute 2，MDM2）介導(dǎo)的泛素化和TP53DNA 結(jié)合/反式激活活性的消除導(dǎo)致TP53 降解[6]。反過來，TP53 下調(diào)會(huì)增加ARUKA 在轉(zhuǎn)錄和翻譯后水平的表達(dá)[7]。 AURKA 和TP53 之間的負(fù)反饋調(diào)節(jié)極大地促進(jìn)了致癌作用和進(jìn)展。較低的AURKA 表達(dá)會(huì)提高對(duì)化療（如紫杉醇或多西他賽）的敏感性，并降低對(duì)鉑的耐藥性[8]。 相比之下，AURKA 的過度表達(dá)可以降低順鉑敏感性和對(duì)抗微管藥物的抵抗力[9]。 目前，尚未見關(guān)于AURKA 表達(dá)對(duì)晚期NSCLC 患者鉑類化療療效及預(yù)后作用的研究報(bào)道。 本研究擬評(píng)估AURKA 表達(dá)與晚期NSCLC 患者鉑類化療反應(yīng)和預(yù)后的關(guān)系，為晚期NSCLC 的治療提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 將2016 年1 月至2018 年6 月登封市人民醫(yī)院90 名經(jīng)組織學(xué)證實(shí)為晚期NSCLC的患者納入研究。 所有活檢樣本均通過支氣管鏡或細(xì)針抽吸活檢收集。 所有患者均在本院腫瘤科接受了鉑類聯(lián)合化療。 5 年內(nèi)有其他惡性腫瘤病史、懷孕或哺乳期、嚴(yán)重感染或器官功能受損者除外。獲取組織后作石蠟切片以及IHC 染色切片。所有患者在納入研究前均簽署知情同意書， 該研究獲得本院醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

所有患者均接受鉑類化療作為一線化療，如吉西他濱、 長(zhǎng)春瑞濱或紫杉醇。 在第1 天和第8天， 靜脈給藥劑量為75 mg/m2順鉑、1 000 mg/m2卡鉑和吉西他濱和25 mg/m2長(zhǎng)春瑞濱， 最多4 個(gè)周期， 暫停治療直至疾病進(jìn)展或出現(xiàn)不可接受的毒性。 如果患者出現(xiàn)三級(jí)非血液學(xué)毒性、四級(jí)血液學(xué)毒性、發(fā)熱性中性粒細(xì)胞減少或感染，則下一個(gè)周期的化療藥物劑量減少25%。 化療結(jié)束后，每月對(duì)患者進(jìn)行電話隨訪，直至死亡或研究結(jié)束。 通過使用實(shí)體瘤反應(yīng)評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)（RECIST）對(duì)化療反應(yīng)進(jìn)行分類：分為完全緩解（Complete remission，CR）、部分緩解（Partial remission，PR）、疾病穩(wěn)定（Stable disease，SD） 以及疾病進(jìn)展 （Disease progression，PD），有效＝CR＋PR，無(wú)效＝SD＋PD。

1.2 免疫組化法測(cè)定AURKA 表達(dá)及判定標(biāo)準(zhǔn) 本研究使用從手術(shù)切除中獲得的福爾馬林固定石蠟包埋(FFPE)組織的4 μm 厚切片。 將切片固定在載玻片上， 然后與抗AURKA 的抗兔單克隆抗體（Abcam，Cambridge，UK） 一起孵育， 使用Bench Mark XT（Ventana Automated Systems，Inc，Tucson，AZ，USA）進(jìn)行免疫組織化學(xué)分析。使用Ventana 的CC1 修復(fù)溶液對(duì)每張載玻片進(jìn)行熱處理30 min，然后與AURKA 抗體一起孵育30 分鐘。 該自動(dòng)化系統(tǒng)使用以3,3'-二氨基聯(lián)苯胺(DAB)作為色原的Ultra VIE WDAB 檢測(cè)試劑盒 （Ventana 自動(dòng)化系統(tǒng)）。 評(píng)分是包括陽(yáng)性染色腫瘤細(xì)胞的比例和染色強(qiáng)度。癌細(xì)胞百分比評(píng)分如下：陽(yáng)性癌細(xì)胞<10%的切片評(píng)分為0； 陽(yáng)性癌細(xì)胞10%~50% 的評(píng)分為1； 陽(yáng)性癌細(xì)胞50%~75% 的評(píng)分為2；且＞陽(yáng)性癌細(xì)胞75%的評(píng)分為3。 同時(shí)，根據(jù)染色強(qiáng)度將組織分為四個(gè)等級(jí)：0 表示無(wú)染色； 1 表示染色較弱（淺黃色），2 表示中度染色 （黃褐色），3 表示強(qiáng)染色（棕色）。 染色指數(shù)（0~9）計(jì)算為陽(yáng)性癌細(xì)胞比例乘以染色強(qiáng)度評(píng)分的乘積。 最佳截?cái)嘀刀x如下：染色評(píng)分> 6 被認(rèn)為具有陽(yáng)性AURKA 表達(dá)，染色評(píng)分為≤6 表明陰性AURKA 表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析 使用統(tǒng)計(jì)軟件包SPSS 21.0（IBM）進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，分類變量以百分比(%)描述，并使用χ2檢驗(yàn)分析，采用多因素Logistics回歸分析探討晚期非小細(xì)胞肺癌患者化療療效相關(guān)因素， 多因素Cox回歸分析晚期非小細(xì)胞肺癌患者總體預(yù)后相關(guān)因素，P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 晚期非小細(xì)胞肺癌組與癌旁組AURKA 蛋白表達(dá)比較 AURKA 呈黃色或深棕黃色顆粒， 定于細(xì)胞核，晚期非小細(xì)胞肺癌組AURKA 蛋白表達(dá)陽(yáng)性率高于癌旁組（P<0.05）。 見表1。

圖1 晚期非小細(xì)胞肺癌組與癌旁組AURKA 蛋白表達(dá)（HE 染色，400x）

表1 晚期非小細(xì)胞肺癌組與癌旁組AURKA 蛋白表達(dá)比較［n（%）］

2.2 晚期NSCLC 患者臨床病理特征與化療療效的關(guān)系 晚期NSCLC 患者化療療效與年齡、 性別不相關(guān)（P>0.05）；與腫瘤最大徑、TNM 分期、浸潤(rùn)深度、AURKA 表達(dá)、病理級(jí)別、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)相關(guān)性明顯， 且腫瘤最大徑大于或等于5 cm、TNM分期高、浸潤(rùn)深度深、AURKA 表達(dá)陽(yáng)性、病理級(jí)別低、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、有復(fù)發(fā)，晚期NSCLC 患者化療無(wú)效率高（P<0.05）。 見表2。

表2 晚期NSCLC 患者臨床病理特征與化療療效的關(guān)系［n（%）］

2.3 晚期NSCLC 患者化療療效影響因素多因素Logistics回歸分析 以化療療效為因變量（0=有效，1=無(wú)效），表2 單因素分析有意見的變量進(jìn)行多因素Logistics回歸分析， 結(jié)果顯示，TNM 分期Ⅳ期、病理級(jí)別低、AURKA 表達(dá)陽(yáng)性是影響晚期NSCLC患者化療療效的危險(xiǎn)因素（P<0.05）。 見表3。

表3 晚期NSCLC 患者化療療效多因素Logistics 回歸分析

2.4 晚期NSCLC 患者預(yù)后生存情況 本研究90例晚期NSCLC 患者中， 自出院后至隨訪結(jié)束存活4～60 個(gè)月，2 年生存率為58.9%（58/102）； 其中AURKA 陽(yáng)性和陰性患者2 年總生存率分別為40/72（55.6%）和18/18（100.0%）；AURKA 陽(yáng)性的晚期NSCLC 患者2 年生存率相較于陰性患者顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.5 影響晚期NSCLC 患者預(yù)后單因素分析 經(jīng)單因素分析得出： 腫瘤最大徑≥5 cm、TNM 分期Ⅳ、浸潤(rùn)深度≥6 cm、 有淋巴血管間隙浸潤(rùn)、 化療無(wú)效、病理級(jí)別低、有復(fù)發(fā)、AURKA 陽(yáng)性的晚期非小細(xì)胞肺癌患者2 年生存率均顯著縮短（P＜0.05），見表4。

表4 影響晚期NSCLC 患者預(yù)后的單因素分析

表5 晚期NSCLC 患者總體預(yù)后影響因素的多因素Cox 回歸分析

2.6 晚期NSCLC 患者總體預(yù)后影響因素的多因素Cox回歸分析 以晚期NSCLC 患者總體預(yù)后為因變量（1=死亡，0=生存），以表4 單因素分析有意義變量為自變量進(jìn)行多因素Cox回歸分析， 結(jié)果顯示：化療無(wú)效、TNM 分期Ⅳ期、AURKA 表達(dá)陽(yáng)性是影響晚期非小細(xì)胞肺癌患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（P<0.05）。

3 討論

多項(xiàng)臨床研究評(píng)估了AURKA 在18 種腫瘤組織和匹配的正常組織中的表達(dá)，結(jié)果表明，與正常組織相比，AURKA 在大多數(shù)測(cè)試的癌癥類型中表達(dá)上調(diào)[10]。 臨床研究表明，較高的AURKA 與大多數(shù)癌癥類型（結(jié)腸癌、肝癌、前列腺癌）的預(yù)后不良相關(guān)。一項(xiàng)研究評(píng)估了結(jié)直腸癌患者中AURKA 的預(yù)后作用，盡管缺乏統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但其結(jié)果仍然提示AURKA 可能對(duì)生存有積極影響，并強(qiáng)調(diào)有必要研究AURKA 對(duì)治療反應(yīng)的影響，該研究的進(jìn)一步體外細(xì)胞試驗(yàn)研究表明[11]，轉(zhuǎn)錄因子的甲基化不足和上調(diào)可能至少部分導(dǎo)致結(jié)腸癌中AURKA 的表達(dá)升高。 一些研究表明，基因擴(kuò)增是AURKA 升高的另一個(gè)原因[12]。通過反式激活DNA 損傷反應(yīng)(DDR)基因來維持基因組穩(wěn)定性是AURKA 依賴性腫瘤促進(jìn)的關(guān)鍵介質(zhì)； 因此，AURKA 過表達(dá)會(huì)導(dǎo)致各種DDR 機(jī)制的喪失，從而促進(jìn)基因組不穩(wěn)定性和癌癥的發(fā)展[13]。 本研究結(jié)果顯示：晚期非小細(xì)胞肺癌組AURKA 蛋白表達(dá)陽(yáng)性率高于癌旁組，AURKA 陽(yáng)性的晚期NSCLC 患者2 年生存率均顯著縮短，AURKA 表達(dá)陽(yáng)性是影響晚期NSCLC 患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。 這說明，AURKA 在晚期NSCLC 過表達(dá)，AURKA 表達(dá)陽(yáng)性是影響晚期NSCLC 患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。 近期研究發(fā)現(xiàn)，鉑誘導(dǎo)的DNA 損傷可觸發(fā)DNA 損傷修復(fù)（DDR）， 這是對(duì)鉑產(chǎn)生化學(xué)抗性的主要因素，而AURKA 能促發(fā)DDR， 此外癌癥中上調(diào)的AURKA可能促進(jìn)癌癥進(jìn)展，這可能是AURKA 陽(yáng)性的晚期NSCLC 患者2 年生存率均顯著縮短的原因。

DNA 是許多抗癌藥物的分子靶點(diǎn)。 修復(fù)DNA的異常能力與化療耐藥密切相關(guān)， 這可能極大地影響化療的有效性。 為了提高化療的療效并降低其毒性， 根據(jù)化療相關(guān)基因的表達(dá)水平或多態(tài)性來定制化療，AURKA 是一個(gè)位于染色體片段17q12-21 的100kb 區(qū)域，在修復(fù)雙鏈DNA 斷裂和順鉑耐藥介導(dǎo)的DNA 損傷中起著重要作用[14]。 先前的研究報(bào)道，在AURKAmRNA 表達(dá)的最高三分位數(shù)與對(duì)輔助化療的反應(yīng)增加之間發(fā)現(xiàn)了顯著的相關(guān)性[15]。 AURKA 低表達(dá)與對(duì)順鉑和依托泊苷更好的敏感性相關(guān)；此外AURKA 低表達(dá)與抗微管藥物有關(guān)，如紫杉醇、多西他賽和長(zhǎng)春瑞濱[16]。研究報(bào)道，根據(jù)AURKA 表達(dá)的差異，當(dāng)專門使用吉西他濱時(shí)， 可以大大提高其療效。 目前的研究支持AURKA 通過促進(jìn)基因組不穩(wěn)定性參與結(jié)腸癌變，增加的AURKA 為基于DNA 損傷誘導(dǎo)藥物的化療抗性提供依據(jù)[17]。已經(jīng)在不同的癌癥類型中研究了AURKA 對(duì)化學(xué)敏感性的影響。 到目前為止，其結(jié)論一致，AURKA 損害了化學(xué)敏感性[18]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)， 晚期NSCLC 患者化療療效與腫瘤最大徑、TNM 分期、浸潤(rùn)深度、AURKA 表達(dá)、病理級(jí)別、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)相關(guān)性明顯，且腫瘤最大徑≥5 cm、TNM 分期越高、浸潤(rùn)深度越深、AURKA 表達(dá)陽(yáng)性、病理級(jí)別低、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、有復(fù)發(fā)，晚期非小細(xì)胞肺癌化療無(wú)效率越高（P<0.05）。 TNM 分期Ⅳ期、病理級(jí)別低、AURKA 表達(dá)陽(yáng)性是影響NSCLC 患者化療療效的獨(dú)立危險(xiǎn)因素 （P<0.05）。 這提示，AURKA 高表達(dá)的NSCLC 患者在接受鉑類化療時(shí)表現(xiàn)出更差的反應(yīng)和更短的進(jìn)展時(shí)間。 體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明[19]，抑制AURKA 可增強(qiáng)癌細(xì)胞對(duì)紫杉烷和紫杉醇、順鉑、多柔比星和5-氟尿嘧啶(5-Fu 的化學(xué)敏感性；而AURKA 在各種癌癥中抑制鉑化學(xué)敏感性，包括卵巢癌、肝細(xì)胞癌、髓母細(xì)胞瘤、急性髓系白血病以及頭頸癌。 細(xì)胞機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)[20]，在癌細(xì)胞亞群中，AURKA 沉默通過上調(diào)抗凋亡因子使結(jié)直腸癌干細(xì)胞(CR-CSC)對(duì)奧沙利鉑的反應(yīng)敏感增強(qiáng)。本研究未探討AURKA 對(duì)晚期非小細(xì)胞肺癌化療敏感性抑制的機(jī)制，這將在后續(xù)研究中進(jìn)行。

綜上所述，晚期非小細(xì)胞肺癌組織中AURKA表達(dá)水平升高；高水平的AURKA 是晚期非小細(xì)胞肺癌患者含鉑化療不敏感及預(yù)后不良的危險(xiǎn)因素。