SARS-CoV-2 核酸提取前樣本混勻后不同靜置時間對假陰性結(jié)果影響的初步探討

梁麗霞

（肇慶市第一人民醫(yī)院檢驗科，廣東 肇慶 526060）

SARS-CoV-2 核酸RT-PCR 是目前COVID-19 病[1]的確診方法，但影響檢測結(jié)果的因素較多。我們在實驗室核酸檢測工作中發(fā)現(xiàn)， 樣本提取前充分振蕩混勻后靜置時間對治療后期或恢復(fù)期的確診患者的實驗結(jié)果有著很大的影響。 在患者治療后期及恢復(fù)期，病毒量急劇減少，但仍有少量存留于鼻咽內(nèi)部細胞的情況下， 不同的樣本處理方法決定著結(jié)果的可靠性。 實驗結(jié)果報告如下：

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑與儀器3 mL 自帶滅活效果的病毒保存液（廣州邦德盛生物科技有限公司），去RNA 酶EP管（AXYGEN），半自動核酸提取儀（重慶中元匯吉生物技術(shù)有限公司）和配套的核酸提取試劑盒（磁珠法，型號B-200），SARS-CoV-2 核酸檢測試劑盒（熒光PCR 法，中山大學(xué)達安基因股份有限公司），ABI7500 PCR 儀（Applied Biosystems USA）。

1.1.2 樣本來源 樣本來源于本院收治的1 例女性COVID-19 確診患者， 該患者住院時間是2020 年2 月17 日至3 月5 日，入院前鼻塞、流涕、咽痛8天，咳嗽7 天，發(fā)熱3 天，新型冠狀病毒核酸檢測結(jié)果陽性，胸部CT 平掃結(jié)果提示左肺上葉少許炎癥。 在此病人住院治療期間，感染科醫(yī)生為了監(jiān)測治療效果，在病人簽署知情同意書的情況下，每天采集一個鼻咽拭子到我們實驗室進行新型冠狀病毒核酸檢測， 采集后的樣本立即保存在滅活病毒保存管中，4 ℃保存及時送檢。 將此病人入院后治療的前6 d 設(shè)為治療初期，這期間送檢的6 個鼻咽拭子分別編號為1、2、3、4、5、6，設(shè)為A 組。 在出院前一周的治療設(shè)為治療后期， 這期間送檢的6 個鼻咽拭子分別編號為7、8、9、10、11、12，設(shè)為B 組。

1.2 方法

1.2.1 加樣提取操作 實驗人員嚴格按照《國家衛(wèi)生健康委辦公廳關(guān)于印發(fā)新型冠狀病毒實驗室生物安全指南（第二版）的通知》及《新型冠狀病毒感染的肺炎實驗室檢測技術(shù)指南（第四版）》相關(guān)文件進行實驗操作和生物安全防護。

取出含提取試劑96 孔的深孔板平衡至室溫，小心撕開鋁膜， 樣本孔位依次加入15uL 的Proteinase K。

將A 組和B 組的12 個3 mL 的樣本充分混勻后， 每個樣本以每管200 uL 的液量分裝到四個不同的1.5 mL EP 管中。 實驗的步驟如下：

（1）第一管立刻進行提??；

（2）第二管靜置5 min 后進行提?。?/p>

（3）第三管靜置15 min 后進行提??；

（4）第四管靜置30 min 后進行提取。文中將以0 min、5 min、15 min、30 min 表示不同的靜置時間。

1.2.2 核酸擴增 使用PCR 儀，根據(jù)核酸檢測試劑盒說明書設(shè)置反應(yīng)程序，利用一步法反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）技術(shù)，選取SARS-CoV-2 病毒的ORF1ab 和N 基因作為擴增靶區(qū)域， 設(shè)計特異性引物及熒光探針用于SARS-CoV-2 檢測。 試劑盒同時包括了內(nèi)源性內(nèi)標系統(tǒng)，用于對標本采集、核酸提取過程及PCR 擴增過程的監(jiān)控。

1.2.3 PCR 反應(yīng)條件 50 ℃的初始反轉(zhuǎn)錄15 min，緊隨95 ℃變性步驟15 min，隨后進行45 次94 ℃循環(huán)15 s，55 ℃45 s，最后一步40 ℃20 s。

1.2.4 結(jié)果判定 陰性結(jié)果：N 基因和ORF1ab 基因無典型S 型擴增曲線或Ct>40，且Cy5 通道有明顯擴增曲線； 陽性結(jié)果：（N 基因和ORF1ab 基因Ct≤40，且有典型的S 型擴增曲線。 如果N 基因或ORF1ab 基因Ct≤40，） 復(fù)檢后結(jié)果一致可判為陽性。 要求陰性質(zhì)控和陽性質(zhì)控均在控。

1.2.5 統(tǒng)計學(xué)方法 比較擴增后A 組N 基因和ORF1ab 基因Ct，Pearson積矩相關(guān)分析不同標本之間的CT 系數(shù)，graphpad5.0 對圖形進行了說明，MedCalc 軟件繪制Bland-Altman 曲線，并對CT 進行一致性分析，P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。 因B組部分樣本N 基因和ORF1ab 基因結(jié)果出現(xiàn)假陰性結(jié)果，沒有Ct，只能用excel 2016 比較陽性率。本研究采用統(tǒng)計分析軟件spss 19.0。

2 結(jié)果

2.1 治療初期A 組提取核酸前不同靜置時間處理的Ct：見表1。

表1 COVID-19 確診患者治療初期A 組樣本提取核酸前不同靜置時間處理的Ct

2.2 相關(guān)分析 治療初期A 組的6 個樣本0 min與5 min、15 min、30 min 擴增后Ct 的相關(guān)分析，結(jié)果如表2。 N 基因Ct0 min 和5 min 比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），而與15 min、30 min 比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。 ORF1ab 基因Ct0 min 與5 min、15 min 比較有統(tǒng)計學(xué)差異 （P<0.05）， 而與30 min 比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。隨著標本靜置時間不斷延長，相關(guān)系數(shù)就越小，比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。 見圖1。

圖1 治療初期A 組0 min 與其他三種不同靜置時間提取的Ct 相關(guān)性分析（N 基因和ORF1ab）

表2 COVID-19 確診患者治療初期A 組樣本提取核酸前不同時間處理方式的Ct 相關(guān)性分析

2.3 一致性分析 樣本充分混勻即刻加樣提取（0 min）與混勻后靜置5 min、15 min、30 min 提取擴增后Ct 的一致性分析。 縱軸是0 min 與其他三種處理方式的差值，橫軸是平均值。 如圖2 Bland-Altman 曲線所示，N 基因的Ct，0 min 與其余3 種 不同靜置時間進行兩兩比較， 圖中所有的點都在95%LoA 之內(nèi)，認為方法之間結(jié)果具有較好的一致性。（ORF1ab 基因的Ct 都在混勻后靜置30 min 提取有16.7%（1/6）的散點分布在95%CI之外，）樣本充分混勻即刻加樣提取0 min 與靜置30 min 提取兩種方法的一致性較差。

圖2 治療初期A 組混勻即刻加樣提?。? min）與不同靜置時間的相關(guān)性分析圖圖例：橫軸表示混勻即刻加樣提?。? min）的Ct 值，縱軸表示不同靜置時間提取樣本的Ct 值（N 基因和ORF1ab）

2.4 治療后期B 組樣本提取核酸前不同靜置時間處理的Ct：見表3。 圖3、圖4 和圖5 所示，治療后期的同一個樣本N 基因和ORF1ab 基因由于提取前靜置時間不同而出現(xiàn)假陰性的結(jié)果。 在靜置30 min 加樣提取，它的陽性率結(jié)果是最高的。

圖3 治療后期B 組樣本不同處理方式N 和ORF1ab 基因陽性率比較柱狀圖

圖4 治療后期B 組樣本不同處理方式N 基因Ct變化折線圖

表3 COVID-19 確診患者治療后期B 組樣本提取核酸前不同靜置時間處理的Ct

3 討論

病毒保存溶液通常分為非滅活型和滅活型。非滅活型能夠保護病毒的蛋白質(zhì)和核酸， 收集樣品后，必須嚴格遵循低溫條件才能長期保存。 滅活型主要是從核酸提取裂解物中改良的病毒裂解型包含RNase 酶抑制劑的保存溶液， 有助于保護病毒核酸不被降解， 可以在室溫下保存相對較長的時間。 我院曾報道滅活型和非滅活型的樣本，在檢測新型冠狀病毒RNA 上無論是N 基因還是ORF1ab 基因結(jié)果都具有一致性[2]。 然而也有研究表明， 病毒滅活過程對于病毒含量較高的樣本檢出率無顯著影響， 但可能會導(dǎo)致病毒含量較低樣本的檢出率下降，從而產(chǎn)生假陰性結(jié)果[3]。 考慮到SARS-COV-2 潛在致病能力較強， 在實驗室生物安全水平有限的情況下必須進行病毒滅活過程，但應(yīng)盡量準確控制滅活的溫度和時間， 以避免因高溫度或長時間的滅活過程而導(dǎo)致檢出率嚴重下降的情況[4-6]。

COVID-19 患者存在康復(fù)后復(fù)發(fā)和無癥狀感染等現(xiàn)象。 一項關(guān)于回顧性分析3 例COVID-19患者出院后核酸檢測結(jié)果復(fù)陽的研究指出， 患者感染初期的SARS-CoV-2 ORF1ab 和N 基因的核酸檢測結(jié)果呈雙基因強陽性， 二次入院時報告雙基因為弱陽性， 提示了患者復(fù)陽的病毒載量遠低于首次入院時的病毒載量[7]。 本文通過對治療初期A 組與治療后期B 組樣本經(jīng)不同樣本處置方式，發(fā)現(xiàn)COVID-19 患者因不同病毒載量而影響了結(jié)果。 在患者的治療初期，由于其病毒核酸載量比較高， 樣本振蕩后不同靜置時間對結(jié)果無影響。 然而，在治療后期，同一樣本因提取前不同的靜置時間而出現(xiàn)截然不同的結(jié)果， 放置30 min 后提取的結(jié)果陽性率卻是最高的， 這說明了樣本提取前不同的處置方法對假陰性結(jié)果有一定的影響。 實驗前標本保存液總量是3 mL， 實驗前有無振蕩對結(jié)果的影響不大， 結(jié)果與病毒核酸載量以及與在采樣管中的懸浮性有關(guān)。 另一方面，體外診斷試劑的分析敏感性是有極限的[8]，原始標本中病毒數(shù)量低于一定程度， 就很可能在核酸擴增檢測的反應(yīng)體系中沒有病毒核酸，試劑也就無法檢出，試劑因素也是影響實驗結(jié)果的重要因素之一， 尤其是當(dāng)樣本有不同的處理方式時， 試劑因素對實驗結(jié)果的影響就突顯出來了。

有報道稱，COVID-19 患者在癥狀消失后的一段時間內(nèi)仍可檢測出病毒的RNA[9-10]。 馮毅[11]報道了湖北武鋼第二職工醫(yī)院38 例確診病例同步檢測咽拭子核酸檢測和胸部CT， 第1 次核酸檢測陽性病例9 例， 第2 次核酸檢測結(jié)果陽性病例25例，第3 次核酸檢測結(jié)果陽性病例4 例。 LAN 等[12]研究證實，4 例COVID-19 患者在出院5～13d 后出現(xiàn)核酸“復(fù)陽”。COVID-19 患者經(jīng)過治療癥狀消失后，排毒仍繼續(xù)，體內(nèi)仍攜帶較低滴度的病毒，這可能與病程不同階段的核酸載量有關(guān)。 另一方面，核酸檢測試劑的靈敏度、 實驗人員的操作方法等實驗因素也會導(dǎo)致核酸漏檢和假陰性， 使部分患者在痊愈前出院，導(dǎo)致出現(xiàn)“復(fù)陽”現(xiàn)象[13-14]。 有研究分析了出院前連續(xù)核酸檢測陰性次數(shù)對出院后復(fù)陽的影響， 結(jié)果顯示連續(xù)3 次及以上核酸檢測陰性可大大降低復(fù)陽比例， 這對今后的疫情防控有很好的提示作用[15]。

新型冠狀病毒核酸檢測應(yīng)嚴格按照SOP 進行實驗，采樣使用滅活采樣管，尤其是疾病治療后期和疑似病例的樣本應(yīng)充分震蕩并靜置30 min 后再進行下一步提取和擴增實驗， 這樣做能有效避免氣溶膠的發(fā)生， 也對避免假陰性結(jié)果具有一定的應(yīng)用價值。 我們醫(yī)院收治的新型冠狀病毒患者數(shù)量不多，本研究存在一定的局限性，研究結(jié)論尚需進一步驗證。