不同稀釋介質(zhì)對乙型肝炎病毒表面抗原定量檢測的影響

陳明心，王煒，張岱，任偉宏

（河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，河南 鄭州 450000）

在目前臨床檢驗(yàn)工作中， 血清HBsAg 濃度已經(jīng)可以使用全自動(dòng)化免疫檢測系統(tǒng)進(jìn)行檢測，但是很多檢測體系的檢測范圍（例如雅培）僅僅為<250 IU/mL，而在一些流行病學(xué)的調(diào)查中發(fā)現(xiàn)，很多乙肝患者的血清HBsAg 濃度能達(dá)到50 000 IU/mL的水平，甚至更高[1]。因此，需要將高濃度HBsAg 血清稀釋到檢測系統(tǒng)的線性范圍內(nèi)進(jìn)行檢測。 已有的研究發(fā)現(xiàn)[2-3]，不同的稀釋液介質(zhì)會(huì)對稀釋后的檢測結(jié)果造成較大的影響， 而導(dǎo)致達(dá)不到稀釋檢驗(yàn)基本要求，影響最終結(jié)果。

LiCA500 光激化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)是一種較新的檢測系統(tǒng)，采用的是均相檢測方法[4-5]。 目前該系統(tǒng)對HBsAg 的檢測線性范圍只能達(dá)到500 μg/L 的水平，不能滿足對HBsAg 高濃度樣本檢測的需求，且試劑供應(yīng)方未提供配套樣本稀釋液。 目前臨床常用稀釋液有生理鹽水和陰性血清，有研究報(bào)道，生理鹽水在其他免疫檢驗(yàn)項(xiàng)目中稀釋效果不理想[6]。本研究嘗試探索尋找影響HBsAg 稀釋結(jié)果的主要成分，從而找到一種理想的HBsAg 定量稀釋液。

1 材料和方法

1.1 標(biāo)本選取 選取LiCA500 上檢測HBsAg 為陽性的樣本50 份（HBsAg 血清濃度覆蓋0.2～500 μg/L 范圍）, 無明顯溶血、 脂血和膽紅素血； 另選擇HBsAg 濃度較高的病人血清（>500 μg/L）51 份，各自隨機(jī)尋找陰性血清將其進(jìn)行稀釋配制成混合血清，該51 份混合血清濃度覆蓋0.2～500 μg/L 范圍。

1.2 稀釋液 選取四種稀釋液：（1）0.85%~0.90%的生理鹽水；（2）BSA， 可根據(jù)需要配制成不同濃度；（3）BGG，可根據(jù)需要配制成不同濃度；（4）隨機(jī)陰性血清（要求HBsAg 和HBsAb 同時(shí)為陰性）

1.3 儀器 光激化學(xué)發(fā)光全自動(dòng)免疫分析儀器（Li-CA500，博陽公司）

1.4 試劑 LiCA500 配套HBsAg 檢測試劑，包含試劑A 和試劑B，以及LiCA 檢測系統(tǒng)共用通用液

1.5 實(shí)驗(yàn)方法

1.5.1 不同稀釋介質(zhì)對稀釋結(jié)果的影響 將101 份HBsAg 陽性樣本分別用生理鹽水，50 g/L BSA、15 g/L BGG 以及隨機(jī)陰性血清進(jìn)行3 倍稀釋。 稀釋方法為病人血清30 μL +稀釋液60 μL，充分混合均勻后,使用LiCA500 檢測。按照試劑配套說明書，檢測過程為加入25 μL 樣本、25 μL 試劑A、25 μL 試劑B，反應(yīng)15 min 后，加入175 μL 通用液，反應(yīng)17 min 后，由儀器檢測發(fā)光值，再根據(jù)校準(zhǔn)曲線自動(dòng)獲得HBsAg 濃度， 將以上稀釋后得到的檢測結(jié)果乘以3， 得出通過稀釋后計(jì)算獲得的HBsAg 濃度（以C1 來表示），而未稀釋的原始樣本直接檢測的濃度以C2 表示，根據(jù)CLSI EP7-A2 文件使用公式計(jì) 算 稀 釋 檢 測 帶 來 的 偏 差：D=|（C1- C2）/ C2|100%，設(shè)定D 在20%以內(nèi)為合格，觀察各稀釋組有多少結(jié)果可以達(dá)到合格。

1.5.2 同一蛋白稀釋介質(zhì)不同濃度對稀釋結(jié)果的影響 選取10 份HBsAg 陽性樣本 （其濃度覆蓋0.2~500 μg/L 范圍），分別用80 g/L、60 g/L、40 g/L、10 g/L 的BSA，以及20 g/L、15 g/L、10 g/L、5 g/L 的BGG 進(jìn)行稀釋， 將不同濃度BSA 以及不同濃度BGG 稀釋后得到的結(jié)果分別除以未稀釋時(shí)的相應(yīng)的原始檢測結(jié)果， 得出稀釋3 倍后的檢測結(jié)果相對于未稀釋檢測結(jié)果的降幅， 對不同濃度的同種基質(zhì)的稀釋液之間的稀釋結(jié)果進(jìn)行相關(guān)分析。 并將其分析結(jié)果進(jìn)行比較。

1.5.3 動(dòng)力學(xué)分析 選取15 份HBsAg 陽性樣本（其濃度覆蓋0.2~500 μg/L 范圍） 分別用生理鹽水、50 g/L BSA、15 g/L BGG、 以及陰性血清稀釋3倍，稀釋后上機(jī)進(jìn)行檢測，在加入通用液后，分別將孵育時(shí)間控制在17 min （總反應(yīng)時(shí)間為32 min）、47 min（總反應(yīng)時(shí)間為62 min）、62 min（總反應(yīng)時(shí)間為77 min） 和77 min （總反應(yīng)時(shí)間為92 min） 進(jìn)行檢測。 并分別用總反應(yīng)時(shí)間62 min、77 min 和92 min 時(shí)測得的發(fā)光信號值除以總反應(yīng)時(shí)間32 min 時(shí)測得的發(fā)光信號值，計(jì)算各自的增幅。

1.5.4 統(tǒng)計(jì)分析 使用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 24.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析， 不同稀釋介質(zhì)對101 例樣本稀釋結(jié)果采用單因素方差分析，并用LSD 法做兩兩比較。 同一種蛋白不同濃度稀釋結(jié)果采用回歸分析。 動(dòng)力學(xué)結(jié)果，不同介質(zhì)稀釋組92 min 相對于32 min 的增幅采用單因素方差分析，并用LSD 法做兩兩比較。

2 結(jié)果

不同稀釋液稀釋后偏差在20%以內(nèi)的樣本例數(shù)見圖1。15 g/L BGG 稀釋后偏差在20%以內(nèi)者最多。 各不同稀釋液稀釋所得回收率偏差結(jié)果如圖2，通過單因素方差分析，非混合樣4 組稀釋結(jié)果的F為35.830，P為0.000，混合樣4 組稀釋結(jié)果的F為91.706，P為0.000，說明無論混合樣本還是非混合樣本，4 組稀釋得到的回收率偏差整體均有顯著性差異，進(jìn)一步做LSD 檢驗(yàn)，15 g/L BGG 和生理鹽水組以及50 g/LBSA 組均有顯著性差異，無論是非混合樣本還是混合樣本均是15 g/L BGG 稀釋所得回收率偏差最小。

圖1 不同稀釋組回收率偏差小于20%的樣本所占比例

圖2 101 例樣本經(jīng)4 種稀釋液稀釋后回收率偏差的對比

對BSA 不同濃度與各濃度稀釋后的降幅之間進(jìn)行相關(guān)分析， 其相關(guān)系數(shù)為-0.088，P為0.589，無明顯差異； 對BGG 不同濃度與各濃度稀釋后的降幅之間進(jìn)行相關(guān)分析， 其相關(guān)系數(shù)為-0.744，P為0.000，有明顯差異。 當(dāng)BSA 作為擁擠分子時(shí)隨著稀釋液中BSA 濃度的增加， 結(jié)果僅僅出現(xiàn)了輕度的下降，并未出現(xiàn)明顯大幅度的改變。當(dāng)BGG 作為擁擠分子時(shí)隨著稀釋液中BGG 濃度的增加， 從5 g/L 增加至20 g/L 時(shí)， 稀釋結(jié)果下降了接近50%。見圖3。

4 組稀釋液對樣本進(jìn)行3 倍稀釋后， 62 min、77 min、92 min 各自相對32 min 的增幅見圖4。 在77 min 至92 min 時(shí)間段的增幅較為接近， 從而認(rèn)為在92 min 時(shí)，抗原抗體結(jié)合反應(yīng)接近達(dá)到平衡，本次研究擬將92 min 作為反應(yīng)平衡點(diǎn)。 4 個(gè)稀釋組92 min 相對于32 min 的增幅，見圖5，通過單因素方差分析，F(xiàn)為27.358，P為0.000， 說明4 組在92 min 得到的增幅整體有差異， 進(jìn)一步進(jìn)行LSD 檢驗(yàn)，15 g/L BGG 組和其他組之間均有明顯差異，結(jié)合圖3 所示，可以看出在92 min 時(shí)，生理鹽水稀釋組和50 g/L 稀釋組的增幅接近，15 g/L BGG 稀釋組的增幅是最大的。

圖4 HBsAg 陽性樣本經(jīng)4 種稀釋液稀釋后延長反應(yīng)時(shí)間相對反應(yīng)32 min 增幅

圖5 不同稀釋組92 min 相對于32 min 的增幅

3 討論

目前已經(jīng)證實(shí)， 在稀釋液中存在的各種反應(yīng)成分以外的基質(zhì)成分會(huì)對反應(yīng)速度造成影響，通常將這些基質(zhì)成分稱為擁擠分子[7]，稀釋液中的擁擠分子如果足以改變抗原抗體反應(yīng)的速度， 則可能造成HBsAg 稀釋結(jié)果的不準(zhǔn)確。 血清中含量最多的成分是蛋白質(zhì)，濃度可達(dá)到60~80 g/L，由此推測， 有可能是血清中其他蛋白質(zhì)作為擁擠分子對HBsAg 和其抗體結(jié)合速度造成了影響。 血清蛋白質(zhì)主要成分為白蛋白和γ 球蛋白，還有少部分的α球蛋白和β 球蛋白， 因此分別選擇BSA 和小牛血清γ 球蛋白作為稀釋液成分， 模擬人血清不同種類蛋白質(zhì)來觀察其對稀釋效果的影響。 由于人血清中白蛋白含量[8]約為40~60 g/L，平均濃度為50 g/L，因此將BSA 稀釋液濃度控制在50 g/L。人血清中IgG 含量[9]約為為8~16 g/L，平均濃度約為12 g/L，而血清中IgG 含量約占γ 球蛋白的80%，因此將BGG 稀釋液濃度控制在15 g/L。 為了更好地證明稀釋液的稀釋效果，除了隨機(jī)選取了50 例在0~500 ng/L 的HBsAg 陽性樣本外， 還將較高濃度的HBsAg 陽性血清用其他陰性血清進(jìn)行稀釋配制成混合血清， 將混合血清濃度稀釋在0.2~500 μg /L的范圍內(nèi)。 一份混合血清往往代表了兩到三份樣本的綜合情況，可更好地減弱一些隨機(jī)基質(zhì)效應(yīng)。從本次實(shí)驗(yàn)的結(jié)果看， 相對分子量較小的BSA 和生理鹽水的稀釋效果接近， 回收率偏差遠(yuǎn)不能達(dá)到預(yù)期。 而相對分子量較大的BGG 則稀釋效果較好， 近80%的樣本可以達(dá)到80%~120%范圍以內(nèi)。陰性血清稀釋效果出現(xiàn)了較大差異。

將BSA 和BGG 的梯度拉開后，BSA 不同濃度的稀釋液稀釋結(jié)果相差不大， 濃度達(dá)到80 g/L 后略有下降。 而BGG 濃度從5 g/L 增加至20 g/L 時(shí)，稀釋結(jié)果下降了約50%。 由此，可認(rèn)為模仿人γ 球蛋白的BGG 在稀釋過程中是影響稀釋效果是否能夠符合預(yù)期的主導(dǎo)影響因素。 造成該種現(xiàn)象的原因可能是，γ 球蛋白由于分子量較大， 因此是血液粘度的主要決定因素[10-11]。 而血液粘度決定了分子的擴(kuò)散受到的摩擦力從而影響擴(kuò)散速度, 且血清中的HBsAg 大多不是單純的游離形式存在的蛋白，而是病毒小圓顆粒表面的蛋白質(zhì)[12],大顆粒物質(zhì)更容易受到摩擦力的阻滯作用， 導(dǎo)致抗原抗體相遇的速度更慢。作為對比，蛋白成分BSA 并非影響分子擴(kuò)散的主要影響因素。

為了進(jìn)一步驗(yàn)證BGG 對擴(kuò)散的影響。 本次實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步進(jìn)行了動(dòng)力學(xué)觀察。 針對不同稀釋液稀釋的樣本， 采用增加孵育時(shí)間的方法觀察其檢測結(jié)果的變化。 如果是影響擴(kuò)散的情況下，則在較早的時(shí)間點(diǎn)中，抗原抗體相遇較少，形成的復(fù)合物也較少，但是抗原抗體的總量并未發(fā)生變化，只是結(jié)合速度發(fā)生了改變，因此延遲孵育時(shí)間，使其能夠充分結(jié)合而達(dá)到反應(yīng)平衡之后， 則在第一次檢測到達(dá)到反應(yīng)平衡這段時(shí)間中BGG 稀釋的樣本會(huì)有更多的抗原抗體復(fù)合物形成， 因此其增幅與生理鹽水稀釋樣本以及BSA 稀釋樣本相比明顯較大，與隨機(jī)選取的陰性血清相比也較大， 這可能和陰性血清稀釋結(jié)果不穩(wěn)定的情況有關(guān)， 里面可能還會(huì)存在一些未知因素的干擾， 這些仍需進(jìn)一步研究。 由以上推測，BGG 稀釋組中HBsAg 和其抗體的整體擴(kuò)散速度應(yīng)低于生理鹽水稀釋組和BSA 稀釋組，BGG 可能具備和血清中γ 球蛋白較為接近的控制HBsAg 和其抗體擴(kuò)散的能力， 從而得到了較好的HBsAg 定量稀釋結(jié)果。