干旱脅迫下枯草芽孢桿菌對(duì)玉米苗期葉片的生理生化調(diào)節(jié)

李安　舒健虹　劉曉霞　路雪萍　焦?jié)O　王小利　趙德剛

摘 要 為探究干旱脅迫下不同枯草芽孢桿菌對(duì)玉米苗期葉片的生理調(diào)節(jié)作用，通過(guò)對(duì)干旱與正常水分下玉米根部接種R9-1、R59、R60等3 種不同植物根際的枯草芽孢桿菌及R59+R60組合菌種，測(cè)定玉米苗期葉片的抗氧化酶活性、細(xì)胞滲透物質(zhì)、細(xì)胞膜氧化產(chǎn)物、H2O2、內(nèi)源激素、相對(duì)含水量等生理生化調(diào)節(jié)物質(zhì)以及葉片的K、P、N含量。通過(guò)主成分分析與相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)接種枯草芽孢桿菌主要影響玉米苗期葉片的可溶性糖、脫落酸（ABA）、磷（P）含量、超氧化歧化酶（SOD）活性、過(guò)氧化氫酶（CAT）活性、過(guò)氧化物酶（POD）活性、葉片游離脯氨酸（PRO）含量、葉片相對(duì)含水量，其中葉片相對(duì)含水量與其他生理表現(xiàn)因子呈顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系。干旱脅迫下，接種枯草芽孢桿菌的玉米苗期葉片抗氧化酶活性、細(xì)胞滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)、P、N含量顯著降低。接種R9-1、R59降低H2O2與ABA含量，接種R60、R59+R60提高ABA含量，接種R59、R60、R59+R60降低吲哚乙酸含量。隸屬函數(shù)綜合分析枯草芽孢桿菌對(duì)玉米的調(diào)節(jié)作用排名為：正常情況下R60＞ ?R59＞R9-1＞R59+R60＞CK1；干旱脅迫下R60＞R59+R60＞R59＞R9-1＞CK2。綜上所述，接種枯草芽孢桿菌玉米苗期葉片的生理表現(xiàn)為抗氧化酶活性、細(xì)胞滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)、P、N含量顯著降低，同時(shí)R59、R60、 ?R59+R60均有效提升玉米苗期葉片的相對(duì)含水量，說(shuō)明接種枯草芽孢桿菌玉米苗期受干旱脅迫影響程度較小，所以接種枯草芽孢桿菌具有提升玉米苗期適應(yīng)干旱脅迫的調(diào)節(jié)能力，從而保證自身的生長(zhǎng)發(fā)育。

關(guān)鍵詞 玉米；枯草芽孢桿菌；隸屬函數(shù)；干旱脅迫

玉米是中國(guó)重要的糧飼作物，在全國(guó)大面積種植，可作為工業(yè)原料、食品、牲畜飼料，在中國(guó)糧飼生產(chǎn)和農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)方面發(fā)揮著重要作用。干旱是制約農(nóng)作物生長(zhǎng)的重要非生物因素之一，提高作物抗逆性是提高產(chǎn)量的一種有效方式。對(duì)于多數(shù)作物而言，干旱脅迫反應(yīng)敏感的關(guān)鍵時(shí)期都是芽期和苗期［1］，研究發(fā)現(xiàn)利用植物根際促生菌提升植物抗逆性是一種有效的方式，其中Bacillus megaterium、Bacillus aryabhattai、Bacillus megaterium等菌種均促進(jìn)玉米種子萌發(fā)［2］。處于干旱脅迫下，B.megaterium、B.aryabhattai、B.megaterium等菌種對(duì)玉米芽期的抗氧化酶系、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)、細(xì)胞膜氧化產(chǎn)物均有顯著的調(diào)控作用，其中顯著降低了玉米芽尖的 MDA 含量，能有效減弱玉米芽期細(xì)胞受干旱的損傷［3］?？莶菅挎邨U菌（B.subtilis）是一種植物根際促生菌，其生理特征豐富多樣，極易分離培養(yǎng)，能產(chǎn)生多種抗菌素和酶。因此，前人研究主要在枯草芽孢桿菌對(duì)植物病害生物防治方面的應(yīng)用，目前發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌在黃瓜［4-5］、辣椒［6-7］、水稻［8-9］、小麥［10-12］、玉米［13-14］等農(nóng)作物病害上存在較好防治效果［15］。生物防治機(jī)理是其產(chǎn)生的細(xì)胞素、酶類(lèi)、活性蛋白質(zhì)等物質(zhì)能夠?qū)γ咕⒔湍?、?xì)菌具有一定的抑制作用；同時(shí)可通過(guò)溶菌作用是拮抗微生物生長(zhǎng)，主要方式為吸附在病原真菌的菌絲上，并隨著菌絲生長(zhǎng)而生長(zhǎng)，而產(chǎn)生溶菌物質(zhì)消解菌絲體，能使菌絲發(fā)生斷裂、解體、細(xì)胞質(zhì)消解，有的菌絲原生質(zhì)凝結(jié)；或者是產(chǎn)生次生代謝產(chǎn)物對(duì)病原菌孢子的細(xì)胞壁產(chǎn)生溶解作用，致使細(xì)胞壁穿孔、畸形等現(xiàn)象［4］。與此同時(shí)又能產(chǎn)生生長(zhǎng)激素，如生長(zhǎng)素（Auxin，）、赤霉素（Gibberellin）、細(xì)胞分裂素（Cytokinin）、脫落酸（Abscisic acid）和乙烯（Ethylene）等，促進(jìn)植物生長(zhǎng)，繼而改善農(nóng)作物生長(zhǎng)發(fā)育［16-17］?；谏L(zhǎng)激素在植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中的調(diào)控作用，為此探討枯草芽孢桿菌對(duì)玉米苗期處于干旱脅迫下的生理調(diào)節(jié)作用，為枯草芽孢桿菌作為添加劑的生物菌肥的開(kāi)發(fā)與玉米抗旱性評(píng)價(jià)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材? 料

供試玉米（Zea mays L.）種子品種為‘金玉818，由貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院旱糧所提供。菌種由貴州省野外采集實(shí)驗(yàn)室保存及生物商品菌肥篩選而來(lái)（表1）。盆栽土壤取自貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院內(nèi)，理化數(shù)據(jù)（貴陽(yáng)）如表2。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 方? 法

將編號(hào)為B、C、D、E 4個(gè)菌種培養(yǎng)擴(kuò)增，調(diào)節(jié)OD600值至0.9左右用于菌種試驗(yàn)。將每組90粒玉米種子于10%次氯酸鈉溶液下消毒20 min，再用無(wú)菌水洗滌3～5 次，自然晾干，備用。

將消毒后的玉米分別置于80 mL不同的菌液（表3）中浸泡4 h作為試驗(yàn)組，CK1（正常處理不接種菌）和CK2（干旱處理不接種菌）的玉米置于80 mL滅菌的菌體培養(yǎng)基中浸泡4 h作為對(duì)照組，然后將玉米在無(wú)菌條件下移至培養(yǎng)皿中，待試驗(yàn)組玉米表面菌液與對(duì)照組玉米表面培養(yǎng)基自然風(fēng)干后，播種于裝有滅菌土壤的同種規(guī)格的花盆中，每盆5粒，每組8個(gè)重復(fù)。玉米第1次出土?xí)r記錄玉米苗出土情況，直至玉米出土期結(jié)束，將各處理的多余玉米移除，保留每盆2株玉米苗即可。待玉米三葉期時(shí)向試驗(yàn)組花盆中玉米根部周?chē)恐曜⑷?0 mL OD600為0.9左右的對(duì)應(yīng)菌液（B、C、D、E），對(duì)照組（CK1，CK2）花盆中玉米根部周?chē)恐曜⑷?0 mL LB液體培養(yǎng)基，待玉米生長(zhǎng)10 d后進(jìn)行干旱處理。正常處理按土壤最大持水量80%，干旱處理按土壤最大持水量40%來(lái)控制水分，干旱20 d后取玉米葉片進(jìn)行指標(biāo)測(cè)量。測(cè)量指標(biāo)分別為玉米苗期的葉片超氧化物歧化酶（SOD）活性、過(guò)氧化氫酶（CAT）活性、過(guò)氧化物酶（POD）活性、葉片游離脯氨酸（PRO）含量、丙二醛（MDA）含量、可溶性糖含量、H2O2含量、1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸（ACC）含量、吲哚乙酸（IAA）含量、脫落酸（ABA）含量、相對(duì)含水量、鉀（K）含量、磷（P）含量、氮（N）含量等。

1.2.2 指標(biāo)測(cè)量方法及計(jì)算公式 SOD活性、CAT活性、POD活性、PRO含量、MDA含量、可溶性糖含量、H2O2含量等均授權(quán)蘇州格銳思生物科技有限公司按表4所示試劑盒使用方法進(jìn)行測(cè)定。

ACC含量、吲哚乙酸（IAA）含量、脫落酸（ABA）含量等由上海三黍生物科技有限公司采用LC-MS法測(cè)定。

相對(duì)含水量測(cè)定公式：相對(duì)含水量=（總鮮質(zhì)量-干質(zhì)量）/（葉片飽和吸水質(zhì)量-干質(zhì)量）×100%

K、P、N含量測(cè)定：采用硫酸-雙氧水消解，凱氏法測(cè)定植物全氮含量，鉬銻抗吸光光度法測(cè)定植物全磷含量，原子吸收分光光度計(jì)測(cè)定植物全鉀含量［18］。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2016進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，方差分析采用Spss 20軟件分析。

式中，Xij和 Xj分別表示第i處理第j個(gè)指標(biāo)的隸屬值和所有株系第j 個(gè)指標(biāo)的平均值; Xmin和Xmax表示第j個(gè)指標(biāo)的最小值和最大值；計(jì)算隸屬函數(shù)值時(shí)，若指標(biāo)與耐旱性呈正相關(guān)用公式（1） ，若指標(biāo)與耐旱性呈負(fù)相關(guān)用公式（2） 。

2 結(jié)果與分析

2.1 微生物菌劑對(duì)干旱脅迫下玉米葉片表型特征的影響

由圖1可知，干旱條件下不同微生物菌劑對(duì)玉米表型影響各異，與對(duì)照相比，接種枯草芽孢菌劑后玉米對(duì)干旱脅迫的干旱癥狀明顯減弱，而對(duì)照（CK2）的葉片明顯萎蔫卷曲下垂，葉尖和葉基出現(xiàn)焦枯的癥狀。正常情況下接種不同枯草芽孢桿菌菌種后表型變化并不明顯。

2.2 干旱脅迫與正常情況下微生物菌劑對(duì)玉米苗期葉片抗氧化酶活性的影響

如圖2所示，干旱脅迫下玉米葉片SOD活性和POD含量比正常情況有一定程度的升高，接種枯草芽孢桿菌后，在干旱脅迫的情況下玉米葉片SOD、CAT和POD活性均顯著（P＜0.05）降低，不同菌種降低的程度不同；正常情況下與干旱脅迫不同的是除接種C顯著降低CAT活性與接種E顯著升高CAT活性外，其余接種的菌種對(duì)玉米苗期葉片CAT活性影響不顯著，而接種的菌種僅B對(duì)玉米苗期葉片POD活性差異不顯著，其余菌種均顯著降低POD活性，所以不同的菌種在干旱脅迫與正常情況下對(duì)玉米抗氧化酶活性的調(diào)節(jié)存在差異，同時(shí)同種條件下不同的菌種對(duì)玉米抗氧化酶活性的調(diào)節(jié)也存在差異。

2.3 干旱脅迫下微生物菌劑對(duì)玉米苗期葉片滲透壓調(diào)節(jié)物質(zhì)積累的影響

如圖3所示，干旱脅迫下玉米苗期葉片細(xì)胞內(nèi)滲透壓物質(zhì)積累較正常條件下均有不同程度增加。接種枯草芽孢桿菌后均顯著（P＜0.05）降低玉米苗期葉片滲透物質(zhì)PRO含量與可溶性糖含量的積累，不同的菌種降低程度存在差異。正常情況下接種枯草芽孢桿菌顯著提升玉米苗期葉片PRO含量的累積，而對(duì)于可溶性糖積累的影響除接種D不顯著外，接種B與C顯著降低，接種E顯著升高可溶性糖；上述可知不同的菌種在干旱脅迫與正常情況下對(duì)玉米苗期葉片滲透物質(zhì)含量的調(diào)節(jié)存在差異，同時(shí)同種條件下不同的菌種對(duì)玉米苗期葉片滲透物質(zhì)的調(diào)節(jié)也存在差異。

2.4 干旱脅迫下微生物菌劑對(duì)玉米苗期葉片活性氧累積的調(diào)節(jié)

由圖4可知，遭遇干旱時(shí)玉米苗期葉片活性氧累積會(huì)升高，處于正常情況下，接種B、D和E時(shí)玉米苗期葉片活性氧累積顯著（P＜0.05）高于對(duì)照組，接種C顯著降低玉米苗期葉片活性氧累積；處于干旱脅迫下接種D與E對(duì)玉米苗期葉片活性氧的影響不顯著，接種B與C顯著降低玉米苗期葉片活性氧累積。

2.5 干旱脅迫下微生物菌劑對(duì)玉米苗期葉片膜脂過(guò)氧化物的影響

MDA是干旱脅迫造成細(xì)胞膜脂過(guò)氧化的主要產(chǎn)物之一。如圖5所示，干旱脅迫下玉米苗期葉片MDA含量升高，接種不同的菌種對(duì)玉米葉片MDA含量的累積呈現(xiàn)出不同的影響，干旱脅迫下接種B菌種對(duì)玉米苗期葉片MDA含量的累積無(wú)明顯差異，接種C、D、E均顯著（P＜0.05）降低MDA含量的累積。正常情況下接種枯草芽孢桿菌顯著降低玉米苗期葉片MDA含量的累積，且不同菌種降低程度不同。

2.6 微生物菌劑對(duì)玉米苗期葉片激素的影響

如圖6所示，在干旱脅迫與正常情況下接種微生物菌劑對(duì)玉米苗期葉片激素的調(diào)節(jié)情況，干旱脅迫下玉米葉片ACC與ABA含量均升高，而對(duì)IAA的影響程度不明顯。接種不同菌劑對(duì)玉米葉片ACC、ABA、IAA含量的影響程度不同。正常情況下，接種B、D、E顯著提高玉米葉片ACC含量，接種C對(duì)玉米葉片ACC含量差異不顯著；接種C、D、E顯著降低玉米葉片IAA含量，其余處理差異不顯著；接種B、E顯著升高葉片ABA含量，接種C、D顯著降低玉米葉片ABA含量。干旱脅迫下接種B顯著提高玉米葉片ACC含量，其余處理對(duì)葉片ACC含量影響差異不顯著；接種D、E兩種菌種顯著降低玉米IAA含量，接種B、C差異不顯著；接種B、C顯著升高玉米葉片ABA含量，接種D、E則顯著降低IAA含量。綜上所述，添加菌劑對(duì)玉米處于正常與干旱脅迫的情況下其葉片激素的含量有著不同程度的影響，存在降低與升高兩種模式。

2.7 微生物菌劑對(duì)玉米苗期葉片相對(duì)含水量的影響

如圖7所示，干旱脅迫下能夠降低玉米葉片相對(duì)含水量，接種不同的菌種對(duì)玉米苗期葉片的相對(duì)含水量影響不同。正常情況下，接種枯草芽孢桿菌B顯著降低玉米葉片相對(duì)含水量，其余各試驗(yàn)組均與對(duì)照組差異不顯著。而處于干旱脅迫下，接種C、D、E? 3種菌種均顯著提高玉米相對(duì)含水量，接種B對(duì)玉米葉片相對(duì)含水量影響不顯著，說(shuō)明處于干旱脅迫時(shí)接種C、D、E? 3種枯草芽孢桿菌可以調(diào)節(jié)玉米葉片相對(duì)含水量。

2.8 微生物菌劑對(duì)玉米苗期葉片K、P、N含量的影響

如圖8所示，水分與接種枯草芽孢桿菌對(duì)玉米苗期的K含量影響不大，而干旱脅迫下玉米葉片N含量增加，接種不同的枯草芽孢桿菌對(duì)葉片N含量存在不同的影響，其中正常情況下接種枯草芽孢桿菌顯著降低了玉米苗期葉片N含量，干旱脅迫下也大致呈現(xiàn)出相同的趨勢(shì)。除干旱脅迫下接種B菌種對(duì)玉米葉片P含量影響不顯著外，正常與干旱脅迫下接種枯草芽孢桿菌顯著降低玉米葉片P含量。說(shuō)明干旱脅迫與正常情況下接種枯草芽孢桿菌對(duì)于玉米葉片常規(guī)營(yíng)養(yǎng)指標(biāo)存在影響，特別是N和P的影響。

2.9 玉米苗期受微生物菌劑影響指標(biāo)的篩選及影響因數(shù)之間的相關(guān)性分析

對(duì)玉米葉片ACC、吲哚乙酸、脫落酸、抗氧化酶活性、細(xì)胞滲透物質(zhì)、細(xì)胞膜氧化產(chǎn)物、N、P、K等指標(biāo)進(jìn)行主成分分析，本試驗(yàn)提取3個(gè)主成分（表5和表6），其中第一主成分的特征值為 ?7.262，貢獻(xiàn)率為51.868%，對(duì)應(yīng)特征向量中，數(shù)量較大的指標(biāo)有可溶性糖、脫落酸、CAT等。第二主成分的特征值為2.737，貢獻(xiàn)率為 ?19.551%，對(duì)應(yīng)的特征向量中主要表現(xiàn)在吲哚乙酸和P含量方面。第三主成分的特征值為1.504，貢獻(xiàn)率為10.740%，對(duì)應(yīng)的特征向量中主要表現(xiàn)在SOD活性、相對(duì)含水量、POD活性方面。以上3個(gè)主成分的累計(jì)貢獻(xiàn)率為82.159%，基本包含了所測(cè)指標(biāo)的全部信息。結(jié)合表7可看出，玉米苗期葉片各影響因數(shù)之間的相關(guān)性：葉片相對(duì)含水量與ACC、吲哚乙酸、脫落酸、抗氧化酶活性、細(xì)胞滲透物質(zhì)以及細(xì)胞膜氧化產(chǎn)物等呈現(xiàn)顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系，與P、K和H2O2等呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)關(guān)系，其余各指標(biāo)間均呈現(xiàn)正相關(guān)關(guān)系。綜合主成分分析和相關(guān)性分析結(jié)果，玉米苗期葉片的可溶性糖、脫落酸、P含量、SOD、PRO、CAT、POD、葉片相對(duì)含水量等8個(gè)指標(biāo)在接種不同的枯草芽孢桿菌種容易受到影響。

2.10 枯草芽孢桿菌對(duì)玉米苗期葉片生理生化調(diào)節(jié)隸屬函數(shù)綜合評(píng)價(jià)

針對(duì)不同植物根際的枯草芽孢桿菌對(duì)玉米苗期的生理生化調(diào)節(jié)作用不同，通過(guò)隸屬函數(shù)均值綜合評(píng)價(jià)出不同植物根際的枯草芽孢桿菌對(duì)玉米苗期的生理生化調(diào)節(jié)作用（表8）。其中正常與干旱情況4組枯草芽孢桿菌均能夠提高玉米生長(zhǎng)發(fā)育能力，根據(jù)對(duì)玉米各項(xiàng)指標(biāo)的隸屬函數(shù)均值進(jìn)行排名，正常情況：D1＞C1＞B1＞E1＞CK1；干旱脅迫下：D2＞E2＞C2＞B2＞CK2。

3 討? 論

處于正常水分與干旱脅迫時(shí)植物存在不同的應(yīng)答機(jī)制，其中正常水分情況下植物體內(nèi)活性氧代謝保持著動(dòng)態(tài)平衡［19］，而干旱脅迫情況下的植物活性氧代謝呈現(xiàn)不平衡狀態(tài)。這種植物體內(nèi)活性氧代謝狀態(tài)部分依賴(lài)于SOD、POD、CAT等抗氧化酶與其他抗氧化物質(zhì)組成的抗氧化系統(tǒng)的調(diào)控作用?？购敌詮?qiáng)的植物體內(nèi)的 SOD、POD、CAT的活性一般較高，該調(diào)控作用在于有效清除植物體內(nèi)活性氧，阻抑膜脂過(guò)氧化，緩解植物因干旱脅迫受到的傷害［20］。本試驗(yàn)中，干旱脅迫下玉米苗期葉片SOD、POD、CAT的活性均有不同程度的升高，這與前人研究一致，玉米苗期葉片SOD、POD、CAT活性在一定的程度下代表玉米受到干旱脅迫程度。處于干旱脅迫與正常情況下，玉米根部接種不同的枯草芽孢桿菌對(duì)玉米葉片抗氧化酶 SOD、POD、CAT的活性存在著不同程度的影響。根據(jù)已經(jīng)證實(shí)的結(jié)論，植物根際促生菌可產(chǎn)生有益于植物生長(zhǎng)的化合物［21-22］，通過(guò)產(chǎn)生植物激素、固氮、溶磷、產(chǎn)鐵載體能力來(lái)提高植物的生長(zhǎng)能力。而處于干旱脅迫時(shí)，接種植物根際促生菌后能夠促進(jìn)根部的發(fā)育以及根部吸收的功能從而提高植物抗旱性，通過(guò)對(duì)辣椒接種植物根際促生菌后，辣椒的耐旱性明顯高于對(duì)照組，其主要是通過(guò)促進(jìn)根部的發(fā)育來(lái)提高植物吸收水分的能力［23］。值得注意的是，在干旱脅迫的情況下玉米根部接種不同的枯草芽孢桿菌使得玉米葉片SOD、CAT和POD活性均顯著（P＜0.05）降低?？梢缘贸隹莶菅挎邨U菌可以促進(jìn)玉米苗期對(duì)水分的吸收，從而使得玉米苗期受干旱脅迫影響度降低。所以枯草芽孢桿菌一定程度上提高了玉米苗期對(duì)于干旱的耐受范圍。

植物應(yīng)對(duì)干旱脅迫的另一種應(yīng)答方式為細(xì)胞滲透勢(shì)調(diào)節(jié)，植物可通過(guò)細(xì)胞內(nèi)水分減少、細(xì)胞體積縮小、細(xì)胞內(nèi)溶質(zhì)增加等3種方式進(jìn)行植物細(xì)胞滲透勢(shì)的調(diào)節(jié)［24］。其中細(xì)胞內(nèi)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的積累是細(xì)胞滲透勢(shì)在干旱脅迫下多呈現(xiàn)為降低趨勢(shì)的原因之一。而植物滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)其中一大類(lèi)為有機(jī)溶劑，如可溶性糖、可溶性蛋白、脯氨酸等［25］。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)干旱脅迫下玉米可溶性糖和脯氨酸的積累量均比正常水分高，表明植物細(xì)胞內(nèi)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的積累是反映植物受干旱脅迫的影響程度。而接種不同枯草芽孢桿菌呈現(xiàn)出不同的影響結(jié)果，具體表現(xiàn)為干旱脅迫下接種枯草芽孢桿菌均顯著（P＜0.05）降低玉米苗期葉片PRO含量和可溶性糖含量的積累。而植物體內(nèi)的可溶性糖含量在干旱脅迫情況下普遍上升，這是對(duì)干旱脅迫適應(yīng)的一種表現(xiàn)［26］。本試驗(yàn)中干旱脅迫時(shí)接種枯草芽孢桿菌能夠降低植物滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量，表明接種菌種后玉米受干旱脅迫的影響程度降低。

干旱脅迫促進(jìn)了植物細(xì)胞膜脂過(guò)氧化作用，且隨著脅迫程度的加深呈先上升后下降的趨勢(shì)。這與植物體內(nèi)抗氧化酶活性升高作用有關(guān)［27］。細(xì)胞內(nèi)H2O2是造成植物細(xì)胞膜氧化的關(guān)鍵因素之一，其含量在一定程度可代表植物受到干旱脅迫的水平。本試驗(yàn)中，遭遇干旱時(shí)玉米苗期葉片活性氧累積升高，處于干旱脅迫下接種D與E對(duì)玉米苗期葉片活性氧的影響不顯著，接種B與C顯著降低玉米苗期葉片活性氧，在一定程度緩解葉片的膜脂過(guò)氧化作用。MDA是活性氧氧化植物細(xì)胞膜主要產(chǎn)物之一，代表著植物受干旱脅迫的程度，其含量與H2O2含量呈正相關(guān)關(guān)系，本試驗(yàn)中干旱脅迫下接種B菌種對(duì)玉米苗期葉片MDA含量的累積無(wú)明顯差異，接種C、D、E均顯著降低MDA含量的累積。正常情況下接種枯草芽孢桿菌顯著降低玉米苗期葉片MDA含量的累積，且不同菌種降低程度不同，可以推斷接種C、D、E能夠在一定程度下避免部分玉米葉片的膜脂氧化作用，可描述為增強(qiáng)玉米苗期的抗旱性。

干旱脅迫影響玉米的生長(zhǎng)發(fā)育，值得注意的是，植物內(nèi)源激素中ABA、ACC和吲哚乙酸在植物的生長(zhǎng)發(fā)育與分化方面發(fā)揮著至關(guān)重要的作用［28］，如干旱脅迫下根部合成的ABA可被傳遞給植物葉片，減少葉片氣孔開(kāi)度，降低蒸騰作用，增加植株保水能力［29］。本試驗(yàn)為此探討干旱脅迫下接種不同植物根際來(lái)源的枯草芽孢桿菌對(duì)玉米ABA、ACC和吲哚乙酸的影響情況。呈現(xiàn)出正常情況接種B、E顯著升高玉米葉片ABA含量，而接種C、D則顯著降低ABA含量，E由C、D組成，其顯著升高玉米葉片ABA含量原因可能在于微生物間的協(xié)作關(guān)系，具體關(guān)系仍需進(jìn)一步探究。鑒于植物生長(zhǎng)發(fā)育是復(fù)雜的一系列反應(yīng)，單方面因素難以評(píng)判是否對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育的影響；而處于干旱情況時(shí)接種B、C顯著升高玉米葉片ABA含量，更能夠促使葉片蒸騰作用減小，鑒于ABA在植物體內(nèi)的作用，接種B、C后玉米苗期根部受到干旱的影響反應(yīng)較強(qiáng)；而接種D、E則降低ABA含量，說(shuō)明接種后受到外界干旱的影響較小，推測(cè)因?yàn)榻臃ND、E能較好地促使玉米苗期根系對(duì)水分的吸收，從而玉米苗期自身生理反應(yīng)不強(qiáng)烈，ABA含量較低。ACC作為合成乙烯的前體物質(zhì)，合成后的乙烯在植物生長(zhǎng)發(fā)育及應(yīng)對(duì)防御反應(yīng)中也起著重要的調(diào)控作用，值得注意的是對(duì)于玉米應(yīng)對(duì)干旱脅迫的調(diào)控反應(yīng)是ACC含量的升高，接種不同的枯草芽孢桿菌使得玉米ACC含量的反應(yīng)不同，其中正常情況下接種B、D、E顯著提高玉米葉片ACC含量，接種C對(duì)玉米葉片ACC含量差異不顯著；干旱脅迫下接種B顯著提高玉米葉片ACC含量，其余處理對(duì)葉片ACC含量影響差異不顯著；綜上，接種枯草芽孢桿菌在植物應(yīng)對(duì)外界條件脅迫時(shí)能從調(diào)控植物ABA、ACC等激素方向影響玉米應(yīng)對(duì)干旱時(shí)的防御調(diào)控。本試驗(yàn)中接種D、E兩種菌種顯著降低玉米IAA含量，接種B、C差異不顯著。基于張明生等［30］的研究表明，植物IAA含量隨著水分下降而減少，且下降的比例與品種的抗旱性有關(guān)，抗旱性強(qiáng)的下降多，因此利于增強(qiáng)玉米苗期抗旱性。

相對(duì)含水量與自身的光合作用、蒸騰作用和水分利用效率關(guān)系密切，是衡量干旱脅迫下植物葉片水分狀況與反應(yīng)組織代謝活動(dòng)的一個(gè)重要指標(biāo)［31-32］。本研究發(fā)現(xiàn)，處于正常水平下的玉米葉片相對(duì)含水量受接種的枯草芽孢桿菌的影響較小，僅有B菌劑顯著降低玉米葉片相對(duì)含水量；而在干旱脅迫下，接種C、D、E? 3種菌劑處理顯著提高玉米葉片的相對(duì)含水量，使得玉米苗期應(yīng)對(duì)干旱的調(diào)節(jié)能力增強(qiáng)。P、K是作物生長(zhǎng)發(fā)育不可缺少的營(yíng)養(yǎng)元素，是作物體內(nèi)許多重要有機(jī)化合物的組成部分，又以多種形式參與作物體內(nèi)各種生長(zhǎng)過(guò)程。影響作物N、P、K很多，包括土壤和作物特性，但其中最重要的是土壤水分，本研究中水分條件與接種枯草芽孢桿菌對(duì)于玉米苗期葉片K影響均較小，N和P含量受水分條件與接種枯草芽孢桿菌的影響較大。其中干旱脅迫下N和P含量分別增加與降低，此研究結(jié)果與王凱等［33］研究干旱脅迫對(duì)科爾沁沙地榆樹(shù)幼苗C、N、P化學(xué)計(jì)量特征的影響結(jié)果相似。處于干旱脅迫下N素量增加可能由于植物對(duì)于N素的應(yīng)用降低，而正常與干旱脅迫下接種枯草芽孢桿菌N含量顯著降低，推測(cè)因素是接種枯草芽孢桿菌后促進(jìn)玉米幼苗的生長(zhǎng)，對(duì)N素的利用度增加。其次，研究表明植物內(nèi)生菌對(duì)植物對(duì)N素的代謝有著重要的作用，其機(jī)制在于接種植物內(nèi)生菌后，能有效增加植物硝酸還原酶（NR）與谷氨酰胺合成酶（GS）的活性［34-38］，這兩種酶在植物N素代謝過(guò)程中起著重要的調(diào)控作用，其活性增強(qiáng)能有效促進(jìn)植物的生長(zhǎng)于發(fā)育。同時(shí)植物內(nèi)生菌通過(guò)分泌維生素從而影響著植物對(duì)N素的代謝。王珂等［39］研究表明維生素能提高小麥葉片硝酸還原酶的活性，從而促進(jìn)植物對(duì)N素的代謝，這無(wú)疑是促進(jìn)了植物的生長(zhǎng)與發(fā)育［40］。處于干旱脅迫下P含量降低可能由于土壤干旱限制了無(wú)機(jī)磷的吸附與溶解［41］，導(dǎo)致植物從土壤中吸收P減少；同時(shí)干旱導(dǎo)致木質(zhì)部形成栓塞［42］，P隨蒸騰作用向上運(yùn)輸可能受阻，導(dǎo)致P在細(xì)根中積累，其他器官P含量下降。正常與干旱脅迫下接種枯草芽孢桿菌致使玉米苗期葉片P含量呈下降趨勢(shì)，推測(cè)是由于接種枯草芽孢桿菌的玉米幼苗生長(zhǎng)發(fā)育較快，核糖體合成蛋白質(zhì)需要消耗大量P，所以接種枯草芽孢桿菌能夠加強(qiáng)玉米在苗期的代謝，促進(jìn)玉米的生長(zhǎng)發(fā)育，至于植物促生菌對(duì)于植物P代謝方面的機(jī)制尚缺少更細(xì)致研究。

針對(duì)不同植物根際的枯草芽孢桿菌對(duì)玉米苗期的各生理生化調(diào)節(jié)作用不同。通過(guò)隸屬函數(shù)均值綜合評(píng)價(jià)出不同植物根際的枯草芽孢桿菌對(duì)玉米苗期的生理生化調(diào)節(jié)作用。其中正常與干旱情況4種枯草芽孢桿菌處理均能夠提高玉米苗期生長(zhǎng)發(fā)育能力，根據(jù)對(duì)玉米各項(xiàng)指標(biāo)的隸屬函數(shù)均值進(jìn)行排序，正常情況：D1＞C1＞B1＞E1＞CK1；干旱脅迫下：D2＞E2＞C2＞B2＞CK2。所以接種枯草芽孢桿菌均可以增強(qiáng)玉米苗期抗旱性，不同根際的枯草芽孢桿菌效果不同。

綜上所述，接種不同的枯草芽孢桿菌的玉米苗期葉片從抗氧化酶活性、細(xì)胞滲透物質(zhì)、細(xì)胞膜氧化產(chǎn)物、內(nèi)源激素、相對(duì)含水量以及N、P、K等各個(gè)方面調(diào)控玉米以應(yīng)對(duì)干旱脅迫。

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Physiological and Biochemical Regulation of Bacillus subtilis Spores on Leaves at Seedling Stage of Maize under Drought Stress

LI An1，SHU Jianhong2，LIU Xiaoxia2，LU Xueping3，JIAO Yu4，WANG Xiaoli2? and? ZHAO Degang3

Abstract In order to explore the physiological regulation effects of different Bacillus subtilis on the leaves of maize seedlings under drought stress. The physiological and biochemical regulating substances，such as the antioxidant enzyme activity， cell permeation substances， cell membrane oxidation products， H2O2， endogenous hormones， relative water content， and K， P， N contents in the leaves of maize seedlings were evaluated by inoculating maize roots with different plant rhizosphere Bacillus subtilis， which include R9-1， R59， R60 and R59+R60 combination strains under drought and normal water conditions. The principal component and correlation analysis indicated that Bacillus subtilis mainly affected the soluble sugar， abscisic acid （ABA）， phosphorus （P） content， superoxide dismutase （SOD） activity， catalase （CAT） activity， peroxidase （POD） activity， free proline （PRO） content， relative water content of the leaves at seedling stageof maize. Importantly， there was a significantly negative correlation between the relative water content and other physiological performance factors. Under drought stress，the? antioxidant enzyme activity， cell osmotic adjustment substances， and P and N content in the leaves of maize seedlings obviously decreased after inoculated with Bacillus subtilis.By the way， the content of H2O2 and ABA reduced after R9-1， R59 inoculation， the content of ABA increased after R60， R59+R60 inoculation and the content of IAA decreased after R59， R60， and R59+R60 inoculation in the leaves of maize at seedling stage. The regulation effect of Bacillus subtilis on maize was estimated by the comprehensive analysis of membership function under different conditions. Under normal conditions，R60＞R59＞R9-1＞R59+R60＞CK1，under drought stress，? ?R60＞R59+R60＞R59＞R9-1＞CK2. Taken together， the antioxidant enzyme activity， cell osmotic regulation substances， and P， N content of? leaves at seedling of maize decreased after inoculation with Bacillus subtilis.Meanwhile， R59， R60， R59 + R60 was conducive to improve its relative water content. The results demonstrated that the maize seedling inoculated with Bacillus subtilis was less affected by drought. Therefore， the inoculation of Bacillus subtilis can enhance the adjustment ability of maize seedling to adapt drought stress and ensure its growth and development.

Key words Maize;Bacillus subtilis;Membership function;Drought stress

Received2022-02-16Returned 2022-06-05

Foundation item Guizhou High-level Innovative Talents Training Program[No.（2018）5634-2]; Guizhou Science and Technology Project［（No.2020）5005]; Guizhou Talents Training Project; Guizhou High-level Innovative Talents Training Project[No.（2016） 4003].

First author LI An， male，master student. Research area：screening of rhizosphere growth-promoting bacteria of gramineae and ecological fungus fertilizer.E-mail：1964352203@qq.com

Corresponding?? author ZHAO Degang， male， Ph.D，professor，doctoral supervisor. Research area：plant genetic engineering.E-mail：dgzhao@gzu.edu.cn

WANG Xiaoli， male， Ph.D，research fellow. Research area：grass molecular.E-mail：wangxiaolizhenyuan @126.com

（責(zé)任編輯：顧玉蘭 Responsible editor：GU Yulan）

收稿日期：2022-02-16修回日期：2022-06-05

基金項(xiàng)目：貴州省高層次創(chuàng)新人才培養(yǎng)項(xiàng)目［黔科合平臺(tái)人才（2018）5634-2］；貴州省科技計(jì)劃項(xiàng)目［黔科合平臺(tái)人才（2020）5005］；貴州省人才培養(yǎng)項(xiàng)目；貴州省高層次創(chuàng)新型人才培養(yǎng)項(xiàng)目［黔科合人才（2016）4003］。

第一作者：李 安，男，碩士研究生。研究方向?yàn)楹瘫究聘H促生菌的篩選及生態(tài)菌肥。 E-mail：1964352203@qq.com

通信作者：趙德剛，男，博士，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)橹参锘蚬こ獭-mail：dgzhao@gzu.edu.cn

王小利，男，博士，研究員，研究方向?yàn)槟敛莘肿印-mail：wangxiaolizhenyuan @126.com