外源NO對(duì)NaCl脅迫下M26幼苗養(yǎng)分吸收、蔗糖代謝和氮代謝的影響

李凱　馬利萍　楊天一　張滿讓

摘 要 以蘋(píng)果砧木M26組培苗為試驗(yàn)材料，采用營(yíng)養(yǎng)液栽培，研究葉片噴施不同濃度NO供體硝普鈉（SNP）對(duì)NaCl脅迫下幼苗礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)元素的吸收以及蔗糖代謝和氮代謝的影響，以期為增強(qiáng)M26幼苗的耐鹽性研究提供參考。結(jié)果表明：外源NO能夠有效緩解NaCl脅迫對(duì)M26幼苗養(yǎng)分吸收以及蔗糖代謝和氮代謝的負(fù)面影響，總體上以200 μmol·L-1 SNP的噴施效果最佳。外源NO處理不僅能夠有效提升NaCl脅迫下幼苗對(duì)氮、磷和鉀的吸收，而且提高了幼苗的蔗糖代謝水平，表現(xiàn)為進(jìn)一步提高SPS和SS的活性以及MdSPS6和MdSuSy2的表達(dá)水平，并且AI和NI的活性也得到提高，同時(shí)也有效改善了幼苗的氮代謝能力，表現(xiàn)為提高了NR、GS和GDH的活性與硝態(tài)氮的含量，降低了銨態(tài)氮的含量，使銨毒害降低，并且也上調(diào)了MdNR和MdNIR的表達(dá)?？梢?jiàn)，外源NO可在一定程度上緩解NaCl脅迫對(duì)M26幼苗造成的傷害，從而提高幼苗的耐鹽性，促進(jìn)幼苗生長(zhǎng)。

關(guān)鍵詞 蘋(píng)果砧木；鹽脅迫；一氧化氮；蔗糖代謝；氮代謝

蘋(píng)果（Malus domestica Borkh.）屬于薔薇科蘋(píng)果屬多年生落葉果樹(shù)，是當(dāng)今世界上栽培歷史最悠久、栽培面積最廣和產(chǎn)量最大的經(jīng)濟(jì)類果樹(shù)作物之一，也是食用價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值都非常高的果樹(shù)類型，在幫助農(nóng)民脫貧致富、提升農(nóng)村經(jīng)濟(jì)狀況以及促進(jìn)中國(guó)鄉(xiāng)村振興等方面都起到了無(wú)法替代的作用[1]。蘋(píng)果是通過(guò)嫁接進(jìn)行無(wú)性繁殖的果樹(shù)，砧木作為樹(shù)體的基礎(chǔ)部分，對(duì)樹(shù)體的影響尤為重要，因此探究蘋(píng)果砧木對(duì)逆境的抵抗能力和適應(yīng)能力，對(duì)蘋(píng)果產(chǎn)業(yè)發(fā)展具有重要意義[2]。

鹽脅迫作為影響植物生長(zhǎng)和發(fā)育的主要非生物脅迫之一，會(huì)對(duì)植物的新陳代謝產(chǎn)生不利影響[3]。植物對(duì)鹽脅迫的感受性很強(qiáng)，在鹽脅迫初期，植物會(huì)受到離子毒害和滲透脅迫等初級(jí)傷害，而高濃度或者長(zhǎng)時(shí)間的鹽害則會(huì)對(duì)植物產(chǎn)生次級(jí)傷害，比如氧化脅迫和營(yíng)養(yǎng)脅迫。植物自身也已進(jìn)化出一系列抗逆機(jī)制，比如離子外排和區(qū)隔化、加速合成和積累滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)、氣孔關(guān)閉、抗氧化系統(tǒng)的增強(qiáng)等，但這些應(yīng)對(duì)方式都是以抑制植物生長(zhǎng)發(fā)育為代價(jià)的，比如地上地下部的生長(zhǎng)勢(shì)均降低、光合作用受到抑制、多種酶活性降低、生物膜的不可逆?zhèn)?，甚至是生理生化代謝過(guò)程的紊亂等[4-5]。

NO作為植物體內(nèi)一種重要的小分子信號(hào)物質(zhì)，其調(diào)控功能幾乎貫穿植物的整個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程，并且在植物的信號(hào)調(diào)控中具有廣泛性、多樣性和復(fù)雜性的特點(diǎn)[6]。大量研究表明，外源NO可在植物的多個(gè)代謝途徑以多種不同方式對(duì)非生物脅迫產(chǎn)生緩解作用，包括植物生長(zhǎng)[7]、光合作用[8]、滲透調(diào)節(jié)和活性氧代謝[9]等，但目前外源NO處理對(duì)鹽脅迫下蘋(píng)果砧木幼苗的養(yǎng)分吸收、蔗糖代謝以及氮代謝等代謝過(guò)程的研究較少。本研究以蘋(píng)果砧木M26脫毒組培苗為試驗(yàn)材料，通過(guò)營(yíng)養(yǎng)液培養(yǎng)的方法探討外源噴施不同濃度的NO供體硝普鈉（SNP）對(duì)M26幼苗NaCl脅迫下養(yǎng)分吸收、蔗糖代謝以及氮代謝過(guò)程的緩解效應(yīng)，系統(tǒng)闡明NaCl脅迫下外源NO緩解蘋(píng)果屬植物幼苗的作用機(jī)制，為今后NO在蘋(píng)果種植方面的應(yīng)用提供理論依據(jù)，也為優(yōu)勢(shì)砧木推廣提供了相應(yīng)的理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與試驗(yàn)設(shè)計(jì)

選取長(zhǎng)勢(shì)相對(duì)一致且生長(zhǎng)狀況良好的蘋(píng)果砧木M26脫毒組培苗，待幼苗長(zhǎng)至6～8片真葉時(shí)，用自來(lái)水清洗并去除幼苗根部的基質(zhì)和雜質(zhì)后，移至裝有1/2 Hoagland營(yíng)養(yǎng)液的水培箱進(jìn)行培養(yǎng)（表1），并用H3PO4或KOH將pH調(diào)至 ?6.5±0.2。水培箱底部和側(cè)邊均用黑色不透光塑料膜包裹，以保證黑暗狀態(tài)，幼苗用水培定植棉固定于2 cm厚的泡沫板上，并用氧氣泵進(jìn)行20? ?min·h-1的O2供應(yīng)，營(yíng)養(yǎng)液每3 d更換1次。幼苗培養(yǎng)和處理過(guò)程于西北農(nóng)林科技大學(xué)科研溫室內(nèi)完成，全程采用自然光照和水簾降溫。預(yù)培養(yǎng)15 d后進(jìn)行處理，鹽脅迫處理使用NaCl按營(yíng)養(yǎng)液體積比例稱量并溶解于營(yíng)養(yǎng)液，NO處理使用供體硝普鈉（SNP）對(duì)幼苗進(jìn)行葉片噴施并噴至滴水為止，每2 d噴施1次，由于SNP見(jiàn)光和久置易分解，所以SNP于夜間避光噴施并現(xiàn)用現(xiàn)配。試驗(yàn)共設(shè)7個(gè)處理，分別為：1/2 Hoagland營(yíng)養(yǎng)液+蒸餾水（CK）、1/2 Hoagland營(yíng)養(yǎng)液+120?? ?mmol·L-1 NaCl+蒸餾水（T1）、1/2 Hoagland營(yíng)養(yǎng)液+120 mmol·L-1 NaCl+50? ?μmol·L-1 SNP（T2）、1/2 Hoagland營(yíng)養(yǎng)液+120? ?mmol·L-1 NaCl+100 μmol·L-1 SNP（T3）、 ?1/2 Hoagland營(yíng)養(yǎng)液+120 mmol·L-1 NaCl+150 μmol·L-1 SNP（T4）、 ?1/2 Hoagland營(yíng)養(yǎng)液+120 mmol·L-1 NaCl+200 μmol·L-1 SNP（T5）、1/2 Hoagland營(yíng)養(yǎng)液+120? ?mmol·L-1 NaCl+300 μmol·L-1 SNP（T6），其中CK和T1處理組噴施蒸餾水作為對(duì)照，方法同噴施SNP處理組。處理期間每2 d更換1次處理液，處理 ?12 d后采集樣品用于測(cè)定各項(xiàng)指標(biāo)。

1.2 測(cè)定項(xiàng)目及方法

1.2.1 礦質(zhì)元素含量的測(cè)定 氮、磷和鉀含量的提取采用濃H2SO4-H2O2消煮法：準(zhǔn)確稱取烘干后的0.1 g葉片組織于消煮管底部，每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)平行樣，做好標(biāo)記，加5 mL濃H2SO4（AR，98%），搖勻后在消煮爐上先小火加熱（需放在通風(fēng)櫥中），緩慢升溫至270 ℃后，用膠頭滴管向消煮管底部滴加2～3滴H2O2，然后搖勻，每15 min滴加1次，當(dāng)消煮管內(nèi)的溶液呈無(wú)色或清亮后，再加熱15 min以除去消煮管中剩余的H2O2。冷卻后，將反應(yīng)液定容至100 mL，顛倒混勻后分裝到10 mL離心管中待測(cè)。使用AA3連續(xù)流動(dòng)分析儀（AA3; SEAL Analytical，Norderstedt，Germany）測(cè)定氮和磷元素的含量，使用火焰分光光度計(jì)（M410; Sherwood Scientific，Cambridge，UK）測(cè)定鉀元素的含量。

1.2.2 蔗糖代謝和氮代謝相關(guān)酶和物質(zhì)的測(cè)定 蔗糖磷酸合成酶（SPS）和蔗糖合成酶（SS）活性的測(cè)定參照Schrader等[10]的方法，中性轉(zhuǎn)化酶（NI）和酸性轉(zhuǎn)化酶（AI）活性的測(cè)定參考Huang等[11]的方法，硝酸還原酶（NR）活性的測(cè)定參照Bressler等[12]的方法，谷氨酰胺合成酶（GS）和谷氨酸脫氫酶（GDH）的活性根據(jù)前人的研究進(jìn)行測(cè)定[13]，一氧化氮（NO）的含量參考Peng等[14]的方法進(jìn)行測(cè)定，銨態(tài)氮和硝態(tài)氮的含量參考Zhu等[15]的方法測(cè)定。

1.2.3 相關(guān)基因表達(dá)量的測(cè)定 使用改良的CTAB法提取幼苗新葉組織的總RNA[16]，總RNA濃度使用Nano Drop 2000c 分光光度計(jì)（Thermo Fisher Science Inc.America）進(jìn)行測(cè)定，并用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)所提取RNA的完整性和純度。使用TaKaRa PrimeScriptTM RT Reagent試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，具體操作按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

使用SYBR PreMix Ex TaqⅡ（Takara，京都，日本）試劑盒在QuantStudio5定量?jī)x上進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)，所有引物見(jiàn)表2。10 μL的反應(yīng)體系包括5 μL的SYBR○R? Premix Ex TaqTM Ⅱ? ?2×，各0.5 μL的上、下游引物，1 μL的cDNA和3 μL的ddH2O。反應(yīng)程序的設(shè)置參數(shù)為：95 ℃的預(yù)變性3 min，94 ℃的變性15 s，60 ℃的退火 ?20 s，72 ℃的延伸20 s，設(shè)置40次循環(huán)，最后使用2-ΔΔCt的方法計(jì)算基因的表達(dá)量，并對(duì)每個(gè)樣本進(jìn)行3次獨(dú)立的生物學(xué)重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 外源NO對(duì)鈉鹽脅迫下M26幼苗礦質(zhì)元素含量的影響

從表3可以看出，在NaCl處理下，M26幼苗葉片N、P和K元素的含量均有顯著下降，相比于CK處理分別降低48.06%、36.52%和 ?35.53%。一定濃度的SNP噴施后，不同處理組N、P和K元素的含量表現(xiàn)出不同程度的上升趨勢(shì)。從N元素的含量來(lái)看，相比于T1處理，T4、T5和T6 3個(gè)處理的提升最為明顯，且幅度相似，分別顯著增加43.55%、44.99%和47.77%，T3處理也有較大幅度的提升，T2處理則較T1處理無(wú)顯著變化；對(duì)于P元素含量來(lái)說(shuō)，與N的含量相似，也表現(xiàn)為T(mén)4、T5和T6 3個(gè)處理較T1處理的提升幅度最大，分別增加42.48%、39.82%和 ?36.28%；從K元素的含量來(lái)看，T5處理較T1處理的增加幅度最大，為31.64%，T3和T4兩個(gè)處理相比于T1處理也均有顯著提升，分別升高 ?18.29%和22.42%，T2和T6處理較T1處理提升幅度較小，無(wú)顯著差異。以上結(jié)果表明，NaCl處理顯著抑制了幼苗對(duì)N、P和K 3種礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)元素的吸收，而一定濃度SNP的使用有助于緩解鹽脅迫對(duì)幼苗的養(yǎng)分吸收狀況，并以150和200 μmol·L-1的SNP改善效果最佳。

2.2 外源NO對(duì)鈉鹽脅迫下M26幼苗蔗糖代謝的影響

2.2.1 蔗糖代謝酶的活性 由圖1可知，NaCl處理提高了M26幼苗葉片的SPS和SS的活性，相比于CK分別增加28.45%和13.90%，并且顯著降低了AI和NI的活性，較CK分別下降 ?23.11%和11.18%。噴施一定濃度的SNP后，幼苗葉片SPS、SS、AI和NI活性相比于T1處理總體上均呈現(xiàn)出上升趨勢(shì)，但程度不同。對(duì)于SPS的活性來(lái)說(shuō)，T4、T5和T6 3個(gè)處理較T1處理提升幅度最明顯，分別增加了41.97%、 ?46.54%和 ?42.24%，T3處理也有顯著提升，較T1處理增加 ?23.35%；對(duì)于SS活性，相比于T1處理，T5和T6兩個(gè)處理分別提升22.77%和24.67%，增幅顯著，T4處理較T1處理也顯著提升15.33%；從AI活性來(lái)看，相比于T1處理，各濃度SNP的處理總體變化幅度較小，以T5和T6處理的提升最顯著，分別提高19.09%和 ?17.10%，其余3個(gè)處理無(wú)顯著差異；與AI相似，各濃度SNP噴施處理的NI活性相比于T1處理提升有限，波動(dòng)幅度更小，但也存在顯著性變化，以T5和T6處理的提升幅度較大，分別增加 ?6.51%和6.91%，其余3個(gè)處理則較T1處理無(wú)顯著提升。以上分析表明，NaCl處理影響了蔗糖代謝關(guān)鍵酶的活性，而200和300 μmol·L-1 SNP的噴施明顯提高了幼苗的蔗糖代謝水平。

2.2.2 蔗糖代謝相關(guān)基因的表達(dá) 由圖2可知，相比于CK處理，NaCl處理12 d后MdSPS6、MdSuSy2和MdSUT1的表達(dá)均呈現(xiàn)出不同程度的上調(diào)，其中MdSuSy2和MdSUT1上調(diào)顯著，MdSPS6上調(diào)程度不明顯，而MdNINV2的表達(dá)受到顯著抑制，說(shuō)明NaCl脅迫下幼苗通過(guò)轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控蔗糖的代謝；相比于NaCl處理，200 μmol·L-1?? SNP的噴施處理則不同程度地上調(diào)了MdSPS6、MdSuSy2和MdNINV2的表達(dá)，而MdSUT1的表達(dá)水平顯著下調(diào)，說(shuō)明外源NO的使用在基因的轉(zhuǎn)錄水平上對(duì)蔗糖代謝進(jìn)行了 ?調(diào)控。

2.3 外源NO對(duì)鈉鹽脅迫下M26幼苗氮代謝的影響

2.3.1 氮代謝相關(guān)物質(zhì)的含量 由圖3可知，在NaCl處理下，M26幼苗葉片的硝態(tài)氮含量大幅降低，比CK處理顯著下降48.43%，而銨態(tài)氮和NO的含量出現(xiàn)不同程度的升高，其中銨態(tài)氮的含量提升幅度較大，為93.39%，差異顯著，而NO含量與CK處理相比無(wú)顯著差異。一定濃度SNP的噴施后，3種物質(zhì)的含量呈現(xiàn)出不同的變化趨勢(shì)，且不同濃度處理間的作用效果不同，其中各濃度SNP處理組葉片的硝態(tài)氮和NO含量均表現(xiàn)出不同程度的上升趨勢(shì)，而銨態(tài)氮含量則相反。從硝態(tài)氮含量來(lái)看，相比于T1處理，T5和T6處理的提升幅度最明顯，分別達(dá)到了67.60%和 ?63.86%，T4處理的提升幅度較小，為31.59%，T2和T3處理的作用效果不顯著；對(duì)于NO含量，不同濃度SNP的處理相比于T1處理均有顯著升高的趨勢(shì)，但總體來(lái)看波動(dòng)較小，以T3、T4和T5 3個(gè)處理提升效果最為明顯，分別較T1處理增加了27.66%、26.27%和27.66%，T2和T6處理提升幅度較小，但也差異顯著，分別提高 ?14.58%和19.91%；與上述兩種物質(zhì)的趨勢(shì)相反，不同濃度SNP處理的銨態(tài)氮含量相比于T1處理總體上呈現(xiàn)出逐漸降低的趨勢(shì)，并以T5和T6處理的降幅最大，較T1處理分別降低 ?37.91%和42.17%，其余3個(gè)處理較T1處理也有顯著下降的趨勢(shì)，降幅分別為19.70%、 ?30.43%和 ?26.85%?？梢钥闯?，NaCl處理顯著抑制了幼苗的氮素同化能力，一定濃度的SNP處理改善了NaCl脅迫對(duì)幼苗氮代謝的抑制程度，提高了幼苗的氮代謝水平。

2.3.2 氮代謝酶的活性 由圖4可知，在NaCl處理下，M26幼苗葉片NR、GS和GDH的活性均受到明顯抑制，分別較CK處理降低 ?46.30%、56.63%和48.60%。一定濃度SNP的噴施后，相比于T1處理，大多數(shù)處理的NR、GS和GDH活性呈現(xiàn)出回升趨勢(shì)，但不同濃度的作用不同。對(duì)于NR活性來(lái)說(shuō)，可以看出，T5處理的提升幅度最顯著，相比于T1處理增加68.88%，T6處理較T1處理也提升50.10%，其余3個(gè)處理相比于T1處理也有小幅提升，但不顯著；對(duì)于GS活性，則是T5和T6兩個(gè)處理較T1處理的提升幅度最大，分別達(dá)到93.66%和95.07%，T3和T4處理相比于T1處理也顯著提升48.42%和76.59%，T2處理的作用不顯著；從GDH的活性來(lái)看，相比于T1處理，T4處理的提升幅度最顯著，達(dá)到84.17%，且除T2處理外其余處理也均有顯著提升，較T1處理分別增加49.98%、70.82%和 ?45.42%。從上述分析可以看出，NaCl處理顯著抑制了幼苗葉片3種氮代謝酶的活性，而適宜濃度的SNP處理在一定程度上緩解了這種抑制，并以200 μmol·L-1的SNP濃度改善效果最佳。

2.3.3 氮代謝相關(guān)基因的表達(dá) 從圖5可以看出，對(duì)CK、T1和T5 3個(gè)處理幼苗葉片的部分氮代謝酶基因進(jìn)行實(shí)時(shí)定量表達(dá)分析，結(jié)果顯示，在NaCl脅迫12 d后，相比于CK處理，T1處理顯著抑制MdNR和MdNIR的表達(dá)，而MdGS1和MdGDH2的表達(dá)量則呈現(xiàn)出不同程度的提高，并且MdGS1上調(diào)顯著，說(shuō)明NaCl脅迫抑制幼苗轉(zhuǎn)錄層面的氮代謝水平，SNP的噴施對(duì)MdNR和MdNIR的表達(dá)水平有所改善，尤其是MdNIR的上調(diào)明顯，而MdGS1和MdGDH2均出現(xiàn)顯著下調(diào)。

3 討? 論

3.1 外源NO對(duì)鈉鹽脅迫下M26幼苗礦質(zhì)元素含量的影響

作為植物生長(zhǎng)發(fā)育最重要的3種礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)元素，氮、磷和鉀幾乎在植物所有的組織結(jié)構(gòu)、代謝過(guò)程以及能量利用等方面發(fā)揮著不可或缺的作用[17-18]。本研究發(fā)現(xiàn)，NaCl脅迫導(dǎo)致M26幼苗葉片的N、P和K的含量顯著下降，這與唐曉倩等[19]研究結(jié)果一致，說(shuō)明鹽脅迫會(huì)阻礙幼苗對(duì)養(yǎng)分的吸收，這可能是因?yàn)镹aCl脅迫下細(xì)胞內(nèi)部的Cl-和Na+驟然增多，導(dǎo)致細(xì)胞對(duì)NO-3、H2PO-4和K+產(chǎn)生競(jìng)爭(zhēng)排斥，進(jìn)而嚴(yán)重影響植物對(duì)N、P和K吸收和利用[20]；適宜濃度SNP的使用促進(jìn)了幼苗對(duì)N、P和K的吸收，且不同濃度的改善效果不同，但總體上呈現(xiàn)出上升趨勢(shì)，并以150和200 μmol·L-1 SNP的改善效果最佳，這與張倩等[21]的研究結(jié)果類似，說(shuō)明外源NO可以促進(jìn)植物對(duì)N、P和K 3種礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)元素的吸收，這可能是因?yàn)镹O提高了鹽脅迫下生物膜的穩(wěn)定性，從而促進(jìn)離子的穩(wěn)態(tài)，使幼苗體內(nèi)的養(yǎng)分平衡得以維持。

3.2 外源NO對(duì)鈉鹽脅迫下M26幼苗蔗糖代謝的影響

蔗糖代謝是植物光合碳代謝的重要組成部分，作為蔗糖合成和分解的催化劑，蔗糖代謝酶直接調(diào)控植物體內(nèi)蔗糖含量的變化[22]。大量研究表明，在鹽脅迫條件下，植物細(xì)胞內(nèi)SPS和合成方向SS的活性會(huì)顯著提高，為抵抗鹽脅迫而合成和積累更多的蔗糖，AI和NI的合成則受到抑制，以此來(lái)避免更多的蔗糖被分解，從而維持細(xì)胞膨壓，促進(jìn)植物的正常生長(zhǎng)[23-24]。但也有一些研究發(fā)現(xiàn)，鹽脅迫不僅提高了SPS和SS的活性，而且AI和NI的活性也顯著增加[25]，這可能是因?yàn)椴煌锓N響應(yīng)鹽脅迫時(shí)蔗糖代謝酶的調(diào)控作用不同。本研究發(fā)現(xiàn)，NaCl處理顯著提高了M26幼苗葉片的SPS和SS活性，而AI和NI的活性則有小幅下降，說(shuō)明鹽害影響了幼苗的蔗糖代謝水平，而一定濃度NO的使用不僅進(jìn)一步提高了SPS和SS的活性，而且也增強(qiáng)了AI和NI的活性，這說(shuō)明NO不僅促進(jìn)了蔗糖的合成和積累，而且也有效地促進(jìn)了體內(nèi)多余蔗糖的分解，提高了幼苗在鹽脅迫條件下的蔗糖代謝的整體水平，進(jìn)而減輕NaCl脅迫對(duì)幼苗的傷害。在高等植物的蔗糖代謝中，關(guān)鍵酶的活性會(huì)受到pH和基因轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控。此外，蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（SUT）也稱蔗糖-H+共轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，是一種生物膜結(jié)合蛋白，具有蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)能力，廣泛存在于植物的各個(gè)器官中，是光合產(chǎn)物蔗糖在體內(nèi)源庫(kù)間運(yùn)輸?shù)闹匾獏⑴c者，其表達(dá)水平與器官間蔗糖的分配密切相關(guān)[26-27]。SUT也參與植物抵御滲透脅迫的過(guò)程，研究表明，擬南芥中AtSUC2和AtSUC4的表達(dá)水平在鹽害和冷害條件下會(huì)出現(xiàn)顯著提高的趨勢(shì)[28]。大量研究發(fā)現(xiàn)，逆境脅迫會(huì)通過(guò)影響編碼酶基因的表達(dá)而間接調(diào)節(jié)蔗糖代謝酶活性的變化，通過(guò)不同程度的蔗糖合成和分解來(lái)抵御脅迫[29]。本研究發(fā)現(xiàn)，NaCl處理不同程度地上調(diào)了幼苗葉片MdSPS6、MdSuSy2和MdSUT1的表達(dá)，下調(diào)了MdNINV2的表達(dá)，這與陳秀玉[30]的研究結(jié)果類似，說(shuō)明在NaCl脅迫下植株自身通過(guò)調(diào)節(jié)蔗糖相關(guān)代謝酶基因的差異性表達(dá)，促進(jìn)了細(xì)胞對(duì)蔗糖的合成和積累，提高了蔗糖的轉(zhuǎn)運(yùn)效率，以此來(lái)抵御滲透?jìng)Γ?00 μmol·L-1 SNP的噴施處理使MdSPS6和MdSuSy2的表達(dá)水平得到進(jìn)一步提高，說(shuō)明外源NO的使用不僅對(duì)關(guān)鍵酶的活性有促進(jìn)作用，而且也通過(guò)促進(jìn)相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控來(lái)提高蔗糖代謝水平，進(jìn)而促進(jìn)幼苗的生長(zhǎng)發(fā)育進(jìn)程。

3.3 外源NO對(duì)鈉鹽脅迫下M26幼苗氮代謝的影響

作為植物初生代謝中最關(guān)鍵的代謝途徑之一，氮代謝對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育有著非常重要的影響，但氮代謝對(duì)鹽害十分敏感，在鹽脅迫條件下，植物對(duì)氮的吸收、同化和利用都會(huì)受到嚴(yán)重影響[31-32]，尤其是對(duì)于氮代謝中的關(guān)鍵酶類，在鹽脅迫的傷害下，氮代謝酶的活性會(huì)受到抑制，造成氮代謝紊亂[33]。大量研究表明，鹽脅迫會(huì)通過(guò)抑制關(guān)鍵氮代謝酶的活性和促進(jìn)銨態(tài)氮的積累來(lái)對(duì)植物造成傷害[34]。本研究發(fā)現(xiàn)，NaCl脅迫顯著抑制了M26幼苗葉片NR的活性，造成硝態(tài)氮含量降低，導(dǎo)致硝態(tài)氮的吸收和同化水平降低，同時(shí)GS和GDH的活性也明顯受到抑制，說(shuō)明NaCl脅迫抑制了兩種銨態(tài)氮的同化途徑，使銨態(tài)氮積累增多，進(jìn)而對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生銨毒害，這與辛正琦等[35]的研究結(jié)果類似。研究表明，外源NO可以通過(guò)改善植物體內(nèi)的氮代謝途徑來(lái)緩解逆境對(duì)植物造成的脅迫傷害[36]。本研究發(fā)現(xiàn)，一定濃度SNP的噴施緩解了NaCl脅迫對(duì)M26幼苗氮代謝的抑制情況，主要表現(xiàn)為NR、GS和GDH的活性升高，銨態(tài)氮的含量顯著增加，同時(shí)硝態(tài)氮和NO含量也呈現(xiàn)出增加趨勢(shì)，這與代歡歡等[37]的研究結(jié)果相似，說(shuō)明NO可能通過(guò)提高對(duì)植物硝態(tài)氮的同化來(lái)促進(jìn)氮代謝循環(huán)的正常運(yùn)行，同時(shí)誘導(dǎo)GS/GOGAT和GDH兩個(gè)途徑對(duì)銨態(tài)氮的同化，以減少銨態(tài)氮對(duì)幼苗的毒害，促進(jìn)氮代謝的正常運(yùn)行。與蔗糖代謝相同，氮代謝進(jìn)程中關(guān)鍵酶的活性也受其合成和編碼基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控。大量研究表明，逆境條件不僅會(huì)使氮代謝關(guān)鍵酶的活性明顯降低，使硝態(tài)氮和銨態(tài)氮同化程度減弱，而且氮素同化關(guān)鍵酶基因的表達(dá)程度亦下降[38-39]。本研究表明，NaCl脅迫顯著降低了MdNR和MdNIR的表達(dá)水平，并使MdGS1和MdGDH2的表達(dá)明顯上調(diào)，說(shuō)明NaCl脅迫不僅會(huì)抑制M26幼苗氮代謝酶活性，而且也引發(fā)基因轉(zhuǎn)錄水平的變化，同時(shí)植株自身也會(huì)通過(guò)轉(zhuǎn)錄水平的變化來(lái)降低銨的毒害，而200 μmol·L-1 SNP的噴施處理則增加了MdNR和MdNIR的表達(dá)水平，并使MdGS1和MdGDH2的表達(dá)量明顯下調(diào)，這與黃潔[40]的研究結(jié)果類似，可能是因?yàn)橥庠碞O參與了M26幼苗對(duì)NaCl脅迫下的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程，為氮素的吸收和同化提供了正常的微環(huán)境，促進(jìn)了氮代謝關(guān)鍵酶基因的表達(dá)，增強(qiáng)了關(guān)鍵酶的活性，進(jìn)而降低NaCl脅迫對(duì)植株的 ?傷害。

4 結(jié)? 論

在NaCl脅迫下，葉面噴施NO可以有效促進(jìn)M26幼苗對(duì)礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)元素氮、磷和鉀的吸收，并能夠提高幼苗的蔗糖代謝水平，降低銨態(tài)氮對(duì)幼苗的毒害作用，增強(qiáng)幼苗對(duì)氮素的同化能力和氮代謝活躍程度，從而緩解NaCl脅迫對(duì)幼苗生長(zhǎng)的抑制作用，對(duì)提高M(jìn)26幼苗的耐鹽性有明顯效果。不同濃度SNP對(duì)NaCl脅迫下M26幼苗的緩解效果不同，本研究結(jié)果表明，總體上以200 μmol·L-1 SNP的緩解效果最佳。

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Effects of? Exogenous NO Application on Nutrient Uptake，Sucrose Metabolism and Nitrogen Netabolism in M26 Seedlings under NaCl Stress

LI Kai，MA Liping，YANG Tianyi and ZHANG Manrang

Abstract In this study，M26 tissue culture seedlings of apple rootstock were used as experimental materials，we used nutrient solution cultivation to investigate the effects of leaf spraying with different concentrations of NO donor sodium nitroprusside （SNP） on the uptake of mineral nutrients，sucrose metabolism，and nitrogen metabolism of seedlings under NaCl stress.The findings provide a foundational resource for enhancing the salt tolerance of M26 seedlings.The results showed that exogenous NO effectively alleviated the effects of NaCl stress on nutrient uptake，sucrose and nitrogen metabolism in M26 seedlings，with the best overall effect of 200 μmol·L-1 SNP spraying.Exogenous NO not only effectively enhanced the uptake of N，P and K by seedlings，but also increased the level of sucrose metabolism in seedlings.This enhancement was confirmed by increased activities of SPS and SS，as well as heightened expression levels of MdSPS6and MdSuSy， the activities of AI and NI also was also increased.It improved the nitrogen metabolism of seedlings，increasing NR，GS，and GDH activity，and nitrate nitrogen content while reducing ammonium nitrogen content.thus mitigating ammonium toxicity.It also upregulated the expression of? MdNR and MdNIR.In conclusion，the exogenous NO can alleviate the damage caused by NaCl stress to M26 seedlings to a certain extent，thereby improving the salt tolerance of seedlings and promoting seedling growth.

Key words Apple rootstock; Salt stress; Nitric oxide; Sucrose metabolism; Nitrogen metabolism

Received2022-04-22Returned 2022-09-08

Foundation item Baoji Comprehensive Experiment Station of National Apple Industry Technology System （No.MRS-28）.

First author LI Kai，male，master student.Research area： fruit tree cultivation breeding and physiological ecology.E-mail： lk463721167@163.com

Corresponding?? author ZHANG? Manrang，male，Ph.D，professor，doctoral supervisor.Research area： fruit tree molecules，physiological cultivation and pest and disease control.E-mail： mrz@nwafu.edu.cn

（責(zé)任編輯：郭柏壽 Responsible editor：GUO Baishou）

收稿日期：2022-04-22修回日期：2022-09-08

基金項(xiàng)目：國(guó)家蘋(píng)果產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系寶雞綜合試驗(yàn)站（MRS-28）。

第一作者：李 凱，男，碩士研究生，從事果樹(shù)栽培育種和生理生態(tài)研究。E-mail： lk463721167@163.com

通信作者：張滿讓，男，博士，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事果樹(shù)分子、生理栽培和病蟲(chóng)害防治等研究。E-mail： mrz@nwafu.edu.cn