子癇前期患者外周血潛在標志物篩選及其診斷價值

馮 艷

(天津市靜海區(qū)醫(yī)院產(chǎn)科,天津 301600)

臨床流行病學研究顯示,子癇前期(PE)發(fā)病率在所有妊娠中約3%～14%[1]。然而,PE發(fā)病確切的分子機制仍未完全闡明,大多數(shù)研究認為其可能與孕婦體內(nèi)炎性因子導致的胎盤血管阻力增高有關(guān)[2],其發(fā)病機制包括血管痙攣、血管內(nèi)皮細胞激活、血管舒張因子減少等有關(guān)[3]。子癇前期是一種妊娠相關(guān)疾病,其特征是高血壓和大量蛋白尿,其發(fā)病大多在妊娠20周后開始,與產(chǎn)婦的死亡率、器官功能障礙或胎兒生長受限密切相關(guān)[4]。據(jù)估計,PE的發(fā)病率占所有孕婦的3%～10%,其發(fā)生可能與肥胖、高血壓、高齡、妊娠期糖尿病等危險因素有關(guān)[5-6],其分子機制可能與氧化應激、免疫不耐受和血管生成失衡密切相關(guān)。PE應進行早期識別和干預,因此探尋發(fā)現(xiàn)新的PE診斷生物學標志物具有重要臨床意義。近年來,借助基因芯片和RNA測序技術(shù),以及GEO等公共基因表達數(shù)據(jù)庫,眾多的疾病診斷、預后分子被鑒定和應用于臨床。然而,關(guān)于PE表達譜及診斷的研究報道較少,因此本研究采用生物信息分析篩選PE差異表達基因并評價其診斷PE的臨床價值。

1 資料與方法

1.1研究設計:該研究采用生物信息分析及驗證設計。第一,在GEO數(shù)據(jù)庫中檢索和篩選子癇前期與正常孕婦差異表達基因比較的數(shù)據(jù)集;第二,對數(shù)據(jù)集中共差異表達基因進行篩選;第三,對共差異表達基因進行蛋白網(wǎng)絡互作分析(PPI);第四,篩選出PPI網(wǎng)絡中的hub(關(guān)鍵基因);第五,對關(guān)鍵基因作為子癇前期診斷標志物可能性進行分析。具體試驗流程見圖1。

1.2數(shù)據(jù)及資料:本研究所涉及和使用的數(shù)據(jù)庫包括:①基因綜合表達數(shù)據(jù)庫(GEO,https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/);②京都基因與基因組百科全書(KEGG,https://www.kegg.jp/kegg/);③蛋白互相作用拓撲網(wǎng)絡數(shù)據(jù)庫(STRING,http://string-db.org/cgi/input.pl)。

1.3數(shù)據(jù)檢索及分析:首先在GEO數(shù)據(jù)庫中檢索子癇前期對比正常孕婦差異表達的基因數(shù)據(jù)集,檢索詞為“preeclampsia”,種屬為“homo”。對初步檢索到的數(shù)據(jù)集進行摘要閱讀,選取了GSE10588、GSE48424和GSE60438 3個數(shù)據(jù)為研究對象,對3個數(shù)據(jù)集中差異表達的基因進行篩選,篩選條件為基因拷貝數(shù)相差2個,且P<0.05;然后對3個數(shù)據(jù)集中各自的差異表達基因進行共差異分析,并繪制Venn圖。隨后在STRING數(shù)據(jù)庫中鑒定出來的子癇前期與正常孕婦共差異表達基因進行蛋白相互作用拓撲網(wǎng)絡構(gòu)建,構(gòu)建條件為:數(shù)據(jù)來源Textmining,co-expression,gene function 和co-occurrence;相互作用關(guān)系系數(shù)≥0.4;相互作用蛋白不高于40個。在KEGG數(shù)據(jù)庫中對篩選出的差異表達基因相關(guān)信號通路進行分析富集,采用Cytoscapev 3.7.2軟件對拓撲網(wǎng)絡中的hub基因進行篩選關(guān)鍵hub基因,篩選依據(jù)為node-score。

2 結(jié)果

2.1子癇前期患者與健康孕婦差異表達基因篩選:GSE10588、GSE48424和GSE60438 3個數(shù)據(jù)為研究對象,3個數(shù)據(jù)集基本特征見表1。3個數(shù)據(jù)集中共差異表達的基因為7個(圖2),分別為TLR4、MYD88、PRKAR1A、GCH1、NF-κB、FN1UBOX5、ZC2HC1A。

表1 納入分析的3個數(shù)據(jù)基本特征

注:A: GSE10588數(shù)據(jù)集;B:GSE48424數(shù)據(jù)集;C: GSE60438 數(shù)據(jù)集;D:3個數(shù)據(jù)集Venn圖

2.2子癇前期患者與健康孕婦差異表達基因GO及KEGG富集:7個差異表達基因GO分析主要富集于模式識別受體信號通路、I-kappaB / NF-kappaB復合體、toll樣受體結(jié)合等(表2)。KEGG信號通路主要富集于NF-kappa B信號通路、toll樣受體信號通路、MAPK信號通路等。

表2 差異表達基因GO富集

2.3PPI拓撲網(wǎng)絡及hub基因:7個子癇前期患者與健康孕婦差異表達基因繪制PPI拓撲網(wǎng)絡,網(wǎng)絡中有42個蛋白節(jié)點,69個作用關(guān)系,平均作用度為8.05,區(qū)域聚類指數(shù)為0.754,圖3A。Cytoscapev3.7.2軟件對拓撲網(wǎng)絡中的hub基因進行篩選,TLR4和MYD88為差異基因中的關(guān)鍵hub基因,圖3B。

PPI拓撲網(wǎng)絡 hub基因鑒定網(wǎng)絡

2.4血清Hub基因診斷子癇前期價值:TLR4基因和MYD88基因在子癇前期患者血清中的相對表達水平明顯高于正常孕婦,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。血清TLR4為參考診斷子癇前期的敏感性為83.33%(95%CI:58.58%～96.42%),特異性為72.22%(95%CI: 46.52%～90.31%),ROC曲線下面積AUC為0.87; 以MYD88為參考診斷子癇前期的敏感性為77.78%(95%CI: 52.36%～93.59%),特異性為71.34%(95%CI:42.11%～87.83%),ROC曲線下面積AUC為0.80。見圖4。

注:A: TLR4基因在子癇前期與正常孕婦中的表達比較;B: TLR4基因診斷子癇前期的ROC曲線;D: MYD88基因診斷子癇前期的ROC曲線;C: MYD88基因在子癇前期與正常孕婦中的表達比較

3 討論

子癇前期(PE)是妊娠期常見的高血壓疾病,流行病數(shù)據(jù)顯示,全球發(fā)病率約為2%～5%。約14%的孕產(chǎn)婦死亡是由PE引起的,PE已成為孕產(chǎn)婦和圍產(chǎn)期死亡率上升的主要原因[7-8]。與血壓正常的孕婦相比,有妊娠高血壓史或PE的孕婦后期發(fā)生腎臟、心血管疾病甚至認知功能受損的風險明顯增加。此外,PE可加重胎兒宮內(nèi)缺氧,導致早產(chǎn),胎兒生長遲緩,或胎兒心臟發(fā)育缺陷導致胎兒心臟功能障礙。然而,PE的病因較多,與多種因素包括高齡、高血壓史、糖尿病等有關(guān),同時近年來的研究顯示,PE的發(fā)生與遺傳因素有關(guān)[9],基因差異表達在PE的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了重要作用。一般情況下,PE的發(fā)展可分為無癥狀和有癥狀兩個階段,妊娠早期胎盤發(fā)育異常引起胎盤功能障礙,后期導致炎性因子釋放到母體血液中,導致高血壓和器官損害。PE早期診斷并進行干預患者往往預后較好,因此探尋發(fā)現(xiàn)新的PE診斷生物學標志物具有重要臨床意義。近年來,采用GEO等公共基因表達數(shù)據(jù)庫進行相關(guān)疾病診斷、預后分子被鑒定和應用于臨床。TLR4在胎盤組織中表達水平明顯升高,而在正常妊娠孕婦中期陽性表達率較低[10],說明TLR4在PET發(fā)生發(fā)展中可能發(fā)揮了重要作用,與本研究一致。同時本研究還進一步評價了血清中TLR4的表達情況,認為PE患者血清中TLR4也明顯高于正常孕婦并具有較高的診斷價值。MYD88同樣為Toll樣受體相關(guān)信號通路中的重要分子,在免疫應答和炎癥反應中發(fā)揮重要作用[11],其在PE患者血清中的高表達可能參與了PE的發(fā)生與發(fā)展,并可作為其診斷的血清學標志物且具有較高的診斷敏感性和特異性。