甲狀腺功能亢進性心臟病患者調節(jié)性T細胞與細胞因子水平的相關性

聶子凡,李 波

(1.濱洲醫(yī)學院,山東 濱州 256603;2.濱洲醫(yī)學院附屬淄博市中心醫(yī)院心內(nèi)科,山東 淄博 255036)

調節(jié)性T細胞(Treg)的概念首先是由Gershon等在1971年提出來的,近年來越來越多的證據(jù)表明CD4+CD25+Treg細胞在外周免疫耐受的維持中發(fā)揮著主要的作用,現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)人類外周血CD4+CD25+Treg細胞與多種自身免疫性疾病如系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類風濕關節(jié)炎及多發(fā)性硬化癥等關系密切[1-3]。甲狀腺功能亢進性心臟病(HHD)是與自身免疫性甲狀腺疾病相關的心臟疾病[4],但目前關于Treg細胞與人類自身免疫性甲狀腺疾病之間關系或相關性的研究還比較少,關于HHD中Treg細胞的研究更少見。本研究旨在探討HHD患者中CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞數(shù)量、細胞因子水平的變化與HHD相關病變指標的相關性,探索CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞改變與自身反應性T細胞的活動狀態(tài),從而有助于了解HHD患者Treg細胞變化在自身免疫性病變進程中的作用和可能的機制。

1 資料與方法

1.1研究對象與分組

1.1.1HHD組:選擇2021年1月～2022年10月在淄博市中心醫(yī)院心內(nèi)科、普外科和胸外科住院的HHD患者。診斷標準:臨床癥狀、體征、彩超、血清甲狀腺自身抗體及細針穿刺,并依據(jù)文獻[4]。納入標準:臨床診斷為HHD,同意參加并配合研究者。排除標準:近兩個月使用過糖皮質激素和(或)免疫抑制類藥物。符合標準的HHD患者共38例,均為女性,年齡25～49歲,平均(39.7±8.5)歲。常規(guī)病理均診斷為甲狀腺功能亢進。術前1～3 d各抽取空腹靜脈血10 ml,置抗凝肝素管,冰浴運輸。

1.1.2正常對照組:選擇健康志愿者20例,均為女性,年齡24～53歲,平均(38.9±10.2)歲,抽取空腹靜脈血10 ml,置抗凝肝素管,冰浴運輸。

1.1.3HHD組:收集2021年10月～2022年8月淄博市中心醫(yī)院外科手術切除的HHD甲狀腺組織及HHD甲狀腺石蠟包埋組織塊。診斷標準:臨床癥狀、體征、彩超、血清甲狀腺自身抗體及細針穿刺,并依據(jù)文獻[4]。納入標準:臨床診斷為HHD且甲狀腺細針穿刺建議做活檢,而快速病理診斷為甲狀腺功能亢進,并伴有心律失常、心臟增大和心力衰竭。并且未使用過糖皮質激素和免疫抑制類藥物。排除標準:使用過糖皮質激素和免疫抑制類藥物。符合標準的HHD甲狀腺石蠟包埋組織共20例,均為女性。年齡21～53歲,平均(41.2±9.9)歲。

1.1.4正常對照組:正常甲狀腺15份為距甲狀腺囊腫或距甲狀腺瘤1 cm以外的甲狀腺組織及甲狀旁腺切除術所切除的小塊甲狀腺組織。其中臨床診斷甲狀腺囊腫4份,甲狀腺瘤6份,甲狀旁腺切除術5份。正常對照組均為女性,年齡23～54歲,平均(42.1±10.7)歲。經(jīng)獨立樣本t檢驗,HHD甲狀腺石蠟包埋組與正常對照組年齡比較,差異無統(tǒng)計學意義(t=0.514,P>0.05),HHD甲狀腺組與正常對照組年齡差異無統(tǒng)計學意義(t=0.612,P>0.05)。本次研究經(jīng)過本院醫(yī)學倫理委員會同意。

1.2方法:采用免疫組化染色方法和流式細胞技術檢測HHD患者和正常人甲狀腺組織中CD25和Foxp3分子的陽性表達及分布情況。通過流式細胞技術檢測正常對照和HHD患者術前外周血中CD4+CD25+Foxp3+T細胞數(shù)量變化;通過電化學發(fā)光技術分析HHD血清中甲狀腺過氧化物酶抗體(TPOAb)和甲狀腺球蛋白抗體(TGAb)水平;分析Treg細胞數(shù)量變化與甲狀腺自身抗體和甲狀腺細胞病理改變的相關性;通過酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測外周血白細胞介素(IL)-6、IL-2、干擾素-γ(IFN-γ)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、IL-4、轉化生長因子-β(TGF-β)及IL-10水平并同時分析它們與Treg細胞的相關性。

2 結果

2.1HHD患者甲狀腺組織病理變化及血清抗體改變的主要特征:HHD患者彩超結果顯示甲狀腺呈現(xiàn)彌漫性腫大,峽部錐體葉腫大,被膜粗厚,內(nèi)部回聲呈網(wǎng)狀CDFI血流信號豐富,與正常對照組血清TGAb(26.4±12.1)IU/ml比較,HHD組血清TGAb(325.5±78.2)IU/ml、TPOAb(140.1±63.7)IU/ml明顯增高。病理學分析可見,HHD甲狀腺呈現(xiàn)彌漫性腫大,峽部錐體葉腫大,腺體質地較韌,組織學分析時可見切面呈分葉狀,色灰白灰黃,有時變黑。顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn),甲狀腺實質組織廣泛破壞,萎縮,較多淋巴細胞浸潤,淋巴濾泡形成,纖維組織增生,有時可出現(xiàn)多核巨細胞。甲狀腺組織內(nèi)的炎細胞浸潤指數(shù)顯著提高(表1)。而正常對照組甲狀腺組織的甲狀腺濾泡發(fā)育成熟,濾泡腔充滿膠質,分布均勻,濾泡呈小葉狀排列,小葉周圍有少量纖維組織和血管,未見炎細胞浸潤。

表1 HHD甲狀腺組織內(nèi)的炎細胞浸潤指數(shù)(n)

2.2HHD外周血Treg細胞的變化及與細胞因子水平、自身抗體、病理改變的相關性:HHD患者外周血Treg細胞的比例(0.81±0.26)%,明顯低于正常對照組的(2.50±0.69)%,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),而CD4+CD25+T細胞的比例明顯高于正常對照組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(見圖1、圖2)。HHD患者外周血IL-2、IL-6、IFN-γ和TNF-α的水平與正常對照組比較明顯升高,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),IL-4、TGF-β及IL-10與正常對照組比較明顯降低,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(見表3)。Treg頻數(shù)與甲狀腺組織的炎性反應程度呈負相關(r=-0.511,P<0.05),與TGAb、 TPOAb呈負相關(r=-0.477、-0.485,P<0.05)。與IL-4無顯著相關性(r=0.317,P>0.05),但與IL-10、TGF-β水平正相關(r=0.714、0.525,P<0.05),與IL-2、IL-6、IFN-γ和TNF-α水平呈負相關(r=-0.536、-0.673、-0.512、-0.498,P<0.05)。

圖2 兩組外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg流式檢測

表3 HHD患者外周血IL-6、IL-2、IFN-γ、TNF-α、IL-4、TGF-β及IL-10測定結果

2.3HHD患者甲狀腺組織中Foxp3+、CD25+、Treg細胞表達水平及與細胞因子水平、自身抗體、病理改變的相關性:Foxp3+細胞在正常甲狀腺主要分布于甲狀腺濾泡附近,在HHD甲狀腺主要分布在淋巴濾泡的浸潤淋巴細胞上,與正常對照組比較數(shù)量顯著下降 (P<0.05)(見表4、圖3)。CD25+細胞在正常甲狀腺主要分布于甲狀腺濾泡附近,在HHD甲狀腺主要分布在淋巴濾泡的浸潤淋巴細胞上,在甲狀腺細胞密集的區(qū)域,CD25也有不同程度的表達。HHD甲狀腺CD25陽性表達明顯高于正常甲狀腺(P<0.05)(見表4、圖3)。與CG組甲狀腺Treg細胞比例(3.52±0.78)%比較,HHD甲狀腺Treg細胞比例(1.21±0.79)%明顯減低(P<0.05),而CD4+CD25+T細胞比例明顯增高(P<0.05)(見圖4、圖5)。HHD甲狀腺Treg的頻數(shù)與甲狀腺組織的炎性反應程度呈負相關(r=-0.478,P<0.01)。HHD甲狀腺中Treg的頻數(shù)與TGAb、TPOAb呈負相關(r=-0.497,-0.489,P<0.05)。HHD甲狀腺Treg與外周血IL-4無顯著相關性(r=0.297,P>0.05),與血中IL-10、TGF-β水平呈正相關(r=0.682、0.517,P<0.05)。與血中IL-2、IL-6、IFN-γ和TNF-α水平呈負相關(r=-0.476、-0.652、-0.523、-0.491,P<0.05)。

圖3 兩組甲狀腺組織中Foxp3和CD25的表達(DAB,×400)

圖4 兩組甲狀腺組織CD4+CD25+Treg流式檢測

圖5 兩組甲狀腺CD4+CD25+Foxp3+Treg流式檢測

表4 HHD組甲狀腺組織中CD25和Foxp3的表達(n)

3 討論

調節(jié)性T細胞是一組具有免疫抑制功能的T細胞亞群,CD4+CD25+Treg細胞是調節(jié)性T細胞家族中最主要的亞群,其具有免疫無能和免疫抑制作用[5]。其特征性的分子標記是Foxp3。Foxp3被認為是促進CD4+CD25+T細胞分化成熟以及維持其功能的主要調控子。動物實驗發(fā)現(xiàn)小鼠自身免疫性疾病的發(fā)生與CD4+CD25+Treg細胞有密切的關系,其體內(nèi)Treg細胞的缺乏可導致自身免疫性胃炎、腸炎和I型糖尿病等多種自身免疫性疾病產(chǎn)生,而外源性補充CD4+CD25+Treg細胞則可逆轉自身免疫性疾病的病理進程[6]。HHD是一種自身免疫性疾病,本病為自身免疫病的佐證如下:本病患者外周血及組織中輔助T細胞及其細胞因子異常,血清中抗甲狀腺抗體包括TGAb與TPOAb常明顯升高。本研究提示HHD甲狀腺內(nèi)大量活化的效應性T細胞的存在可能是其CD4+CD25+T細胞數(shù)量增加的原因,HHD甲狀腺內(nèi)Foxp3+Treg細胞數(shù)量的下降則是導致其對自身反應性T細胞調節(jié)失控的主要原因。Foxp3+Treg細胞數(shù)量的下降與甲狀腺中的免疫失衡有著密切的關系。

自身免疫性甲狀腺疾病患者存在CD4+CD25+調節(jié)性T細胞數(shù)目和功能異常[7]。黃廣英等[8]研究發(fā)現(xiàn),自身免疫性甲狀腺疾病患者甲狀腺內(nèi)CD4+CD25+調節(jié)性T細胞數(shù)目減少,Foxp3+CD4+CD25+細胞比例減少更為明顯,而活化CD4+細胞數(shù)目增加,提示自身免疫性甲狀腺疾病患者由于甲狀腺內(nèi)調節(jié)性T細胞數(shù)目減少,調節(jié)性T細胞的免疫調節(jié)功能被抑制,自身反應性T細胞活化。該研究還發(fā)現(xiàn)自身免疫性甲狀腺疾病患者甲狀腺內(nèi)CD4+CD25+調節(jié)性T細胞中凋亡細胞的比例比CD4+CD25-細胞中凋亡細胞比例明顯增多,提示患者甲狀腺內(nèi)的CD4+CD25+調節(jié)性T細胞對凋亡的易感性增加,進入凋亡過程,使得甲狀腺內(nèi)CD4+CD25+調節(jié)性T細胞數(shù)目減少,導致調節(jié)性T細胞與自身反應性T細胞活性不匹配,引發(fā)自身免疫性甲狀腺疾病。本研究利用透膜技術在CD4和CD25標記的基礎上把Foxp3作為標記,能更好地反映Treg細胞的真實水平,研究發(fā)現(xiàn):HHD組甲狀腺與CG組甲狀腺比較,CD4+CD25+Foxp3+T細胞比例明顯減低;HHD患者外周血CD4+CD25+Foxp3+的比例明顯也低于正常對照組;并且HHD甲狀腺和外周血Treg的頻數(shù)與甲狀腺組織的炎性反應程度呈負相關。說明HHD患者體內(nèi)存在免疫反應紊亂,Treg細胞參與了HHD甲狀腺病理進程。

對于甲狀腺功能亢進患者的細胞因子的研究可見少量報道[9]。本課題發(fā)現(xiàn)HHD組患者外周血IL-2、IL-6的水平與正常對照組相比明顯升高,IL-4與CG組相比明顯降低;HHD患者外周血中IL-10、TGF-β的含量也降低,同時Treg細胞占CD4+T細胞的比例與IL-10、TGF-β的含量呈正相關。Treg細胞活化后主要通過細胞接觸依賴機制或抑制性細胞因子依賴機制主動發(fā)揮免疫抑制作用,其可分泌大量的IL-10、TGF-β等抑制性細胞因子,用相應抗體中和此類細胞因子則其體內(nèi)免疫抑制作用降低,說明Treg細胞的功能可以通過這些抑制性細胞因子來實現(xiàn)[10]。這些細胞因子具有抑制抗原呈遞細胞及拮抗效應性T細胞的功能,在Treg細胞介導的免疫耐受及Treg細胞的產(chǎn)生和增殖中發(fā)揮著重要作用[11-12]。因此本研究推測可能由于HHD患者外周血中Treg細胞數(shù)量的減少,能夠發(fā)揮有效免疫抑制作用的細胞數(shù)減少,導致自身反應性T細胞激活增多,凋亡減少。同時Treg細胞減少,產(chǎn)生抑制性細胞因子的含量降低,抑制能力下降,導致激活的自身反應性T淋巴細胞增多。本研究結果表明,HHD患者血清TNF-α水平顯著高于CG組,其升高原因初步分析為:由于患者存在自身免疫功能缺陷,特別是組織免疫受到抑制,過量的TNF-α刺激單核一巨噬細胞的結果,是否還有其他因素影響,尚待進一步探討。本課題還發(fā)現(xiàn),HHD患者血清IFN-γ水平也顯著高于CG組,并與外周血和甲狀腺Treg相關,表明TNF-α、IFN-γ與HHD的細胞免疫下降有關,TNF-α、IFN-γ共同參與了HHD的發(fā)病,可以作為HHD免疫狀態(tài)的檢測指標。

為進一步證實Th1、Th2細胞因子的水平以及研究HHD患者體內(nèi)Th1、Th2與Treg之間的關系,本研究分析了CD4+CD25+Foxp3+Treg與細胞因子之間的相關性。發(fā)現(xiàn)HHD患者外周血IL-2、IL-6、IFN-γ和TNF-α的水平與CG組比較明顯升高。IL-4、TGF-β及IL-10與CG組比較明顯降低。HHD患者外周血Treg與IL-4無顯著相關性(P>0.05)。HHD患者甲狀腺和外周血Treg與血中IL-10、TGF-β水平呈正相關,與血中IL-2、IL-6、IFN-γ和TNF-α水平呈負相關。推測患者體內(nèi)降低的CD4+CD25+Foxp3+Treg不能抑制體內(nèi)的自身免疫反應,促進了Th1類細胞因子分泌,另一反面Th1類細胞因子抑制體內(nèi)效應性T細胞過度增值和活化。本研究進一步發(fā)現(xiàn),HHD甲狀腺和外周血Treg的頻數(shù)與甲狀腺組織的炎性反應程度呈負相關。說明Treg參與了HHD病理進程,與HHD發(fā)病明顯相關。另外還有研究發(fā)現(xiàn)IL-1、IL-6、IL-12、IL-18等在體外可以明顯下調Treg細胞的抑制作用[13]。因此外周血中Treg細胞對效應性T細胞抑制作用失控的原因還需進一步的研究。

HHD患者血清中TPOAb和TGAb均有不同程度的升高。甲狀腺微粒體抗體是針對甲狀腺微粒體的一種抗體,靶抗原為甲狀腺過氧化物酶,TPO是一種與膜結合的血紅素蛋白,是甲狀腺激素合成的關鍵酶,也是引起自身免疫性甲狀腺疾病的一個重要的自身抗原,其與TPO抗體(TPOAb)的免疫反應,會引起自身免疫性甲狀腺疾病患者的臨床癥狀的變化。甲狀腺球蛋白(Tg)占全部甲狀腺蛋白的75%,是由甲狀腺濾泡細胞合成的一種糖蛋白,為甲狀腺濾泡膠體及細胞內(nèi)基質的主要成分。TGAb是自身免疫性甲狀腺疾病患者血清中的一種常見自身抗體。本課題研究發(fā)現(xiàn),HHD患者血清TGAb、TPOAb與CG組比較明顯升高,為進一步證實TGAb、TPOAb的水平與Treg之間的關系,本研究分析了CD4+CD25+Foxp3+Treg與TGAb、TPOAb之間的相關性,發(fā)現(xiàn)HHD甲狀腺Treg的頻數(shù)與TGAb、 TPOAb呈負相關;HHD外周血Treg的頻數(shù)與TGAb、 TPOAb呈負相關;這可能與HHD患者細胞免疫功能低下有關,而HHD患者體液免疫功能增強有關,B細胞活化產(chǎn)生大量的自身抗體,這可能是由于Treg細胞數(shù)量減少,不能正常抑制B細胞的功能。

綜上所述,HHD 患者甲狀腺Treg細胞的數(shù)量下降,活化的自身反應性T細胞大量增加,并因此造成甲狀腺內(nèi)免疫調節(jié)失控。HHD患者甲狀腺和外周血CD4+CD25+Foxp3+T細胞明顯減少,并且與細胞因子、甲狀腺自身抗體及甲狀腺病理相關,這群調節(jié)性T細胞可能通過細胞因子和甲狀腺自身抗體參與了HHD的病理進程。