miR-181a通過NF-κB通路調控胃癌細胞系SGC-7901的凋亡及遷移

盧 強,曲曉媛,王 楓,房俊楠

(1.山東中醫(yī)藥高等?？茖W校免病教研室,山東 煙臺 264100;2.山東中醫(yī)藥高等?？茖W校口腔教研室,山東 煙臺 264100)

胃癌作為世界癌癥死亡的主要原因[1],癌癥則具有異質性。研究表明,miRNAs參與促進或抑制癌細胞的調節(jié)過程,可作為癌癥管理的生物標志物[2-3]。NF-κB信號通路是參與炎性反應和先天免疫調節(jié)的主要信號級聯(lián)反應。其也越來越被認為是癌癥發(fā)生和發(fā)展的許多步驟的關鍵參與者。異常NF-κB激活可以改變染色質景觀以支持致癌發(fā)展[4]。哺乳動物中的NF-κB轉錄因子家族包括五個成員RelA(p65)、RelB、c-Rel、NF-κB1(p105/p50)和NF-κB2(p100/p52)。小非編碼RNA(microRNA/miRNA)的功能障礙會干擾致癌或腫瘤抑制靶基因的表達,這與癌癥發(fā)病機制有關[5]。已經發(fā)表miRNA可以通過調節(jié)NF-κB信號通路而促進癌癥轉移,如miR-1910-3p[6]。通過前期工作及預實驗結果,結合相關文獻本研究提出如下假說:miR-181a通過NF-κB信號通路調控胃癌細胞生長及侵襲。相關研究在臨床病例標本及胃癌細胞層面展開,深入研究miR-181a調控胃癌細胞生長及侵襲相關的分子機制,為進一步理解胃癌的發(fā)病機制以及為胃癌的診療靶點選擇提供新的理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1納入病例標本:本研究納入濰坊醫(yī)學院附屬醫(yī)院2015年1月～2017年12月的90例胃癌患者胃部病變區(qū)標本及血液標本,所有病例標本經由病理科室HE染色確診為不同分期胃癌組織標本,排除其他相關性疾病。另納入30例癌旁組織作為對照組,經病理科室HE染色確診胃癌病變。本研究經過本院醫(yī)學倫理委員會同意。

1.2細胞培養(yǎng)及細胞轉染:本實驗中使用的胃癌細胞MKN45、SGC-7901、MGC803及BGC-823購自ATCC公司。細胞用含胎牛血清(10%)的DMEM培養(yǎng)基(Gibco,USA)在37℃、5% CO2、濕度95%的培養(yǎng)箱內進行培養(yǎng)。收集處于對數(shù)期胃癌細胞系,制成4×104個/ml細胞懸液,100 μl接種于96孔細胞培養(yǎng)板中,置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)。將SGC-7901細胞懸液進行計數(shù),接種至6孔板中;放入培養(yǎng)箱中待密度達到70%左右;將6孔培養(yǎng)板中加入800 μl的OPTI-MEM;轉染比例為每孔轉染2 μg質粒和2 μl Lipofectamine 2000,首先將二者分別溶于100 μl OPTI-MEM,室溫靜置5 min,然后將二者充分混勻,室溫靜置25 min;把兩者的混合液倒入6孔板中,放入37℃,5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h后,去除混合液,每孔加入1.5ml完全培養(yǎng)基,然后進行后續(xù)檢測。實驗分組為miR-181a高表達組(181a-up)、miR-181a高表達對照組(181a-up-control)、miR-181a低表達組(181a-down)和miR-181a低表達對照組(181a-down-control)。

1.3RT-qPCR檢測RNA水平:使用TRIzol提取總RNA。TaqMan MicroRNA逆轉錄試劑盒(美國Life Technologies)用于將總RNA逆轉錄為特定microRNA的cDNA。使用Taq Man MicroRNA檢測試劑盒(美國應用生物系統(tǒng)公司)檢測miR-181a表達水平。PCR擴增程序如下:在94℃下變性5 min,然后在94℃下變性30 s,在60℃下變性30 s,在72℃下變性40 s,共40個循環(huán)。以GAPDH為內參。見表1。

表1 miR-181a和U6定量PCR引物

1.4TUNEL法檢測SGC7901細胞凋亡:將每組胃癌細胞系SGC7901接種到24孔板(2×105個/孔)中,用PBS洗滌,用4%多聚甲醛固定30 min,然后用含有0.3%Triton X-100的PBS處理5 min以獲得通透性。隨后加入50 μl TUNEL測定溶液并在37℃下避光孵育1 h。Hoechst試劑對細胞核進行染色。PBS洗滌3次后封片并在共聚焦顯微鏡下觀察TUNEL標記陽性細胞以及Hoechst標記細胞核。

1.5劃痕實驗檢測細胞遷移能力:對于遷移能力測定,用200 μl無血清培養(yǎng)基懸浮1×105個細胞進行細胞接種。帶接種細胞融合至90%以上PBS緩沖液洗掉掉落的細胞,并用無血清基礎培養(yǎng)基培養(yǎng)。顯微鏡拍攝24 h,48 h和72 h鏡下細胞,并記錄劃痕面積(S1、S2),細胞遷移率=(S1-S2)/S1×100%,每組實驗重復3次,在顯微鏡(×100)下計數(shù)。

1.6Western印跡分析:使用RIPA緩沖液從培養(yǎng)細胞中提取總蛋白,包括PMSF蛋白酶抑制劑(碧泰生物技術,中國)和磷酸酶抑制劑(Servicebio,中國)。蛋白質濃度通過BCA蛋白質測定試劑盒(Beyotime Biotechnology,中國)測量。將10 μg總蛋白裂解物在10% SDS-PAGE(Yeasen生物技術有限公司)中電泳。用SDS-PAGE凝膠分離后,將蛋白質轉移到0.45 mm/0.22 mm聚偏二氟乙烯(Merck Millipore,Billerica,MA)上。將膜在室溫下用5%脫脂牛奶封閉2 h。除去封閉溶液,加入稀釋的一抗在4℃下過夜。然后,用TBST洗滌5次,5 min/次。然后,將膜與p-p65、總p65、p50和p150、抗Caspase3和抗Caspase9,GAPDH在4℃下過夜。隨后,使用二抗(1∶7 500,#ASO14,#AS003)將膜在室溫下孵育1 h。室溫下用TBST洗滌膜3次,5 min/次,用ECL試劑(ABclonal,中國)檢測目標蛋白。通過圖像J軟件(Ver 1.5.3)量化蛋白質條帶的強度。

2 結果

2.1miR-181a在胃癌患者中的臨床資料分析:通過RT-qPCR檢測miR-181a在胃癌組織和癌旁組織的表達水平并進行生存分析。結果表明,胃癌組織與癌旁組織比較,miR-181a高表達且差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),如圖1A。低表達的miR-181a在胃癌患者中總生存更好(P=0.020 6),如圖1B。這提示,miR-181a可能是胃癌中的癌基因。

圖1 miR-181a在胃癌組織中的表達和生存分析

2.2miR-181a抑制SGC7901癌細胞凋亡:利用TUNEL法檢測miR-181a抑制SGC7901癌細胞凋亡。Hoechst將細胞核染成藍色,TUNEL將斷裂的DNA染成綠色,如圖2A。結果顯示,與miR-181a-up組相比,miR-181a-down組細胞核染色更緊實且TUNEL熒光強度更大。miR-181a-down組細胞核染色更緊實且TUNEL熒光強度更大。對SGC7901細胞的TUNEL陽性細胞計數(shù)并計算比率,如圖2B。結果表明,miR-181a-up與miR-181a-down組與其對照組比較,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),此外,與miR-181a-up組比較,miR-181a-down組陽性率更高(P<0.05)。Western印跡實驗檢測凋亡相關蛋白質Caspase3和Caspase9并進行量化,如圖2C,結果顯示與miR-181a-up組比較,miR-181a-down組Caspase3和Caspase9的表達量更高(P<0.05)。這說明,miR-181a可以抑制SGC7901癌細胞凋亡,這將有利于癌細胞存活。

圖2A:共聚焦觀察SGC7901細胞熒光強度以及細胞形態(tài);圖2B:SGC7901細胞的TUNEL陽性細胞率。圖2C:Western印跡檢測凋亡相關蛋白質Caspase3和Caspase9

圖3A:劃痕實驗檢測出miR-181a促進SGC7901遷移;圖3B:柱形圖可視化數(shù)據(jù)表明miR-181a促進SGC7901遷移

2.3miR-181a促進SGC790遷移:本研究選取SGC-7901胃癌細胞作為工具細胞,轉染miR-181a-down和miR-181a-up質粒,并用RT-qPCR檢測不同時間段miR-181a的表達狀況,本研究使用劃痕實驗技術分析miR-181a對胃癌細胞遷移的影響。結果顯示,與對照組比較上調miR-181a后,SGC-7901細胞遷移增強,下調miR-181a后產生相反結果。此外,miR-181a-down組比miR-181a-up組遷移能力弱。

2.4miR-181a激活NF-κB信號通路:RT-qPCR結果顯示,p105、p50和p65在miR-181a-up組表達量高于miR-181a-down組,見圖4A。Western印跡實驗表明p-p65、總p65、p50和p150在miR-181a-up組表達量高于miR-181a-down組,見圖4B。

圖4A:RT-qPCR結果顯示p105、p50和p65在miR-181a-up組表達量高于miR-181a-down組;圖4B:Western印跡實驗表明p-p65、總p65、p50和p150在miR-181a-up組表達量高于miR-181a-down組

3 討論

NF-κB是最重要的細胞內核轉錄因子之一,其在受各種刺激影響的許多基因的轉錄調控中起著核心作用[7]。近年來的大量研究強調了IKK/NF-κB系統(tǒng)如何硬連線控制局部和全身代謝網絡,這些網絡塑造了機體生理學、細胞分化、能量穩(wěn)態(tài)以及從2型糖尿病和肥胖到慢性炎性反應性疾病、自身免疫和癌癥等一系列人類病理。在這個框架中,NF-κB信號傳導似乎在控制代謝適應疾病中發(fā)生的環(huán)境變化和組織穩(wěn)態(tài)破壞方面尤為重要。NF-κB已被證明可以調節(jié)miRNA的表達,反之,一些miRNA直接或間接地調節(jié)NF-κB的表達[8-10]。有研究表明,miR-181a通過抑制NF-κB途徑來阻止癌細胞侵襲和遷移,例如非小細胞肺癌[11],B細胞樣彌漫性大B細胞淋巴瘤[12]和結直腸癌[13]。

NF-κB亞基Rel是生發(fā)中心B細胞和人B細胞淋巴瘤能量代謝和生物合成途徑的主要調節(jié)因子,在某些臨床前動物模型中,用小分子Rel抑制劑治療可以有效抵消淋巴瘤發(fā)生。鑒于異常NF-κB活性在惡性和非惡性病變中的普遍作用,對NF-κB如何調節(jié)代謝的更多了解可能為開發(fā)針對各種疾病的治療靶點和診斷工具提供信息。盡管制藥行業(yè)在過去三十年中積極努力開發(fā)特異性IKK/NF-κB抑制劑,但由于阻斷IKK/NF-κB通路核心成分的藥物具有排他性的靶向毒性,因此沒有一種藥物獲得臨床批準。因此,深入表征IKK/NF-κB依賴性疾病的代謝驅動因素似乎是確定NF-κB途徑中可操作候選靶點的合乎邏輯的第一步,理想情況下規(guī)避了常規(guī)IKK/NF-κB靶向藥物的排他性毒性。

胃癌是全球癌癥死亡的主要原因并具有較高發(fā)生率[1]。NF-κB驅動的基因產物包括細胞因子/趨化因子、生長因子、抗凋亡因子、血管生成調節(jié)劑和金屬蛋白酶。NF-κB轉錄的許多基因促進胃癌發(fā)生并且NF-κB系統(tǒng)推薦用于靶向治療[14],因此明確NF-κB影響癌癥的機制將有利于患者的合理用藥。miR-181家族參與了胃癌的發(fā)生發(fā)展。miR-181a-2-3p通過靶向MYLK刺激胃癌進展[15]。miR-181a-5p-TCL1A-Akt/mTOR-c-MYC環(huán)調節(jié)胃癌自噬作為腫瘤抑制因子[16]。miR-181a通過靶向RASSF1A促進細胞增殖并抑制胃癌細胞凋亡[17]。

至今,在胃癌中尚無miR-181a對NF-κB途徑的影響,因此本研究在臨床病例標本及胃癌細胞層面展開,深入研究miR-181a通過對NF-κB通路調控胃癌細胞生長及侵襲相關的分子機制,這將為胃癌的個體化診療提供理論依據(jù)。本文先通過臨床樣本檢測miR-181a在胃癌組織中的表達以及與臨床病理參數(shù)的統(tǒng)計學意義,推測miR-181a在胃癌中是致癌還是抑癌基因。之后以胃癌細胞系SGC7901為基礎,設置miR-181a-up,miR-181a-up-control,miR-181a-down,miR-181a-down-control分組檢測miR-181a上下調對NF-κB信號通路相關基因表達水平的差異性,探討miR-181a通過NF-κB信號通路影響胃癌細胞生長、侵襲的機制,以期為胃癌的臨床治療提供新依據(jù)。結果顯示,miR-181a抑制SGC7901癌細胞凋亡并促進癌細胞侵襲。miR-181a通過提高NF-κB1和RelA的RNA水平以及p-p65、總p65、p50和p150的蛋白質水平激活NF-κB信號通路。miR-181a-NF-κB分子調控軸的闡釋為進一步理解胃癌的發(fā)病機制以及胃癌的靶向精準醫(yī)療提供了理論基礎。