維生素E 對虎龍雜交斑生長、抗氧化及免疫功能的影響

翟浩云，張 璐，蔡親曉，周智愚，殷浩然，耿麗娜，吳小易

(海南大學(xué)，南海海洋國家資源與利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南省熱帶水生生物技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南 海口 570228)

維生素E(VE)被稱為動物體內(nèi)最重要的脂溶性抗氧化劑，是維持魚類血液質(zhì)量、免疫力、毛細(xì)血管通透性、心肌健康、紅細(xì)胞膜免疫和保護(hù)白細(xì)胞功能不可缺少的營養(yǎng)物質(zhì)[1-2]。目前已確定了多種養(yǎng)殖魚類對VE的需求量(30～200 mg/kg 飼料)[3]。飼料中缺乏VE會導(dǎo)致動物白肌纖維萎縮、壞死和毛細(xì)血管滲透性增加、肌肉退化、心臟和肌肉等組織水腫、貧血、紅細(xì)胞生成障礙、褪色和肝臟蠟樣沉著等癥狀[3]。虹鱒(Oncorhynchusmykiss) 攝食低水平的VE飼料后，肌肉中微粒體比鰓、心臟或肝臟中更容易產(chǎn)生過氧化反應(yīng)，說明飼料VE的含量對微粒體過氧化程度有影響[4]。Lin 等[5]對瑪拉巴石斑魚 (Epinephelus malabaricus)研究發(fā)現(xiàn)，攝食高VE水平飼料可以提高魚血細(xì)胞數(shù)量、白細(xì)胞呼吸爆發(fā)活力、血漿溶酶體和補(bǔ)體活性。Gatlin 等[6]的研究表明，飼料VE水平升高能夠抑制飼料脂肪氧化。有研究發(fā)現(xiàn)，VE也可降低草魚(Ctenopharyngodonidella)和白姑魚(Argyrosomusregius)體內(nèi)的脂質(zhì)過氧化[7-8]。然而，飼料中添加過量的VE也會引起魚類生長性能下降等副作用，這可能是由于體內(nèi)自由基失衡和VE攝入過多起到促進(jìn)氧化作用導(dǎo)致的[9-10]。Wang 等[11]的研究表明，當(dāng)飼料中VE超過300 mg/kg 時(shí)，VE在體內(nèi)不再作為抗氧化劑，反而起到促氧化劑的作用。綜上表明，飼料中添加適量的VE可以促進(jìn)魚類健康生長。

虎龍雜交斑(E.fuscoguttatus♀×E.lanceolatus♂)是棕點(diǎn)石斑魚母本和鞍帶石斑魚父本雜交產(chǎn)生的子一代石斑魚。該魚種具有生長快速和適應(yīng)性強(qiáng)的特點(diǎn)，在全球水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中具有巨大的發(fā)展?jié)摿12]。目前，對虎龍雜交斑VE需求量的研究未見報(bào)道，因此，本實(shí)驗(yàn)通過設(shè)計(jì)不同VE水平的飼料投喂虎龍雜交斑，研究VE對虎龍雜交斑生長性能、免疫及抗氧化功能的影響，從而確定虎龍雜交斑飼料中最適的VE需求量，以期補(bǔ)充完善虎龍雜交斑營養(yǎng)需求數(shù)據(jù)庫。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及飼料配方

本實(shí)驗(yàn)飼料配方參考已有研究中的虎龍雜交斑基本營養(yǎng)信息[13-15]，以魚粉、雞肉粉和大豆分離蛋白為主要蛋白源，以魚油為主要脂肪源設(shè)計(jì)了6 組等能(340 kcal/100 g)等蛋白(占干物質(zhì)51%)等脂肪(占干物質(zhì)9%)飼料，分別添加0、35、70、105、250、500 mg/kg VE粉末(50%)，通過高效液相色譜法(HPLC)[16](沃特世2690 系統(tǒng)，美國)測得飼料VE含量分別為4.1、26.3、40.7、57.1、116.8、209.6 mg/kg。飼料配方及主要成分見表1。將所有原料用攪拌機(jī)混合均勻后放入壓條機(jī)(F-75 型雙螺旋桿擠條機(jī)，中國)壓條，制成直徑3 mm 的條狀飼料后，放入制粒機(jī)(G-500 型造粒機(jī)，中國)制粒。所有飼料在25 ℃陰干后過篩，置于-20 ℃保存。

表1 實(shí)驗(yàn)飼料配方及成分分析(干重)Tab.1 Formulations and analyzed composition of experimental diets (dry-matter basis)

1.2 生長實(shí)驗(yàn)

本實(shí)驗(yàn)所用虎龍雜交斑購買于海南省臨高縣的一個(gè)商業(yè)孵化場。生長實(shí)驗(yàn)前用商業(yè)飼料對實(shí)驗(yàn)魚馴化養(yǎng)殖13 d。實(shí)驗(yàn)魚適應(yīng)養(yǎng)殖環(huán)境后隨機(jī)放于18 個(gè)網(wǎng)箱(長130 cm×寬80 cm×高50 cm)組成的流水養(yǎng)殖系統(tǒng)中，初始重量為(14.22±0.01) g，每組飼料3 個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)12 尾魚。實(shí)驗(yàn)魚每日飽食投喂2 次(08：00 和16：30)，并記錄攝食量，實(shí)驗(yàn)周期為8 周。實(shí)驗(yàn)期間，每周清理1 次養(yǎng)殖池，測得水中溶解氧含量為5.8～6.8 mg/L，氨氮含量為0～0.2 mg/L，水溫保持在29～31 ℃。海水鹽度為33.1。

1.3 銅脅迫實(shí)驗(yàn)

生長實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，每組各取7 尾實(shí)驗(yàn)魚進(jìn)行72 h 銅脅迫實(shí)驗(yàn)，以五水硫酸銅為銅源，銅離子濃度為3.5 mg/L，實(shí)驗(yàn)期間密切觀察魚的活動狀態(tài)，及時(shí)記錄死亡情況并清理死魚。

1.4 樣品采集

生長實(shí)驗(yàn)開始前，從暫養(yǎng)魚中取10 尾與實(shí)驗(yàn)魚規(guī)格相同的魚作為初始魚樣本并于-20 ℃儲存，供后續(xù)分析相關(guān)指標(biāo)。生長實(shí)驗(yàn)期間每周進(jìn)行一次稱重并記錄實(shí)驗(yàn)魚生長情況。生長實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，將實(shí)驗(yàn)魚饑餓24 h，統(tǒng)計(jì)每個(gè)網(wǎng)箱實(shí)驗(yàn)魚存活尾數(shù)、總重以及投喂的飼料總重，計(jì)算存活率、增重率和飼料系數(shù)。取樣前用MS-222 將魚麻醉，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組中隨機(jī)取2 尾魚于-20 ℃保存，用于全魚組成分析，另取3 尾魚分別記錄其體重和體長，用肝素鈉浸潤的1 mL 針管尾靜脈取血，在4 ℃，3 000 r/min 下離心15 min，吸取上清液血清，-80 ℃保存?zhèn)溆?。后采集肌肉、腹腔脂肪、肝臟、腸道稱重并記錄，用于計(jì)算肝體比(HSI)、腸系膜脂肪體比(IPF)、肥滿度(CF)等指標(biāo)，解剖時(shí)取頭腎、肝臟和肌肉等樣品用于組分分析和分子生物學(xué)分析，所有樣品采集并稱重記錄后置于液氮罐中暫存，后置于-80 ℃儲存。銅脅迫實(shí)驗(yàn)后，統(tǒng)計(jì)各組實(shí)驗(yàn)魚存活情況，計(jì)算存活率，每組各取3 尾魚，采集頭腎用于分子生物學(xué)分析。本研究獲得了海南大學(xué)動物倫理委員會批準(zhǔn)（批準(zhǔn)文號：HNUAUCC-2021-00032），實(shí)驗(yàn)過程中操作人員嚴(yán)格遵守海南大學(xué)動物倫理規(guī)范，并按照海南大學(xué)動物倫理委員會制定的規(guī)章制度執(zhí)行。

1.5 生長指標(biāo)計(jì)算

增重率(WG，%)=(末均重-初始均重)/ 初始均重×100%

飼料轉(zhuǎn)化率(FCR)=攝食量(g)/ 增重(g)

肝體比(HSI，%)=肝臟重(g)/魚重(g) × 100%

腸系膜脂肪體比(IPF，%)=腸系膜脂肪重(g)/體重 (g) ×100%

肥滿度(CF，%)=體重 (g)/ [體長 (cm)]3×100%

1.6 樣品測定與分析

用杜馬斯燃燒法快速定氮儀(Elementar,德國)測定全魚和肌肉的粗蛋白含量，用全自動脂肪儀(ANKOMx715 自動脂肪儀，美國)測定全魚和肌肉的粗脂肪含量。肌肉樣品在烘箱中 125 ℃烘干3 h，全魚樣品在烘箱中125 ℃烘干24 h，按照減重法計(jì)算水分含量。

用Elisa 試劑盒測定血清溶菌酶和血清免疫球蛋白(CUSABIO，武漢華美生物工程有限公司)，肝臟和肌肉VE含量(AMEKO，上海聯(lián)碩生物科技有限公司)與總抗氧化能力(SAB，美國)。

1.7 總RNA 的提取與反轉(zhuǎn)錄

從-80 ℃冰箱中取出肝臟和頭腎樣品，使用TRIzol 試劑(Invitrogen，美國)提取總RNA。提取完成后用1.0%變性瓊脂糖凝膠進(jìn)行質(zhì)量測定，看是否有雜條帶產(chǎn)生，確認(rèn)無污染后用儀器Nano-Drop?ND-1000(Thermo Fisher Scientific，美國)進(jìn)行濃度測定。通過Prime ScriptTM RT reagen Kit with gDNA Eraser (TaKaRa,日本)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄建立cDNA 文庫。具體方法參照He 等[17]。

1.8 實(shí)時(shí)熒光定量PCR (qRT-PCR)分析

在定量熱循環(huán)儀RT-PCR(QuantStudio 6 Fle,Applied Biosystem,新加坡)中進(jìn)行qRT-PCR 分析。實(shí)驗(yàn)反應(yīng)總體系和程序參考He 等[17]。根據(jù)已發(fā)表的相關(guān)魚類目的基因序列，采用Primer premier 5.0 軟件設(shè)計(jì)tor、s6k1、nrf2 和keap1 的PCR 引物對(表2)。在每次PCR 反應(yīng)結(jié)束時(shí)，對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行熔解曲線分析，以確認(rèn)這些反應(yīng)中存在單一PCR 產(chǎn)物。將cDNA 樣品用5 種不同稀釋倍數(shù)(3 個(gè)重復(fù))制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，并根據(jù)公式分析擴(kuò)增效率：E=10(-1/slope)-1。采用 Livak 描述的2-△△CT方法計(jì)算目的基因的表達(dá)水平[18-19]。

表2 實(shí)時(shí)熒光定量基因表達(dá)引物序列Tab.2 Primers used for qRT-PCR

1.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

由于單因素方差分析(One-Way ANOVA)難以對營養(yǎng)素需求量實(shí)驗(yàn)中得到的定量數(shù)據(jù)進(jìn)行準(zhǔn)確地統(tǒng)計(jì)分析[3]，因此，本研究采用折線模型[19-20]來模擬和分析各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)指標(biāo)，以增重率(WG)和總抗氧化能力(T-AOC)為評價(jià)指標(biāo)分別計(jì)算實(shí)驗(yàn)魚飼料中維生素E 的最適需求量。

2 結(jié)果

2.1 生長性能、形態(tài)學(xué)和飼料利用

養(yǎng)殖8 周后，不同VE水平飼料對實(shí)驗(yàn)魚增重率有顯著影響，攝食57.1 mg/kg VE飼料的實(shí)驗(yàn)組增重率顯著高于攝食4.1 mg/kg VE飼料的實(shí)驗(yàn)組(P<0.05)(表3)。各組實(shí)驗(yàn)魚的HSI、IPF、CF和FCR 均無顯著差異(P>0.05)。以WG 為評價(jià)指標(biāo)，經(jīng)二次折線模型分析得出在本實(shí)驗(yàn)條件下虎龍雜交斑飼料中最適VE水平為62.92 mg/kg(圖1)。

圖1 飼料維生素E 水平與虎龍雜交斑增重率的關(guān)系Fig.1 Relationship of WG of hybrid grouper juveniles with different dietary VE levels

表3 飼料維生素E 水平對虎龍雜交斑生長性能和飼料利用的影響Tab.3 Effects of dietary VE levels on growth performance and feed utilization of hybrid grouper juveniles

2.2 全魚和肌肉組成分析

不同VE水平飼料對虎龍雜交斑全魚、肌肉的水分、粗蛋白和粗脂肪含量均無顯著影響(P>0.05)(表4)。

表4 飼料維生素E 水平對虎龍雜交斑全魚和肌肉組成的影響(濕重)Tab.4 Effects of dietary VE levels on whole-body and white muscle compositions of hybrid grouper juveniles(fresh weight base) %

2.3 肝臟總抗氧化能力(T-AOC) 和組織VE 含量

肝臟T-AOC 和VE含量均受飼料VE水平影響 (P<0.05)，攝食57.1 mg/kg VE飼料實(shí)驗(yàn)組魚TAOC 高于攝食4.1 mg/kg VE飼料。攝食4.1 mg/kg VE飼料實(shí)驗(yàn)魚肝臟VE含量低于攝食209.6 mg/kg VE飼料實(shí)驗(yàn)魚。各組實(shí)驗(yàn)魚肌肉VE含量之間無顯著差異。以T-AOC 為評價(jià)指標(biāo)，經(jīng)二次折線模型分析得出在本實(shí)驗(yàn)條件下虎龍雜交斑飼料中最適VE水平為86.25 mg/kg(圖2)。

圖2 飼料維生素E 水平對虎龍雜交斑肝臟總抗氧化能力的影響Fig.2 Effects of dietary VE levels on T-AOC of liver of hybrid grouper juveniles

2.4 血清免疫指標(biāo)

各組實(shí)驗(yàn)魚血清免疫指標(biāo)結(jié)果表示，攝食57.1 mg/kg VE飼料實(shí)驗(yàn)魚血清溶菌酶(LZM)濃度高于攝食4.1 mg/kg VE飼料實(shí)驗(yàn)魚，其血清免疫球蛋白(IgM)濃度也高于攝食4.1 和209.3 mg/kg VE飼料，LZM 和IgM 濃度都呈先升高后降低的趨勢(P<0.05)(表5)。

表5 飼料維生素E 水平對虎龍雜交斑幼魚血清溶菌酶(LZM)，免疫球蛋白(IgM)，肝臟總抗氧化能力(T-AOC)和肝臟肌肉維生素E 含量的影響Tab.5 Effects of dietary VE levels on serum LZM,IgM,T-AOC of liver and liver vitamin E concentration of hybrid grouper juveniles

2.5 銅脅迫存活率

在銅脅迫72 h 后，各實(shí)驗(yàn)組魚存活率結(jié)果顯示，攝食4.1 mg/kg VE飼料實(shí)驗(yàn)魚存活率低于攝食40.7、57.1、和116.8 mg/kg VE飼料實(shí)驗(yàn)魚(P<0.05)(圖3)。

圖3 飼料維生素E 水平對虎龍雜交斑銅脅迫72 h 存活率的影響Fig.3 Effects of dietary VE levels on Cu2+ challenge survival of hybrid grouper for 72 h

2.6 肝臟tor、s6k1 基因和頭腎nrf2、keap1基因表達(dá)

在銅脅迫后，攝食40.7 mg/kg VE飼料實(shí)驗(yàn)魚頭腎nrf2 基因相對表達(dá)量高于攝食4.1、26.3 和116.8 mg/kg VE飼料實(shí)驗(yàn)魚(表6)。經(jīng)二次折線模型分析，飼料VE水平對肝臟s6k1 基因和頭腎keap1 基因相對表達(dá)量有顯著影響(P<0.05) (圖4)。

圖4 飼料維生素E 水平對虎龍雜交斑頭腎 keap1(a)和肝臟 s6k1(b)基因相對表達(dá)量的影響Fig.4 Effects of dietary VE levels on relative expression of head kidney keap1 (a) and liver s6k1 (b) of hybrid grouper

表6 飼料維生素E 水平對虎龍雜交斑幼魚肝臟s6k1、 tor 和頭腎keap1、 nrf2 基因相對表達(dá)量的影響Tab.6 Effects of dietary vitamin E levels on relative expression of hepatic s6k1,tor and head kidney keap1,nrf2 of hybrid grouper juveniles

3 討論

3.1 飼料維生素E 含量對虎龍雜交斑生長性能和飼料利用的影響

VE是魚類生長發(fā)育和維持自身健康的必需營養(yǎng)素，魚類自身不能合成VE，必須從外界攝取。VE可以保護(hù)細(xì)胞免受活性氧和其他自由活性集團(tuán)的損害，從而避免了膜磷脂中不飽和脂肪酸和關(guān)鍵蛋白質(zhì)被氧化[3]。飼料中VE的缺乏和過量均會導(dǎo)致生長緩慢，這可能是由于魚體內(nèi)累積過多的脂質(zhì)過氧化物造成的。因?yàn)橹|(zhì)過氧化特別是多不飽和脂肪酸的氧化會導(dǎo)致動物機(jī)體損傷嚴(yán)重。攝入過多的VE還會影響其他脂溶性維生素的吸收[21-24]。在本實(shí)驗(yàn)中，當(dāng)飼料中添加57.1 mg/kg VE時(shí)，實(shí)驗(yàn)魚生長速率顯著高于攝食4.1 mg/kg VE飼料的實(shí)驗(yàn)魚，這表明飼料中添加適量的VE可以提高虎龍雜交斑的生長性能；但隨著VE水平的持續(xù)升高，虎龍雜交斑的WG 較適宜添加水平有所下降。

本研究中，飼料VE水平對飼料轉(zhuǎn)化率(FCR)無顯著影響，這與前人在白姑魚[7]和日本鰻鱺(Anguillajaponica)[25]中報(bào)道的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相同。但也有研究發(fā)現(xiàn)，飼料VE水平會顯著影響飼料效率[26]，但這種影響僅發(fā)生在一定的VE添加量范圍內(nèi)，不是嚴(yán)格意義上的劑量依賴性改變[27]。即飼料VE水平對飼料效率的影響也會因不同品種而產(chǎn)生變化。WG 是水生動物營養(yǎng)研究中最常用的評價(jià)指標(biāo)[3]，可以直接體現(xiàn)飼料對魚類生長性能的影響。經(jīng)二次折線模型分析，本實(shí)驗(yàn)條件下虎龍雜交斑幼魚飼料中最適VE水平為62.92 mg/kg，這與在瑪拉巴石斑魚[5]研究中的到的結(jié)果(61～68 mg/kg)相似。為減少用單一評價(jià)指標(biāo)的局限性，考慮到VE在體內(nèi)最主要的抗氧化作用，我們選擇了總抗氧化能力(T-AOC)作為第二種評價(jià)指標(biāo)來確定虎龍雜交斑飼料VE的最適水平。

3.2 飼料維生素E 含量對虎龍雜交斑體組成的影響

VE作為動物體內(nèi)重要的脂溶性抗氧化物質(zhì)，可以改善肉質(zhì)，增加風(fēng)味，減緩脂肪酸分解[28]。在施氏鱘(Acipenserschrendkii)[29]和眼斑擬石首魚(Sciaenopsocellatus)[30]中，缺乏VE會導(dǎo)致肌肉營養(yǎng)不良和蛋白質(zhì)含量下降。本實(shí)驗(yàn)中也得到了同樣的結(jié)果，即隨飼料中VE水平增加，肌肉粗蛋白含量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，表明飼料VE水平會影響虎龍雜交斑肌肉蛋白沉積。有研究認(rèn)為，VE不足導(dǎo)致的肌肉蛋白沉積的下降主要是由于其蛋白質(zhì)分解增強(qiáng)，且這一變化和胰島素降低及皮質(zhì)醇升高緊密相關(guān)[31]。胰島素能刺激靶細(xì)胞的葡萄糖氧化以及糖原、ATP 脂肪、蛋白質(zhì)的合成，并同時(shí)抑制蛋白質(zhì)的分解[32]。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，VE缺乏會使虎龍雜交斑肝臟s6k1 基因表達(dá)顯著降低，這可能也是由于VE缺乏引起的胰島素降低，進(jìn)而造成s6k1 基因未被誘導(dǎo)表達(dá)，最終影響蛋白質(zhì)的合成。但是作為蛋白質(zhì)合成途徑中的另一個(gè)關(guān)鍵因子tor，其在虎龍雜交斑肝臟中的表達(dá)并未受到飼料VE水平的影響，一般來說，s6k1 作為受mTOR 調(diào)控的下游基因，s6k1 的表達(dá)受tor的調(diào)控，tor的表達(dá)會上調(diào)s6k1的表達(dá)[33-34]，而本實(shí)驗(yàn)中未得到該結(jié)果。肌肉脂肪隨著飼料VE水平增加呈先升后降，116.8 mg/kg VE飼料組肌肉脂肪含量最少，類似的結(jié)果同樣出現(xiàn)在施氏鱘[29]和花鱸(Lateolabraxjaponicus)[35]的研究中，脂肪含量的上升可能會在一定程度上增加脂質(zhì)過氧化程度，從而導(dǎo)致魚肉在保存過程中出現(xiàn)滴水損失增加和酸敗[28]。上述結(jié)果證明，飼料中添加適量的VE可以增加肌肉蛋白含量，減少脂肪含量，能在一定程度上提高魚肉品質(zhì)。

3.3 飼料維生素E 含量對虎龍雜交斑肝臟、肌肉維生素E 含量的影響

組織中維生素E 含量是評價(jià)維生素E 需求量的重要指標(biāo)。有實(shí)驗(yàn)表明飼料中添加110 mg/kg VE可以使大菱鲆(Scophthalmusmaximus)幼魚、庸鰈(Hippoglossushippoglossus)和金頭鯛 (Sparus aurata)肝臟VE含量顯著增加[36]，周立斌等[35]對花鱸的研究同樣發(fā)現(xiàn)肝組織內(nèi)VE蓄積量是隨著飼料中VE添加水平的升高而增加。本研究也得到類似的研究結(jié)果，即209.3 mg/kg VE組虎龍雜交斑肝臟VE含量顯著高于4.1 mg/kg VE組，且肌肉VE含量隨飼料VE水平增加而升高，這與在瑪拉巴石斑魚中報(bào)道的相似[11]。

本研究中，肌肉VE含量少于肝臟，這可能是由于肝臟是VE的主要代謝器官[37]，且肝臟脂肪含量比肌肉高，也可能是增加脂溶性VE沉積的原因。在吉富羅非魚(OreochromisniloticusGIFT)[38]、大菱鲆[39]和胭脂魚(Myxocyprinusasitius)[40]的研究中也有相似的結(jié)論。飼料VE水平升高會使虎龍雜交斑肌肉VE含量持續(xù)上升。VE在肌肉中的累積不僅能提高魚肉品質(zhì)，還可以緩解鮮肉失色、脂質(zhì)氧化和異味形成[28]，攝食適宜水平VE飼料可有效延長水產(chǎn)動物肌肉的貨架壽命[41]。

3.4 飼料維生素E 含量對抗氧化和免疫指標(biāo)的影響

VE是水產(chǎn)飼料中一種常用的強(qiáng)效抗氧化劑，根據(jù)飼料脂肪水平的不同，VE的最適添加量也會發(fā)生變化。當(dāng)飼料中VE水平為 61～115 mg/kg 時(shí)，可優(yōu)化生長性能并最大限度地減少氧化應(yīng)激[5,42]。T-AOC 的水平可以體現(xiàn)動物機(jī)體的總抗氧化能力，包括抗氧化酶系統(tǒng)和非酶促系統(tǒng)[43]。本實(shí)驗(yàn)中，57.1 mg/kg VE飼料組肝臟T-AOC 顯著高于4.1 mg/kg VE飼料組。但隨著飼料VE水平增加，肝臟T-AOC 呈下降趨勢，與在胭脂魚中觀察到的現(xiàn)象一致[40]。這可能是由于攝入過多的VE導(dǎo)致其在體內(nèi)不再起到抗氧化作用，反而會促進(jìn)氧化[10,23]，或是由于過多的VE抑制了抗氧化酶的活性，從而導(dǎo)致肝臟T-AOC 下降[40]，但其機(jī)制尚不完全明確。

頭腎作為魚類重要的免疫及抗氧化器官，在遭受氧化損傷時(shí)，其正常功能會受到影響，有報(bào)道指出，可通過增加抗氧化酶的活性來減弱這種氧化損傷[44]，Nrf2-Keap1 信號通路已被證明是抗氧化應(yīng)激最重要的內(nèi)源性信號通路，可調(diào)控多種抗氧化酶基因的表達(dá)[45]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，飼料VE水平對keap1 基因的表達(dá)有顯著影響，即當(dāng)飼料VE含量超過23.05 mg/kg 時(shí)，keap1 基因表達(dá)較之前有顯著提升，這與在多鱗鱚(Sillagosihama)[46]中結(jié)果相似。keap1 是Keap1-Nrf2 信號通路的主調(diào)節(jié)器，可根據(jù)細(xì)胞內(nèi)的氧化還原狀態(tài)打開或者關(guān)閉Keap1-Nrf2 通路[47]。正常生理?xiàng)l件下，KEAP1與NRF2 在胞漿內(nèi)結(jié)合，主導(dǎo)NRF2 的降解，使之維持在正常水平，抑制下游基因表達(dá)。當(dāng)細(xì)胞受到刺激后，NRF2 脫離KEAP1 進(jìn)入細(xì)胞核，啟動下游基因表達(dá)，提高抗應(yīng)激及抗氧化能力。在銅脅迫72 h 后，攝食40.7 mg/kg VE飼料實(shí)驗(yàn)魚頭腎nrf2 基因相對表達(dá)量顯著高于攝食4.1、26.3和209.3 mg/kg VE飼料實(shí)驗(yàn)魚，keap1 基因的表達(dá)量也呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。銅脅迫后建鯉(Cyprinuscarpiovar.Jian)腦細(xì)胞核中NRF2 增加，會誘導(dǎo)下游抗氧化元件(CuZn-SOD 等)的表達(dá)[48]，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。說明在銅脅迫下，飼料中添加適量的VE可上調(diào)nrf2 基因表達(dá)，增加細(xì)胞的抗氧化應(yīng)激能力。keap1 的表達(dá)會增加NRF2 的降解，避免了由于NRF2 持續(xù)積累導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡和自由基損傷[49]。有研究證明氧化壓力增加會導(dǎo)致歐洲鰻鱺細(xì)胞nrf2 和keap1 轉(zhuǎn)錄上調(diào)，在相同促氧化劑的作用下會造成相似的表達(dá)趨勢[50]。上述結(jié)果表明，飼料中VE缺乏或過量都會抑制抗氧化基因的表達(dá)，當(dāng)飼料中添加適量的VE可以有效提高虎龍雜交斑雜交的機(jī)體抗氧化能力。

免疫球蛋白(IgM)在先天免疫和適應(yīng)性免疫中起著識別和清除潛在病原體的重要作用。本實(shí)驗(yàn)顯示飼料VE含量在57.1 mg/kg 時(shí)虎龍雜交斑血清IgM 濃度顯著高于4.1 mg/kg VE飼料組和209.3 mg/kg VE飼料組。有研究表明，飼料中添加適量VE增加了草魚[51]鰓中的IgM 活性和多鱗鱚[47]肝臟IgM 活性，然而在黃顙魚(Pelteobagrusfulvidraco)[52]中并未觀察到相同情況。溶菌酶(LZM)是魚類重要的非特異性免疫酶[53]，飼料中添加適量的VE會增加軍曹魚(Rachycentroncanadum)[54]、瑪拉巴石斑魚[5]和黃顙魚[52]的LZM 活性。在本實(shí)驗(yàn)中，57.1 mg/kg VE飼料組虎龍雜交斑血清LZM 的濃度高于4.1 mg/kg VE飼料組，這說明當(dāng)飼料中添加適量的VE時(shí)可增強(qiáng)虎龍雜交斑的非特異性免疫能力。VE可以促進(jìn)免疫，這在本次銅脅迫實(shí)驗(yàn)中也得到了進(jìn)一步驗(yàn)證。銅脅迫后，4.1 mg/kg VE飼料組存活率顯著低于40.7、57.1 和116.8 mg/kg VE飼料組。盡管VE對非特異性免疫的作用機(jī)制尚不清楚，但據(jù)報(bào)道，VE可能與白細(xì)胞介素(IL)-2 一樣影響基因表達(dá)[55]，調(diào)節(jié)包括核因子kB(NF-kB)信號傳導(dǎo)在內(nèi)的信號傳遞[56]，并可能通過細(xì)胞免疫反應(yīng)間接影響體液免疫[57]。

4 結(jié)論

綜上所述，在本實(shí)驗(yàn)條件下，以WG 和TAOC 為評價(jià)指標(biāo)得出虎龍雜交斑飼料VE最適水平分別為62.92 mg/kg 飼料和86.25 mg/kg 飼料，飼料中添加適量的VE可提高虎龍雜交斑生長性能、抗氧化和免疫能力。

（作者聲明本文無實(shí)際或潛在的利益沖突）