紫海膽不同家系早期發(fā)育、變態(tài)、生長和腸道微生物的比較

鐘幼平，酆 偉，張麗莉，黃世玉，王國棟*

(1.集美大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，福建 廈門 361021；2.集美大學(xué)，農(nóng)村農(nóng)業(yè)部東海海水健康養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 廈門 361021)

紫海膽(Heliocidaris crassispina)隸屬棘皮動(dòng)物門(Echinodermata)海膽綱(Echinoidea)拱齒目(Camarodonta)長海膽科(Echinometridae)，其性腺味道鮮美，具有較高的營養(yǎng)價(jià)值與藥用價(jià)值，是我國南方海域最重要的經(jīng)濟(jì)海膽之一[1]。我國海膽?zhàn)B殖種類主要為中間球海膽(Strongylocentrotus intermedius)，與之相比，紫海膽具有耐高溫、育苗周期短等優(yōu)勢[2]。

近年來，紫海膽人工育苗技術(shù)日臻完善；但依舊采用野生紫海膽作為親本，培育的幼體、稚膽和幼膽等生產(chǎn)性狀參差不齊。紫海膽的育苗和養(yǎng)殖處于野生種馴養(yǎng)階段，提供了考察人工育苗環(huán)境對(duì)野生種遺傳影響的絕好機(jī)會(huì)[3-4]。家系選擇是水產(chǎn)動(dòng)物選育新品種的重要手段之一[5]。我國的海膽優(yōu)良品種——中間球海膽“大金”即采用群體選育輔以家系選育技術(shù)，經(jīng)連續(xù)4 代選育而成[6]。因此，本實(shí)驗(yàn)探究了不同家系在人工育苗環(huán)境中早期發(fā)育和變態(tài)情況。海膽缺少長距離運(yùn)動(dòng)的能力，只能在幾平米范圍內(nèi)索餌[7]。自然環(huán)境中的海膽其主要餌料大型藻在時(shí)間和空間上分布極不均衡，人工養(yǎng)殖則能穩(wěn)定供應(yīng)餌料。海膽本身消化大型藻能力有限，腸道微生物在海膽消化和吸收中具有重要作用[8]。動(dòng)物由野生馴養(yǎng)為人工養(yǎng)殖的過程中其腸道微生物會(huì)發(fā)生顯著變化，在哺乳類和爬行類中已有大量例證[9]。因此，本實(shí)驗(yàn)同時(shí)考察了各家系紫海膽在人工養(yǎng)殖條件下生長、腸道微生物和性腺發(fā)育情況?？傊?，考察不同家系紫海膽在育苗和養(yǎng)殖環(huán)境中早期發(fā)育、變態(tài)、生長和腸道微生物組成等性狀差異，能夠?yàn)樽虾Ｄ懥挤N選育提供基礎(chǔ)資料，避免非必要的試錯(cuò)。

1 材料與方法

1.1 紫海膽親本獲取

實(shí)驗(yàn)所用的紫海膽親本采捕于福建省福州市連江海域，在近海網(wǎng)箱內(nèi)暫養(yǎng)，每日飽食性投喂江 蘺 (Gracilaria verrucosa)、海 帶 (Laminaria japonica)等大型藻類。

1.2 構(gòu)建家系

在親本圍口膜處注射1～2 mL 濃度為0.5 mol/L 的KCl 進(jìn)行催產(chǎn)。根據(jù)精子呈煙霧狀、卵子呈顆粒狀的特點(diǎn)，結(jié)合鏡檢區(qū)分精子與卵子。選取9 對(duì)海膽作為親本，做雌雄一對(duì)一受精組合，建立9 個(gè)全同胞家系，編號(hào)1～9。每個(gè)家系親本的海膽殼徑約為7 cm，雌性產(chǎn)卵量200～300 萬枚。將受精卵放入500 L 孵化桶中，每個(gè)家系單獨(dú)一個(gè)孵化桶。在授精前，取每個(gè)家系雌性個(gè)體的20～30 萬枚卵子混合后，與雄性的混合精子授精，構(gòu)建一個(gè)常規(guī)的混合群體作為對(duì)照，編號(hào)0。孵化后各家系及混合群體分別在4 m×1 m×1 m 育苗池中單獨(dú)培育。

1.3 幼體培養(yǎng)

受精卵在孵化過程中微充氣且每隔1 h 用耙攪動(dòng)1 次水體。每個(gè)育苗池預(yù)先加入1 t 的超濾海水(0.01 μm 過濾膜過濾)，在育苗池的前、中、后端各放2 個(gè)氣石。將孵化桶中的棱狀幼體通過虹吸的方式移入育苗池。此后育苗池繼續(xù)注入超濾海水至水深50 cm 處。棱柱幼體階段微充氣，隨幼體的發(fā)育逐漸增加充氣量。浮游幼體培養(yǎng)過程中前3 天，育苗池每天加400 L 的超濾海水。第4 天開始，每天換水400 L。二腕幼體階段開始投喂角毛藻(Chaetoceros)，日常投餌分為3～4 次投喂，分別是早上6 點(diǎn)，中午12 點(diǎn)，下午6 點(diǎn)，晚上根據(jù)幼體胃內(nèi)含物情況進(jìn)行適當(dāng)補(bǔ)喂。四腕、六腕和八腕幼體期投餌量分別為2×104、3×104和4×104～5×104個(gè)/mL 細(xì)胞。待幼體發(fā)育至六腕幼體，每2 天用吸污泵對(duì)育苗池底部吸污。每個(gè)器具使用前使用淡水浸泡清洗，避免家系間污染。

1.4 指標(biāo)測量、計(jì)算及數(shù)據(jù)處理

受精率與孵化率 卵子受精15 min 后，充分?jǐn)噭?dòng)水體從孵化桶中隨機(jī)取100 mL 受精卵。再從100 mL 受精卵中取50 μL 統(tǒng)計(jì)發(fā)生卵裂的受精卵個(gè)數(shù)。重復(fù)取樣3 次，計(jì)算受精率：受精率(%)=(受精卵數(shù)/總卵數(shù))×100%。受精后24 h，受精卵全部發(fā)育至四腕幼體，視為孵化成功。同計(jì)算受精率的取樣方法取樣，按照公式：

孵化率(%)=(四腕幼體/受精卵數(shù))×100%，計(jì)算孵化率。

浮游幼體生長發(fā)育 通過顯微鏡觀察，確定各家系幼體發(fā)育階段，記錄各家系浮游幼體發(fā)育所需時(shí)間。在育苗池前、中、后3 個(gè)位置，使用100 mL 燒杯在水體的上層、中層、底層各取100 mL，倒入1 L 燒杯中。將燒杯中的水體充分?jǐn)噭?dòng)后，隨機(jī)取出50 mL 統(tǒng)計(jì)幼體的數(shù)量。重復(fù)取樣3 次統(tǒng)計(jì)幼體數(shù)量，取平均值計(jì)算各發(fā)育階段育苗池內(nèi)幼體的數(shù)量。不同段幼體的存活率計(jì)算公式：

早期幼體的存活率(%)=(六腕幼體時(shí)期的數(shù)量/四腕幼體時(shí)期的數(shù)量)×100%，晚期幼體的存活率(%)=(八腕幼體時(shí)期的數(shù)量/六腕幼體時(shí)期的數(shù)量)×100%。

變態(tài)率與稚膽開口率 隨機(jī)選取30 個(gè)八腕幼體，移入2 L 燒杯中。燒杯底部放有10 cm2附有底棲硅藻(Bacillariophyceae)的PVC 波紋板進(jìn)行變態(tài)率測算，每個(gè)家系設(shè)置4 個(gè)重復(fù)。在全部幼體完成變態(tài)前，每日投喂角毛藻。每個(gè)燒杯的角毛藻密度保持在4×104～5×104個(gè)/mL 范圍內(nèi)，每日換水300 mL。當(dāng)幼體的腕全部脫落，長出幼棘，體呈半球形，視為完成變態(tài)。根據(jù)公式：變態(tài)率(%)=(稚膽數(shù)/八腕幼體數(shù))×100%，計(jì)算變態(tài)率。變態(tài)7 d 后，以塑料薄膜上的底棲硅藻被啃食，幼膽殼徑變大，作為幼膽開口的標(biāo)志。通過下面計(jì)算公式計(jì)算幼膽開口率：

幼膽開口率(%)=(開口幼膽數(shù)/變態(tài)幼膽數(shù))×100%

幼膽生長率 從1、2、3、5、7 號(hào)家系中分別隨機(jī)選出30 個(gè)殼徑在0.55～0.60 cm 范圍內(nèi)的幼膽，移入對(duì)應(yīng)編號(hào)的80 目小網(wǎng)箱中飼養(yǎng)。每天投喂足量的海帶，7 d 清理一次糞便。每個(gè)家系設(shè)置4 個(gè)重復(fù)，記錄每個(gè)網(wǎng)箱內(nèi)幼膽的殼徑，作為初始?xì)?；在分別飼養(yǎng)20、40 d 再次測量殼徑，比較各家系間的差異，計(jì)算各家系的生長率：

生長率(%)=(殼徑增長值/初始?xì)?×100%

上述各指標(biāo)數(shù)據(jù)經(jīng)方差齊性檢驗(yàn)后進(jìn)行單因素方差分析，若存在顯著性差異再經(jīng)Duncan 多重比較大小。以P<0.05 為顯著性差異，所有數(shù)據(jù)均用平均值呈現(xiàn)。

1.5 家系微生物多樣性分析

幼膽樣品取樣 每個(gè)家系隨機(jī)挑選出120只殼徑為1.0～1.2 cm 的幼膽。每個(gè)家系設(shè)置1 個(gè)實(shí)驗(yàn)組，1 個(gè)對(duì)照組，每組3 個(gè)生物學(xué)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)放置20 只幼膽，放置在3 L 容器中飼養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行72 h 饑餓處理，對(duì)照組正常投喂江蘺，飼養(yǎng)72 h。隨后每組取15 只大小相近的幼膽的腸道，分別裝入3 個(gè)凍存管，每個(gè)凍存管放5 只幼膽的腸道，放入液氮速凍。

建庫測序和數(shù)據(jù)預(yù)處理 根據(jù)Magen DNA 試劑盒的操作手冊(cè)，提取樣品總DNA，根據(jù)樣品總DNA 的保守區(qū)設(shè)計(jì)引物。在引物末端加上測序接頭，進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，對(duì)PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化、定量和均一化建立測序文庫。符合測序要求的文庫用Illumina Novaseq 6 000 進(jìn)行測序，得到的原生圖像數(shù)據(jù)文件。經(jīng)堿基識(shí)別(base calling)分析將原生圖像數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化為原始測序序列(sequenced reads)。通 過Trimmomaticv0.33 軟 件，對(duì)原生測序序列進(jìn)行篩選，得到的clean reads 即為待分析的數(shù)據(jù)。使用Usearchv10 軟件進(jìn)行拼接，拼接后數(shù)據(jù)進(jìn)行長度過濾。通過UCHIMEv4.2 軟件，得到最終有效數(shù)據(jù)(effective reads)。上述實(shí)驗(yàn)過程由百邁客生物科技有限公司完成。

數(shù)據(jù)分析 通過統(tǒng)計(jì)原始測序序列(raw reads)、effective reads、Q30 對(duì)測序數(shù)據(jù)質(zhì)量進(jìn)行評(píng)估，利用稀釋性曲線(Rarefaction Curve)判斷測序量是否覆蓋所有類群，樣本量是否充分。使用Usearch 軟件對(duì)Reads 在97.0%的相似度水平下進(jìn)行聚類、獲得OUT，分析樣品間差異。使用QIIME2 軟件，對(duì)樣品Alpha 多樣性指數(shù)進(jìn)行評(píng)估，再通過t檢驗(yàn)對(duì)不同處理間的Alpha 多樣性指數(shù)進(jìn)行差異評(píng)估。以SILVA 為參考數(shù)據(jù)庫使用樸素貝葉斯分類器對(duì)特征序列進(jìn)行分類學(xué)注釋，通過物種分布柱狀圖展示樣品間差異，用QIIME 軟件繪制UPGMA 聚類樹與柱狀圖結(jié)合繪圖。

2 結(jié)果

2.1 受精率與孵化率

家系1～9 在受精卵率上無顯著性差異，受精率均在95%以上。如圖1-a 所示，各家系的孵化率存在差異(P<0.05)?；旌先后w的孵化率達(dá)97%，顯著高于9 個(gè)家系(P<0.05)。但在9 個(gè)家系中，3號(hào)家系的孵化率最高為58%，顯著高于其他家系(P<0.05)；8 號(hào)與9 號(hào)家系的孵化率次之，均為52%，與其他家系間存在顯著性差異(P<0.05)；4號(hào)家系的孵化率約為47%，與其他家系間存在顯著性差異(P<0.05)；2、5、7 號(hào)家系的孵化率分別為42%、42%、43%，三者間無顯著性差異(P>0.05)，與其他家系間存在顯著性差異(P<0.05)；1 號(hào)家系的孵化率約為34%，與其他家系有顯著性差異(P<0.05)；6 號(hào)家系受精卵停留在卵裂階段，未能孵化，孵化率為0%。

圖1 各家系生長發(fā)育指標(biāo)(a)～(g) 分別是各家系受精卵孵化率，早期浮游幼體存活率，晚期浮游幼體存活率，各家系的變態(tài)率，各家系稚膽的開口率，0.55～0.60 cm的幼膽飼養(yǎng)20 天的殼徑生長率，0.55～0.60 cm 的幼膽飼養(yǎng)40 d 的殼徑生長率；數(shù)字1～9 代表1～9 號(hào)家系，0 代表混合群體；不同字母代表存在顯著性差異(P<0.05)，相同字母代表不存在顯著性差異(P>0.05)。Fig.1 Growth and development indexes of each genealogy(a)-(g) are hatching rate of fertilized eggs of each genealogy,survival rate of early planktonic larva,survival rate of late planktonic larva,metamorphosis rate of each genealogy,initial feeding rate of juvenile sea urchin in each genealogy,shell diameter growth rate of 0.55-0.60 cm juvenile sea urchin for 20 days,shell diameter growth rate of 0.55-0.60 cm juvenile sea urchin for 40 days;1-9 represents 1-9 genealogy,0 represents mixed population;different superscript means significant difference (P<0.05),while the same superscript means no significant difference (P>0.05).

2.2 浮游幼體生長發(fā)育

6 號(hào)家系受精24 h 后無法孵化全部死亡。除6 號(hào)家系外，各家系在浮游幼體生長發(fā)育同步性較好。孵化24 h 后發(fā)育至四腕幼體，四腕幼體投喂2 d 后發(fā)育至六腕幼體；六腕幼體投喂2 d 后發(fā)育至八腕幼體；八腕幼體投喂6 d 后移入采苗池，投喂4 d 后部分幼體開始變態(tài)，7 d 后大部分幼體完成變態(tài)；變態(tài)后2 d 部分稚膽開口攝食，變態(tài)后3 d 大部分稚膽開始攝食。

早期幼體存活率如圖1-b 所示，混合群體存活率為93%，顯著高于9 個(gè)家系(P<0.05)。在9個(gè)家系中，1 號(hào)家系的存活率最高為83%，與其他家系有顯著性差異(P<0.05)；5 號(hào)家系的存活率次之，約為63%，與2 號(hào)家系無顯著性差異(P>0.05)，與其他家系有顯著性差異(P<0.05)；2 號(hào)家系的存活率為61%，與除4、5 號(hào)外的其他家系有顯著性差異(P<0.05)；4 號(hào)家系的存活率為59%，與2 號(hào)家系無顯著性差異(P>0.05)，與其他家系有顯著性差異(P<0.05)；7 號(hào)與9 號(hào)家系的存活率分別為53%、54%，兩者間無顯著性差異，與其他家系有顯著性差異(P<0.05)；8 號(hào)家系的存活率為47%，除與7 號(hào)家系無顯著性差異(P>0.05)外，與其他家系都存在顯著性差異(P<0.05)；3 號(hào)家系存活率為最低為42%，與其他家系有顯著性差異(P<0.05)。

晚期幼體存活率如圖1-c 所示，4 號(hào)家系的存活率最高為90%，與7、8 號(hào)家系無顯著性差異(P>0.05)，但與其他家系有顯著性差異(P<0.05)；1、3、5、9 號(hào)家系次之，與其他家系有顯著性差異(P<0.05)；2 號(hào)家系的存活率最低為76%，與混合群體(80%)無顯著性差異(P>0.05)，但與其他家系有顯著性差異(P<0.05)。

2.3 浮游幼體的變態(tài)率

浮游幼體變態(tài)率如圖1-d 所示，2 號(hào)家系的變態(tài)率最高為75%，與其他家系有顯著性差異(P<0.05)；7 號(hào)家系次之為60%，與其他家系有顯著性差異(P<0.05)，1 號(hào)、8 號(hào)家系和混合群體無顯著性差異，但與其他家系有顯著性差異(P<0.05)；3 號(hào)家系略低于混合群體為42%，與其他家系有顯著性差異(P<0.05)；4、5、9 號(hào)家系顯著性低于混合群體(P<0.05)，三者間存在顯著性差異，與其他家系有顯著性差異(P<0.05)。

2.4 稚膽的開口率

如圖1-e 所示，9 號(hào)家系的開口率最高為100%，與其他家系有顯著性差異(P<0.05)；7 號(hào)與2 號(hào)家系次之，分別為74%、72%，兩者間無顯著性差異，與其他家系有顯著性差異(P<0.05)；1、3、4號(hào)家系再次之，分別為67%、66%、59%，三者間無顯著性差異，與其他家系有顯著性差異(P<0.05)；8 號(hào)家系的稚膽開口率為32%，低于混合群體的46%，與其他家系有顯著性差異(P<0.05)；5 號(hào)家系為25%，與其他家系有顯著性差異(P<0.05)。

2.5 幼膽的生長

各家系之間幼膽的初始?xì)綗o顯著性差異(P>0.05)。0.55～0.60 cm 的幼膽飼養(yǎng)20 d 后，如圖1-f 所示，3 號(hào)家系的平均殼徑最大為1.12 cm，生長率最高為104%，與其他家系有顯著性差異(P<0.05)；1 號(hào)與2 號(hào)家系次之，1 號(hào)家系平均殼徑為0.99 cm，生長率為84%，2 號(hào)家系平均殼徑約為1.00 cm，生長率為85%，兩者間無顯著性差異(P>0.05)，但與其他家系有顯著性差異(P<0.05)；5 號(hào)與7 號(hào)家系再次之，5 號(hào)家系平均殼徑約為0.86 cm，生長率為57%，7 號(hào)家系平均殼徑約為0.87 cm，生長率為62%，兩者間無顯著性差異(P>0.05)，與其他家系有顯著性差異(P<0.05)。

0.55～0.60 cm 的幼膽飼養(yǎng)40 d 后，如圖1-g所示，2 號(hào)與3 號(hào)家系的平均殼徑相近，2 號(hào)家系約為1.31 cm，與初始?xì)较啾容^生長率為137%，3 號(hào)家系約為1.35 cm，與初始?xì)较啾容^生長率為146%，兩者間無顯著性差異(P>0.05)，與其他家系有顯著性差異(P<0.05)；1 號(hào)家系次之，約為1.27 cm，與初始?xì)较啾容^生長率為134%，與其他家系有顯著性差異(P<0.05)；7 號(hào)家系再次之，約為0.87 cm，與初始?xì)较啾容^生長率為105%，與其他家系有顯著性差異(P<0.05)；5 號(hào)家系平均殼徑最小，約為0.96 cm，與初始?xì)较啾容^生長率為76%，與其他家系有顯著性差異(P<0.05)。對(duì)平均殼徑相近的2 號(hào)家系與3 號(hào)家系的幼膽進(jìn)行解剖，每個(gè)家系解剖10 個(gè)幼膽觀察性腺，如圖2 所示，3 號(hào)家系的幼膽性腺發(fā)育快于2 號(hào)家系。

圖2 3 號(hào)家系與2 號(hào)家系的幼膽解剖圖a 代表性腺。Fig.2 Anatomy of juvenile sea urchin in genealogy No.3 and genealogy No.2 a represent sea urchin gonads.

2.6 微生物多樣性分析

各家系的微生物主要分布在變形桿菌門(44.8%)與擬桿菌門((Bacteroidetes))(28.3%)(圖3)。不論是饑餓狀態(tài)還是投喂?fàn)顟B(tài)，在變形桿菌門或擬桿菌門上，各級(jí)家系間的微生物相對(duì)豐度無顯著性差異(P>0.05)(圖4-a～d)；但是各家系微生物的弧菌豐度有明顯變化(圖5)。如圖6-a,b 所示，在屬水平上，1 號(hào)家系饑餓狀態(tài)的弧菌相對(duì)豐度為17.7%，與其他家系存在顯著性差異(P<0.05)；2、7 號(hào)家系饑餓狀態(tài)的弧菌相對(duì)豐度分別為15.1%、15.0%，兩者間無顯著性差異(P>0.05)，但與其他家系存在顯著性差異(P<0.05)；3、5 號(hào)家系饑餓狀態(tài)的弧菌相對(duì)豐度均為3.9%，兩者間無顯著性差異(P>0.05)，但與其他家系存在顯著性差異(P<0.05)。在投喂?fàn)顟B(tài)下，各家系間的弧菌相對(duì)豐度無顯著性差異(P>0.05)。

圖3 各家系微生物在門水平上的分布圖A、B 分別代表1 號(hào)家系饑餓、投喂?fàn)顟B(tài)；C、D 分別代表2 號(hào)家系饑餓、投喂?fàn)顟B(tài)；E、F 分別代表3 號(hào)家系饑餓、投喂?fàn)顟B(tài)；G、H 分別代表5 號(hào)家系饑餓、投喂?fàn)顟B(tài)；I、J 分別代表7 號(hào)家系饑餓、投喂?fàn)顟B(tài)；數(shù)字代表生物學(xué)重復(fù)。Fig.3 Distribution map of various strains of microbes at phylum levelA and B respectively represent the state of starvation and feeding in genealogy No.1;C and D respectively represent the state of starvation and feeding in genealogy No.2;E and F respectively represent the state of starvation and feeding in no.3 genealogy;G and H respectively represent the state of starvation and feeding in no.5 genealogy;I and J respectively represent the state of starvation and feeding in no.7 genealogy;numbers represent biological repetition;the same as fig.5.

圖4 各家系在饑餓狀態(tài)和投喂?fàn)顟B(tài)下變形桿菌門和擬桿菌門的相對(duì)豐度(a)～(d) 分別是饑餓狀態(tài)下變形桿菌門的相對(duì)豐度，投喂?fàn)顟B(tài)下變形桿菌門的相對(duì)豐度，饑餓狀態(tài)下擬桿菌門的相對(duì)豐度，投喂?fàn)顟B(tài)下擬桿菌門的相對(duì)豐度；數(shù)字1、2、3、5、7 分別1、2、3、5、7 號(hào)家系；相同字母代表無顯著性差異(P>0.05)；圖6 同。Fig.4 Relative abundances of Proteobacteria and Bacteroidetes in each strain under starvation and feeding conditions(a)-(d) are relative abundance of Proteobacteria in each strain under starvation condition,relative abundance of Proteobacteria in each strain under feeding condition,relative abundance of Bacteroidetes in each strain under starvation condition,relative abundance of Bacteroidetes in each strain under feeding condition;numbers 1,2,3,5 and 7 are respectively 1,2,3,5 and 7 families;The same letter means no significant difference (P>0.05);the same as fig.6.

圖5 各家系微生物在屬水平上的分布圖Fig.5 Distribution map of various strains of microbes at genus level

圖6 各家系在饑餓狀態(tài)和投喂?fàn)顟B(tài)下弧菌屬的相對(duì)豐度(a) (b) 分別是各家系在饑餓狀態(tài)下弧菌屬的相對(duì)豐度，各家系在投喂?fàn)顟B(tài)下弧菌屬的相對(duì)豐度。Fig.6 Relative abundance of Vibrio in each genealogy under starvation and feeding condition(a) (b) are relative abundance of Vibrio in each genealogy under starvation condition,relative abundance of Vibrio in each genealogy under feeding condition.

3 討論

3.1 胚胎、早期幼體和變態(tài)階段家系間成活率差異大

海膽生活史具有浮游和底棲兩個(gè)階段。早期浮游幼體的成活率極低，能夠成功變態(tài)存活的個(gè)體數(shù)量不超過10%[10-11]；而成體的存活率則較高。大多數(shù)海洋無脊椎動(dòng)物的幼體存活率都很低，并且其自然種群新增個(gè)體數(shù)量年度變化波動(dòng)巨大，常常相差幾個(gè)數(shù)量級(jí)[12-13]。早期研究認(rèn)為餌料、洋流、繁殖策略、浮游期和幼體行為等因素[14-15]決定了幼體的成活率，但這些因素往往無法解釋如此大幅度的數(shù)量波動(dòng)[16]。這提示有其他因素如遺傳可能在幼體早期存活中發(fā)揮了重要作用[17]。本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的家系在培育過程中環(huán)境條件基本相同，但不同家系在孵化率、幼體成活率和變態(tài)率間存在顯著性差異，也提示遺傳是產(chǎn)生差異的原因之一。

很早就有研究發(fā)現(xiàn)雙殼類后代比例與孟德爾遺傳定律不符[18-19]。后來發(fā)現(xiàn)海洋無脊椎動(dòng)物中廣泛存在偏分離現(xiàn)象。Change 等[20]在中間球海膽中也發(fā)現(xiàn)了85 個(gè)偏分離的標(biāo)記。一般認(rèn)為偏分離不是親本配子繁殖能力缺陷導(dǎo)致，而是個(gè)體攜帶的有害隱性等位基因在早期發(fā)育階段表達(dá)所致[21-22]。本實(shí)驗(yàn)中，6 號(hào)家系受精率95%以上，受精卵分裂正常，但是大部分胚胎停留原腸胚階段，孵化率為零。這表明其親本配子具有受精能力，胚胎在原腸胚階段可能表達(dá)了有害隱性等位基因?qū)е屡咛ニ劳?。即使孵化率最高? 號(hào)家系也僅有58%胚胎孵化，顯著低于混合群體。這也暗示著各家系都有相當(dāng)大比例的胚胎表達(dá)了有害隱性等位基因。常規(guī)紫海膽育苗生產(chǎn)將多個(gè)個(gè)體的卵子和精子混合后，再進(jìn)行授精，孵化率超過80%[3]。多個(gè)親本配子配對(duì)增加遺傳物質(zhì)組合的多樣性，顯著降低了有害隱性等位基因純合幾率，這可能是其孵化率較高的原因。在25～28 °C，紫海膽在受精后24 h 內(nèi)就能孵化。孵化過程環(huán)境因素容易控制，可推論不同家系孵化率的差異主要是遺傳因素導(dǎo)致，這與Plough 等[17]的觀點(diǎn)相符。

有研究表明，早期發(fā)育階段的致死突變是通過有絲分裂積累的[21-22]，因此其表達(dá)與細(xì)胞分裂活躍程度有關(guān)。海膽胚胎階段有絲分裂非?；钴S，四腕幼體不僅細(xì)胞分裂旺盛，而且細(xì)胞分化程度高，幾乎所有的幼體組織和大部分海膽原基雛形都在該階段形成[23-25]。本實(shí)驗(yàn)表明這兩個(gè)階段的死亡率高，可能與活躍的有絲分裂導(dǎo)致有害隱性等位基因表達(dá)機(jī)會(huì)增加有關(guān)。長牡蠣(Crassostrea gigas)近交群體90%以上的個(gè)體在幼體階段或變態(tài)階段表達(dá)有害隱性等位基因[26-27]。紫海膽各家系后期幼體的存活率在80%左右，遠(yuǎn)高于早期幼體，表明紫海膽幼體階段的有害隱性等位基因主要表達(dá)在早期幼體。參與細(xì)胞分化和組織形成的基因眾多、基因網(wǎng)絡(luò)復(fù)雜，有害隱性等位基因大量表達(dá)機(jī)會(huì)多，是早期階段幼體死亡高的原因之一。

海膽變態(tài)時(shí)伸出初級(jí)管足探索附著基，若條件適宜發(fā)育完善的海膽原基從前廳孔外翻，幼體腕及表皮組織被迅速吸收，轉(zhuǎn)變?yōu)榘肭蛐蔚闹赡?。該過程迅速，常在1 h 內(nèi)完成，細(xì)胞間信號(hào)通訊頻繁而復(fù)雜[23]，組織形態(tài)變化巨大[25]。在變態(tài)3 d后稚膽重新形成口和肛門，開始攝食底棲硅藻[28]；同時(shí)次級(jí)管足形成，稚膽具有移動(dòng)能力[29]。變態(tài)和開口可能也是有害隱性等位基因表達(dá)的高峰期之一。開口后的紫海膽極少發(fā)生死亡，在人工培育條件下成活率可長期穩(wěn)定在90%以上，可以認(rèn)為有害隱性等位基因基本不表達(dá)。

雖然海洋動(dòng)物具有高度的遺傳多樣性，但是其有效繁殖個(gè)體數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于種群個(gè)體數(shù)量[17,25,30]。中性進(jìn)化理論認(rèn)為，海洋動(dòng)物極高的突變率是其遺傳多樣性重要的來源。與相對(duì)均質(zhì)化較高的中上層水體相比，底棲環(huán)境差異化程度大。通常海膽種群相距100 km 以上時(shí)，遺傳上就存在明顯的差異[31]。我國紫海膽不同地理種群間存在明顯形態(tài)差異[32]。雙殼類幼體隨洋流擴(kuò)散到新環(huán)境附著，其生活環(huán)境與親本生活環(huán)境存在差異。由于雙殼類成體移動(dòng)范圍非常有限，因此需要高突變率產(chǎn)生多種基因型以應(yīng)對(duì)不同底棲環(huán)境[17]。海膽可能也存在類似情況。這雖然能夠保證在不同底棲環(huán)境中都有后代存活，但在某一底棲環(huán)境必然有大量后代無法適應(yīng)而死亡，這可能是海膽變態(tài)過程死亡率高的原因。我們數(shù)據(jù)也表明不同家系幼體的變態(tài)差異巨大，高者接近80%，低者不到10%。開口率的情況也類似。家系的遺傳可能是變態(tài)率和開口率差異的主要原因。人工育苗環(huán)境對(duì)不同家系的選擇壓力存在顯著差異。紫海膽苗種生產(chǎn)中，變態(tài)率(包括變態(tài)和開口)最高也僅為20%，遠(yuǎn)低于中間球海膽50%的變態(tài)[33]。紫海膽苗種生產(chǎn)尚處于試驗(yàn)階段，其親本都來自野生群體，未經(jīng)過人工育苗環(huán)境的選擇可能是原因之一。而中間球海膽為引進(jìn)種，已有20 多年的養(yǎng)殖歷史，苗種全部來自人工育苗[4]。人工育苗已經(jīng)對(duì)中間球海膽進(jìn)行了強(qiáng)烈的選擇，目前種群已經(jīng)高度適應(yīng)人工育苗的變態(tài)環(huán)境，所以具有較高的變態(tài)率。紫海膽尚處于馴養(yǎng)的初期，野生群體尚未經(jīng)過多代的人工育苗環(huán)境選擇，其變態(tài)率相對(duì)較低。

3.2 家系間幼膽生長和性腺發(fā)育存在顯著差異

紫海膽變態(tài)后生長比較緩慢，殼徑達(dá)到0.5～0.6 cm 約需6 周，但是殼徑超過0.5 cm 生長迅速。本文選取其最快生長階段進(jìn)行了生長比較。在家系內(nèi)部個(gè)體間殼徑參差，為了初始?xì)揭恢?，在每個(gè)家系中挑選了0.55～0.6 cm 的個(gè)體進(jìn)行養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)。養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)開始時(shí)，3 號(hào)和2 號(hào)家系大部分個(gè)體都超過0.6 cm，選取的實(shí)驗(yàn)對(duì)象是家系中的極小個(gè)體；而其他3 個(gè)家系個(gè)體大多在0.6 cm 左右，實(shí)驗(yàn)對(duì)象是中等個(gè)體。在海膽苗種生產(chǎn)中，按照生長速率將苗種群體分為一類苗、二類苗和末類苗。一類苗始終保持較快的生長速率，而末類苗生長則一直緩慢。雖然3 號(hào)和2 號(hào)家系的生長試驗(yàn)個(gè)體屬于末類苗，但其生長率仍高于其他家系的二類苗。這提示家系遺傳背景對(duì)幼膽生長有很多影響，而生產(chǎn)中的一類苗很可能具有遺傳上的優(yōu)勢。

海膽性腺兼具能量儲(chǔ)備和繁殖雙重功能[34]。本研究發(fā)現(xiàn)3 號(hào)家系殼徑1.35 cm 時(shí)性腺已經(jīng)非常明顯，而其他家系均無性腺。這說明3 號(hào)家系不僅殼徑增長快，而且有多余的營養(yǎng)可以儲(chǔ)備在性腺中。生長比較實(shí)驗(yàn)采用飽食性投喂方式，各家系的攝食量和糞便量沒有明顯差異。這反映了3號(hào)家系具有較好的消化吸收，獲取的營養(yǎng)不僅能滿足殼徑生長，剩余營養(yǎng)還可以積累在性腺中。據(jù)報(bào)道紫海膽的繁殖生物學(xué)最小型為2.5 cm[35]。3號(hào)家系性腺發(fā)育明顯早于生物學(xué)最小型。顯微觀察表明性腺發(fā)育處于早期，尚不具有繁殖能力，只能作為能量儲(chǔ)備器官。性腺是海膽唯一可食用部分，3 號(hào)家系性腺早發(fā)育的能力可能對(duì)生產(chǎn)具有重要意義。這也表明紫海膽性腺發(fā)育具有改良的潛力。

3.3 家系間消化道微生物存在顯著性差異

海膽食道分泌黏液包裹食物形成顆粒，在消化過程中食物顆粒外形保持完整直至排出體外[36-37]，因此食物顆粒的微生物組成與消化道壁生物組成存在明顯差異[38]。放射線造影表明紫球海膽消化道排空時(shí)間為78 h[28]，根據(jù)解剖觀察紫海膽的排空時(shí)間約為72 h。投喂樣品與饑餓樣品中變形菌門和擬桿菌門豐度存在顯著變化。

腸道微生物在宿主的物質(zhì)代謝、轉(zhuǎn)運(yùn)和信號(hào)傳遞中具有重要作用。腸道微生物能夠代謝、轉(zhuǎn)運(yùn)多種碳水化合物[39,-40]，并且能夠合成多種神經(jīng)遞質(zhì)，影響神經(jīng)和內(nèi)分泌從而調(diào)節(jié)腸道功能[41-45]。微生物的代謝物還能夠通過三磷酸肌醇調(diào)節(jié)組蛋白乙酰酶的活性影響宿主腸道蛋白的乙?；痆46]。變形菌門是海膽腸道壁微生物的主要成員[38,47-48]，而擬桿菌門則是海膽食物顆粒中的主要微生物[47]。擬桿菌門參與了大分子有機(jī)物的降解，包括蛋白和多糖[49]。復(fù)合多糖能夠抑制消化酶活性[49]。海膽自身消化酶有限[48]，擬桿菌門具有豐富的消化碳水化合物的酶類，能夠與真核生物的消化酶互補(bǔ)，在消化營養(yǎng)物質(zhì)中具有重要作用[49]。尤其是擬桿菌門微生物能夠消化復(fù)合多糖等抗?fàn)I養(yǎng)多聚物，對(duì)海膽消化和吸收具有積極作用[49]。

腸道微生物分析表明，3 號(hào)家系變形菌門豐度少而擬桿菌門豐度高，這種微生物組成可能更利于海膽營養(yǎng)物質(zhì)的消化和吸收，因此3 號(hào)家系的幼膽的生長速率最高。相反，幼膽生長速度率最差的5 號(hào)家系的變形菌門豐度高，而擬桿菌門豐度低。海膽消化道微生物組成不依賴于外界環(huán)境具有獨(dú)特性[47]，而且不同種類海膽消化道微生物組成具有種屬特異性[38]。3 號(hào)家系與5 號(hào)家系間微生物組成的差異表明，海膽同一物種的不同遺傳背景個(gè)體的微生物組成也存在差異，且與其生長具有密切關(guān)系[47,50]。

宿主通過免疫和營養(yǎng)依賴等方式對(duì)選擇腸道微生物種類，造成腸道微生物的種類和數(shù)量的差異，并且微生物在腸道的分布具有顯著的空間分布特征[41]。宿主遺傳差異導(dǎo)致免疫能力和腸道分泌物不同，因此對(duì)腸道微生物種類進(jìn)行差異性選擇，導(dǎo)致微生物種類隨著宿主遺傳變化而變化[51-53]。例如，人類腸道微生物組成具有高度個(gè)體特異化，個(gè)體間差異程度遠(yuǎn)超同一個(gè)體不同發(fā)育階段的差異[54]。而且個(gè)體間的微生物存在明顯的SNP 差異，存在個(gè)體特異的菌株且能長時(shí)間穩(wěn)定存在[55]。此外，基于16SrRNA測序的腸道微生物種類分析無法有效進(jìn)行菌株水平的區(qū)分[9]；而腸道微生物大多數(shù)物種都包含多種菌株，而且存在宿主個(gè)體差異[55-56]。因此本實(shí)驗(yàn)不同家系腸道微生物組成可能存在更多菌株層次的差異。

擬桿菌門中的弧菌屬種類主要存在海膽食物顆粒和糞便中[47]，其蛋白和脂質(zhì)代謝水平高于變形菌門種類，被認(rèn)為參與了海膽脂質(zhì)和脂肪酸生物合成過程[57-59]。3 號(hào)家系的弧菌屬豐度低于2 號(hào)家系，但是3 號(hào)家系不僅生長速度高于2 號(hào)家系，其性腺發(fā)育狀況也高于2 號(hào)家系。這與弧菌屬利于海膽脂質(zhì)和脂肪酸合成的結(jié)論不一致。在食物充足的情況下，食物通過腸道速率較快，不利于微生物定植于腸道[8]。這可能是導(dǎo)致饑餓狀態(tài)下家系間弧菌的豐度存在差異，而投喂?fàn)顟B(tài)下家系間弧菌豐度不存在差異的原因。除弧菌屬外，其他鑒定的各屬微生物在不同家系間沒有顯著性差異，而未鑒定種類的微生物可能對(duì)家系生長差異具有一定貢獻(xiàn)。

4 總結(jié)

紫海膽家系間在孵化率、幼體存活率、變態(tài)率、稚膽開口率等方面存在差異，遺傳因素在紫海膽早期發(fā)育階段死亡具有重要作用，遺傳改良在提高早期發(fā)育階段成活率和提高人工苗種生產(chǎn)效率中具有巨大潛力。建議在紫海膽苗種生產(chǎn)過程中采用1 雌1 雄配對(duì)授精的方法，以提高遺傳選擇強(qiáng)度，加快紫海膽育苗馴化過程。

（作者聲明本文無實(shí)際或潛在的利益沖突）