四川地區(qū)2 754名供精志愿者染色體篩選及結(jié)果分析

鮮泱，劉博，應(yīng)麗娟，劉曉，柳莎莎，趙文瑞，羅雪峰，徐金艷，李福平

(四川大學(xué)華西第二醫(yī)院生殖男科/人類精子庫(kù),出生缺陷與相關(guān)婦兒疾病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,成都 610041)

人類精子庫(kù)是以治療不育癥以及預(yù)防遺傳病等為目的,利用超低溫冷凍技術(shù),采集、檢測(cè)、保存和提供精子的機(jī)構(gòu)[1],其最重要的工作是篩查合格的供精者,提供合格的冷凍精液給國(guó)內(nèi)經(jīng)衛(wèi)生行政部門批準(zhǔn)開展輔助生殖技術(shù)(ART)的醫(yī)療機(jī)構(gòu)。目前,國(guó)內(nèi)的精子庫(kù)均參照原衛(wèi)生部2003年發(fā)布的《人類精子庫(kù)基本標(biāo)準(zhǔn)和技術(shù)規(guī)范》進(jìn)行供精志愿者的管理工作,其中明確指出,精子庫(kù)的基本任務(wù)之一為對(duì)供精者進(jìn)行嚴(yán)格的醫(yī)學(xué)和醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)篩查[2]。

醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)篩查中最重要的檢測(cè)為染色體的篩查。染色體異常是導(dǎo)致男性不育的重要原因之一[3],在正常男性中染色體異常的比例約為0.7%～1.0%[4]。隨著染色體顯帶技術(shù)的發(fā)展,對(duì)染色體的形態(tài)及結(jié)構(gòu)有了新的認(rèn)識(shí),其中,染色體多態(tài)性被發(fā)現(xiàn)廣泛存在于健康人群中,它是染色體結(jié)構(gòu)、寬窄及著色的微小恒定的變異,多屬于正常變異[5-6]。但隨著對(duì)其認(rèn)識(shí)的深入,染色體多態(tài)性的臨床效應(yīng)開始引起關(guān)注,尤其在生殖健康方面[7]。染色體多態(tài)性可能會(huì)影響配子形成過(guò)程中的同源染色體聯(lián)會(huì),繼而引起不孕、流產(chǎn)、死胎、子代畸形等[8-9]。

既往國(guó)內(nèi)關(guān)于染色體核型及多態(tài)的報(bào)道多集中在不孕不育人群中[10-12],在正常人群中的發(fā)生率鮮有報(bào)道。精子庫(kù)對(duì)供精志愿者常規(guī)進(jìn)行染色體篩查,以提供高質(zhì)量的供精標(biāo)本,對(duì)減少供精后代的出生缺陷的發(fā)生具有重要意義。本文以供精志愿者為研究人群,分析其核型異常及染色體多態(tài)性情況,為精子庫(kù)排除捐精志愿者遺傳缺陷提供依據(jù),為正常人群的染色體異常比例提供參考。

資料和方法

一、研究對(duì)象

回顧性分析2013年1月至2022年12月于四川大學(xué)第二醫(yī)院人類精子庫(kù)進(jìn)行捐精篩查的2 754例供精志愿者的染色體結(jié)果。

納入標(biāo)準(zhǔn):(1)供精志愿者為年齡在22～45周歲的健康中國(guó)男性,身高≥165 cm,學(xué)歷高中及以上;(2)據(jù)《人類精子庫(kù)基本標(biāo)準(zhǔn)和技術(shù)規(guī)范》[2],供精志愿者精液質(zhì)量合格標(biāo)準(zhǔn)如下:精液液化時(shí)間<60 min,體積>2 ml,濃度>60×106/ml,前向運(yùn)動(dòng)精子比例(PR)>60%,冷凍復(fù)蘇后PR>40%,前向運(yùn)動(dòng)精子總數(shù)>12×106/ml,冷凍復(fù)蘇率>60%;(3)病史篩查(既往病史、個(gè)人生活史及性傳播疾病史)及體格檢查(一般及生殖系統(tǒng)檢查)合格;(4)精液病原微生物檢測(cè):包含支原體、衣原體、細(xì)菌培養(yǎng)及淋球菌培養(yǎng)均為陰性。

排除標(biāo)準(zhǔn):(1)年齡小于22周歲或大于45周歲;(2)精液質(zhì)量不符合捐精志愿者合格標(biāo)準(zhǔn);(3)有遺傳學(xué)或傳染性疾病史等不符合捐精志愿者條件者。

本研究共納入2 754例捐精志愿者,根據(jù)染色體結(jié)果分為染色體正常組2 661例、染色體核型異常組7例及染色體多態(tài)性組86例。

二、研究方法

1.精液分析:所有捐精志愿者于四川大學(xué)第二醫(yī)院人類精子庫(kù)獨(dú)立取精室內(nèi)進(jìn)行手淫取精,精液標(biāo)本收集完整后交至精子庫(kù)實(shí)驗(yàn)室。標(biāo)本置于37℃恒溫孵箱內(nèi),液化后取7 μl于Makler板上,計(jì)數(shù)精子濃度及前向運(yùn)動(dòng)精子比例。所有操作均遵守WHO《人類精液檢查與處理實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》(第五版)[13]要求標(biāo)準(zhǔn)。

2.精液冷凍及復(fù)蘇:(1)冷凍方法:冷凍保護(hù)劑與精液按照1∶3比例加入無(wú)菌冷凍管中,顛倒混勻20次后,采用1步熏蒸法進(jìn)行冷凍,液氮上8 cm熏蒸10 min后,浸入液氮中;(2)復(fù)蘇方法:將標(biāo)本從液氮中取出,室溫平衡1 min后,置于37℃水浴箱中孵育5 min,進(jìn)行精子濃度及PR的檢測(cè)。

3.染色體核型分析:所有捐精志愿者染色體核型由四川大學(xué)華西第二醫(yī)院醫(yī)學(xué)遺傳科/四川省產(chǎn)前診斷中心進(jìn)行檢測(cè)。抽取外周血0.3～0.5 ml,加入外周血培養(yǎng)基中,淋巴細(xì)胞培養(yǎng)48～72 h后,采用常規(guī)方法收獲并制備染色體,制片、G顯帶。使用蔡司全自動(dòng)染色掃描儀進(jìn)行染色體玻片掃描,獲得80個(gè)中期分裂相,計(jì)數(shù)其中20個(gè)分裂相。核型描述及命名參照最新版ISCN標(biāo)準(zhǔn)。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、捐精志愿者的染色體篩查情況及人群基本特征

2013年至2022年間,共2 754例捐精志愿者進(jìn)行染色體檢測(cè),其中有93例捐精志愿者為染色體核型異?；蛉旧w多態(tài)性,占比為3.38%(93/2 754),歷年的檢出率詳見(jiàn)表1。

表1 2013～2022年間捐精志愿者染色體篩查結(jié)果

2 754例捐精志愿者按照染色體結(jié)果,分為染色體正常組、染色體核型異常組及染色體多態(tài)性組。3組間的人群基本特征均無(wú)顯著性差異(P>0.05)(表2)。

表2 人群一般特征在染色體正常、染色體核型異常及染色體多態(tài)性中分布情況[(-±s),n(%)]

二、3組捐精志愿者的精液常規(guī)參數(shù)

統(tǒng)計(jì)分析3組志愿者的精液常規(guī)參數(shù),結(jié)果顯示,3組間各精液常規(guī)參數(shù)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(表3)。

表3 染色體正常組、染色體核型異常組及染色體多態(tài)性組的精液常規(guī)參數(shù)比較(-±s)

三、捐精志愿者染色體核型異常及染色體多態(tài)性情況分析

93例染色體核型異?；蛉旧w多態(tài)性的捐精志愿者中,染色體核型異常的志愿者有7例,占比為7.53%(7/93);在所有捐精志愿者中,異常核型的發(fā)生率為0.25%(7/2 754)。7例染色體核型異常志愿者中,染色體數(shù)目異常1例,核型為mos 47,XYY[5]/46,XY[25],染色體結(jié)構(gòu)重排6例。篩選出的異常染色體核型具體情況見(jiàn)表4。

表4 捐精志愿者染色體核型異常情況(%)

93例染色體核型異?；蛉旧w多態(tài)性的的捐精志愿者中,染色體多態(tài)性共有86例,占比92.47%(86/93),在所有捐精志愿者中,染色體多態(tài)性的發(fā)生率為3.12%(86/2 754)。篩選出的86例染色體多態(tài)性分為四種類型,數(shù)量最多的為D組和G組染色體隨體區(qū)變異,占比為34.88%(30/86);其次為25例1號(hào)、9號(hào)、16號(hào)染色體次縊痕增加,占比29.07%(25/86);9號(hào)染色體臂間倒位24例,占比27.90%(24/86);Y染色體多態(tài)性變異7例,占比8.14%(7/86)。詳細(xì)核型見(jiàn)表5。

討 論

人類精子庫(kù)的重要工作任務(wù)之一為篩選合格的捐精志愿者、提供合格的冷凍供精精液標(biāo)本給合法的輔助生殖機(jī)構(gòu)。對(duì)志愿者進(jìn)行遺傳學(xué)檢測(cè)是精子庫(kù)日常工作中的重要環(huán)節(jié),原衛(wèi)生部2003年發(fā)布的《人類精子庫(kù)基本標(biāo)準(zhǔn)和技術(shù)規(guī)范》指出,供精者染色體常規(guī)核型分析必須正常,結(jié)合2021年最新的精子庫(kù)專家共識(shí),供精者染色體常規(guī)核型分析正常需為46,XY,染色體核型異常及常見(jiàn)的染色體多態(tài)性如9號(hào)染色體倒位、染色體隨體減少等均不能列入供精志愿者染色體常規(guī)核型分析正常[2,14]。四川省人類精子庫(kù)在進(jìn)行捐精者篩選時(shí),將染色體核型異常及染色體多態(tài)性的捐精者予以淘汰處理,其中,對(duì)于因染色體多態(tài)性而無(wú)法繼續(xù)捐精的供精者,我們?cè)谶M(jìn)行結(jié)果告知時(shí)也會(huì)特別說(shuō)明染色體多態(tài)性多為正常變異,對(duì)捐精者本人的后續(xù)生育影響不大,不能繼續(xù)供精者流程是因?yàn)榫訋?kù)對(duì)捐精者有更高的標(biāo)準(zhǔn),以避免志愿者因其染色體多態(tài)性結(jié)果產(chǎn)生焦慮情緒。既往關(guān)于捐精志愿者的染色體結(jié)果專題報(bào)道較少,僅廣東及上海報(bào)道了捐精志愿者染色體的異常比例為1.8%及3.39%[15-16]。本文對(duì)捐精志愿者染色體篩查結(jié)果進(jìn)行了報(bào)道。

引起男性不育的原因很多,如輸精管梗阻、遺傳因素、內(nèi)分泌因素及生殖道感染等,而遺傳性因素是重要的原因之一,它不僅與睪丸發(fā)育及精子發(fā)生相關(guān),還與胎兒流產(chǎn)及子代出生缺陷有關(guān)[17]。既往報(bào)道約有13.6%～18.8%的男性不育患者存在染色體異常[18-19],而少精子癥患者及無(wú)精子癥患者中染色體異常比例分別為19.66%與34.19%[5]。少精子癥患者及無(wú)精子癥患者通常存在染色體數(shù)目及結(jié)構(gòu)異常,數(shù)目變化常表現(xiàn)為三體、三倍體及X單體,結(jié)構(gòu)異常主要有染色體斷裂、倒置及缺失等[20],這些異常變化是導(dǎo)致生精功能障礙及精子減少甚至無(wú)精子的主要原因。本研究中的捐精志愿者平均年齡為(27.87±6.47)歲,處于生育年齡,且精液常規(guī)參數(shù)均為正常(如表2所示),可視為正常生育人群。染色體篩查結(jié)果顯示,捐精志愿者染色體核型異常及染色體多態(tài)性的發(fā)生比例3.38%,遠(yuǎn)低于男性不育患者,也遠(yuǎn)低于少精子癥患者及無(wú)精子癥患者的染色體異常比例。由于精子庫(kù)的工作流程是捐精志愿者精液常規(guī)篩查合格后方進(jìn)行染色體檢查,因此,本研究中染色體正常組、染色體核型異常組及染色體多態(tài)性組在人群分布、生育情況、一般人群特征(年齡、身高、體重及BMI)及精液常規(guī)參數(shù)上均無(wú)顯著性差異(表2)。

本研究中,2 754例捐精志愿者中,有93例捐精志愿者出現(xiàn)染色體核型異?；蛉旧w多態(tài)性,包含7例志愿者為染色體核型異常,占比7.53%(7/93),86例志愿者為染色體多態(tài)性,占比92.47%(86/93)。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn),7例染色體核型異常志愿者均無(wú)生育史,其中4例未婚,3例志愿者已婚但未生育,因數(shù)量太少,無(wú)法準(zhǔn)確提示核型異常是否對(duì)男性生育有影響,需在后續(xù)研究中加大樣本量的觀察后方能得出可靠結(jié)論。

染色體多態(tài)性是一種多發(fā)生于異染色質(zhì)中,涉及染色體結(jié)構(gòu)、寬窄及著色的微小恒定變異[5]。結(jié)構(gòu)異染色質(zhì)在中期染色體上多定位于著絲粒區(qū)、端粒、次縊痕及染色體臂的某些片段,其所含的DNA多為具有顯著遺傳惰性的相對(duì)簡(jiǎn)單的高重復(fù)序列,因其不轉(zhuǎn)錄也不編碼蛋白,多認(rèn)為其無(wú)特殊功用及表型效應(yīng)[6]。近年來(lái)發(fā)現(xiàn),染色體多態(tài)性對(duì)生殖健康的影響的報(bào)道增多,主要表現(xiàn)為與復(fù)發(fā)性流產(chǎn)、不明原因不孕和不良孕產(chǎn)史等相關(guān)[21-23]。捐精志愿者的冷凍精液是用于輔助生殖技術(shù),而染色體多態(tài)性變異是捐精志愿者因染色體不合格的最常見(jiàn)類型,了解其主要染色體多態(tài)性異常對(duì)生殖的影響對(duì)精子庫(kù)有十分重要的意義。本研究中,捐精志愿者主要出現(xiàn)4種類型的染色體多態(tài)性,包含D組和G組染色體隨體區(qū)變異、1號(hào)/9號(hào)/16號(hào)染色體次縊痕增加、9號(hào)染色體臂間倒位及Y 染色體多態(tài)性變異。

D組(13、14、15)號(hào)染色體和G組(21、22及Y)染色體為近端著絲粒染色體,本研究中出現(xiàn)的D、G組染色體多態(tài)性涉及雙隨體(pss)、隨體柄增長(zhǎng)(pstk+)、隨體增大(ps+)及隨體臂出現(xiàn)異染色質(zhì)(ph)(見(jiàn)表4)。本研究中精液常規(guī)參數(shù)正常的捐精志愿者D組和G組染色體隨體區(qū)變異檢出率為1.09%(30/2 754),遠(yuǎn)低于無(wú)精子癥患者及少弱精子癥患者的檢出率[分別為8.49%(22/259)、12.05%(10/83)][24]。D/G組隨體區(qū)變異主要原因?yàn)楹颂求wRNA的增多,使染色體在隨體區(qū)發(fā)生不分離及聯(lián)合、重排等變化,繼而造成精子生成的基因缺失或斷裂,在臨床上表現(xiàn)為少弱精及無(wú)精子癥[25]。除了對(duì)精子質(zhì)量的影響外,D/G組隨體區(qū)變異也會(huì)對(duì)生殖結(jié)局產(chǎn)生影響。染色體運(yùn)動(dòng)和均等分離的結(jié)構(gòu)及功能基礎(chǔ)為其主縊痕區(qū)的著絲粒-動(dòng)粒復(fù)合體,為細(xì)胞分裂中紡錘絲微管的著力點(diǎn)[26]。此結(jié)構(gòu)與隨體區(qū)相鄰,隨體區(qū)的變異可能引起D、G 組隨體區(qū)聯(lián)合頻率異常增加,從而增加近端著絲粒染色體的不分離,導(dǎo)致胚胎發(fā)生染色體非整倍體變異或減數(shù)分裂中異常配子產(chǎn)生的可能性,引發(fā)自發(fā)流產(chǎn)或不孕等[27]。

1號(hào)/9號(hào)/16號(hào)染色體次縊痕變異的主要原因?yàn)槿旧w異染色質(zhì)區(qū)重復(fù)DNA序列的增加,該變化可能會(huì)對(duì)減數(shù)分裂的過(guò)程如同源染色體配對(duì)造成影響,產(chǎn)生平衡配子等[28],繼而造成男性不育、流產(chǎn)死胎等。本研究中,精液質(zhì)量正常的捐精志愿者1號(hào)/9號(hào)/16號(hào)染色體次縊痕變異檢出率為0.91%(25/2 754),遠(yuǎn)低于男性不育人群占比11.39(67/588),由此可見(jiàn),1號(hào)/9號(hào)/16號(hào)染色體次縊痕多態(tài)變異可能會(huì)影響男性精子質(zhì)量及生育結(jié)局。

染色體臂間倒位是一種染色體結(jié)構(gòu)異常,指一條染色體的長(zhǎng)臂或短臂各發(fā)生一次斷裂后旋轉(zhuǎn)180度后重接而成,其中以9號(hào)染色體最為多見(jiàn),在人群中的發(fā)生率為1%[29]。本研究中捐精志愿者的9號(hào)染色體臂間倒位檢出率為0.87%(24/2 754)。既往多認(rèn)為9號(hào)染色體的臂間倒位不會(huì)導(dǎo)致遺傳物質(zhì)的增加或缺失,但如果染色體倒位的位置處恰好有精子發(fā)生基因的分布,則有可能會(huì)影響精子的生成[24]。臂間倒位染色體的遺傳效應(yīng)主要取決于倒位片段長(zhǎng)短及是否互換,倒位片段越長(zhǎng),越容易互換,重組后染色體的重復(fù)和缺失部分也就越短,合子就容易發(fā)育,這種遺傳物質(zhì)的不平衡會(huì)導(dǎo)致流產(chǎn)、不孕或形成畸形兒的幾率升高[30-31],故9號(hào)染色體臂間倒位與生殖相關(guān)異常也存在一定聯(lián)系。

本研究中Y染色體多態(tài)性變異為臂間倒位(Inv Y)及次縊痕延長(zhǎng)(Yqh+)兩種,檢出率為0.25%(7/2 754)。Inv Y 指染色體臂間倒位發(fā)生在Y染色體上,Inv Y的臨床效應(yīng)與其斷裂位點(diǎn)相關(guān),若損傷到某些基因的功能,造成某些臨床表征或遺傳效應(yīng)可能與男性生精功能異常、性分化異常、流產(chǎn)、死胎、不育等有關(guān)[31]。Y染色體長(zhǎng)臂異染色質(zhì)區(qū)上分布著與男性睪丸發(fā)育、精子形成及性別決定等有關(guān)的基因,此區(qū)域出現(xiàn)增加時(shí)可能會(huì)導(dǎo)致男性精子生成障礙及男性不育[24,32]。由于Y染色體上有男性性別相關(guān)基因存在,當(dāng)發(fā)生數(shù)目異?；蚪Y(jié)構(gòu)改變時(shí),可能會(huì)引起男性性發(fā)育異?；蛏钞惓５犬惓Ｐ?yīng),應(yīng)當(dāng)引起重視。

本研究存在一定的局限性,首先本研究為單中心研究,受限于樣本量,結(jié)果可能存在一定程度上的偏差,后續(xù)有待多中心大樣本量的數(shù)據(jù)進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證;其次,本文中染色體核型異常的檢出數(shù)量較少,僅7例均無(wú)生育史,但由于7例中僅3例已婚,例數(shù)過(guò)少,無(wú)法準(zhǔn)確判斷核型異常與男性生育間的關(guān)系,僅能起到提示作用,后續(xù)將持續(xù)收集相關(guān)數(shù)據(jù),進(jìn)一步完善,以獲得更為可靠的結(jié)果。

綜上,染色體多態(tài)性雖然不會(huì)引起自身的表型異常,但其與生殖相關(guān)異常如死胎、流產(chǎn)、子代畸形等存在一定相關(guān)性。本研究結(jié)果提示,在正常生育人群中,當(dāng)精液常規(guī)參數(shù)及其他特征均正常的情況下,仍有小部分人群可能出現(xiàn)染色體核型異常或染色體多態(tài)性,在育前檢查中,應(yīng)當(dāng)重視染色體檢查。當(dāng)捐精志愿者出現(xiàn)染色體多態(tài)性變異時(shí),為避免對(duì)供精子代的遺傳效應(yīng),降低供精子代的遺傳風(fēng)險(xiǎn)及出生缺陷,需將志愿者淘汰,而在臨床患者尤其是男性不育患者,出現(xiàn)多態(tài)性變異時(shí)建議進(jìn)行后期隨訪及做好產(chǎn)前診斷及遺傳咨詢,以獲得健康子代。