甲狀腺乳頭狀癌中Cyclin D1、Ki-67表達(dá)和5項(xiàng)相關(guān)基因突變與遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的相關(guān)性研究

馮倩倩，王 也，王曉偉，徐晶晶，史艷芬，黃崎鑫，鐘定榮*

（1.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院研究生院，北京 100006；2.中日友好醫(yī)院病理科，北京 100029；3.中日友好醫(yī)院心臟科，北京 100029）

甲狀腺乳頭狀癌（papillary thyroid carcinoma，PTC）是甲狀腺癌最常見的病理類型，約占甲狀腺癌的70%～80%。雖然PTC 預(yù)后較好且相對(duì)惡性度低，但仍有約30%發(fā)生局部復(fù)發(fā)，5%發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[1]。一些研究推薦，對(duì)于存在PTC 復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)因素（如腫瘤較大、甲狀腺外侵犯、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、較小年齡和男性）的患者，應(yīng)進(jìn)行遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的篩查[2]。但許多沒(méi)有臨床復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)特征的病例也可能出現(xiàn)局部復(fù)發(fā)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，因此尋找新的預(yù)測(cè)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的指標(biāo)具有重要意義。本研究中，我們比較了2 種生物標(biāo)志物Cyclin D1、Ki-67 以及5種分子標(biāo)志物在PTC遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移與未轉(zhuǎn)移組織中的表達(dá)，以探討它們預(yù)測(cè)PTC遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的臨床價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 病例選擇

收集中日友好醫(yī)院2015年9月—2022年12月手術(shù)切除或局部病灶穿刺獲得的確診為轉(zhuǎn)移性PTC 的病例共18 例，發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的原發(fā)病灶直徑≥2cm；12 例來(lái)自肺，4 例來(lái)自骨，1 例來(lái)自腦，1例來(lái)自縱隔。其中男8 例，女10 例；年齡26～82歲，平均57.1±16.0 歲。對(duì)照組為中日友好醫(yī)院同期行甲狀腺切除術(shù)、確診為PTC 未發(fā)生轉(zhuǎn)移的病例25例，病灶直徑≥2cm。其中男9例，女16例；年齡20～66 歲，平均45.7±13.7 歲。所有病例的病理診斷均由2 位病理醫(yī)生進(jìn)行獨(dú)立診斷。本研究獲中日友好醫(yī)院臨床研究倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（2023-KY-004）。

1.2 免疫組織化學(xué)檢測(cè)

1.2.1 試劑、儀器及操作步驟

Cyclin D1抗體購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司，Ki-67抗體購(gòu)自北京中杉金橋公司。第二抗體使用全自動(dòng)免疫組織化學(xué)染色儀配套試劑盒，購(gòu)自德國(guó)Leica公司。儀器應(yīng)用Leica全自動(dòng)免疫組組織化學(xué)儀染色。操作步驟按說(shuō)明書進(jìn)行。

1.2.2 判斷標(biāo)準(zhǔn)

Cyclin D1 抗體的計(jì)分方法，在清晰背景下，出現(xiàn)黃色、棕色或褐色顆粒的細(xì)胞核染色視為陽(yáng)性反應(yīng)。我們根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞百分比評(píng)定著色細(xì)胞的比例：無(wú)著色細(xì)胞得0 分，≤25%得1 分，26%～50%得2 分，51%～75%得3 分，＞75%得4 分。根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞的著色特征評(píng)定染色強(qiáng)度：無(wú)著色得0分，淡黃色得1分，棕黃色得2分，棕褐色得3分。將染色強(qiáng)度與著色細(xì)胞比例的得分相加，總分＜5分定義為低表達(dá)組，≥5分定義為高表達(dá)組。

Ki67 按照陽(yáng)性細(xì)胞百分比計(jì)分：著色細(xì)胞比例在0～3%，定義為低表達(dá)組；著色細(xì)胞比例≥3%，定義為高表達(dá)組。

1.3 分子檢測(cè)

1.3.1 主要試劑及儀器

每例選取樣本中腫瘤占比＞30%的蠟塊，連續(xù)切5～8 個(gè)10μm 蠟卷，直接封存于EP 管中行基因檢測(cè)。核酸提取試劑盒、人類KRAS/NRAS/BRAF基因及TERT/HRAS基因突變聯(lián)合檢測(cè)試劑盒，均購(gòu)自廈門艾德生物醫(yī)藥科技股份有限公司，儀器應(yīng)用ABI7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀。

1.3.2 擴(kuò)增程序及結(jié)果判讀

第一階段：95℃5min 1 個(gè)循環(huán)；第二階段：95℃25s，64℃20s，72℃20s，15 個(gè)循環(huán)；第三階段：93℃25s，60℃35s，72℃20s，31 個(gè)循環(huán)。信號(hào)收集：第三階段60℃時(shí)收集FAM 和HEX 信號(hào)，執(zhí)行實(shí)時(shí)PCR，保存文件。結(jié)果判讀參照說(shuō)明書判讀標(biāo)準(zhǔn)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS22.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)數(shù)資料以例（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，通過(guò)χ2值計(jì)算列聯(lián)系數(shù)進(jìn)行相關(guān)性分析，以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Cyclin D1 及Ki-67 在PTC 遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移組和對(duì)照組的表達(dá)

Cyclin D1 及Ki-67 陽(yáng)性染色均主要定位于細(xì)胞核（圖1～4，見封二）。表1 示，PTC 遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移組和對(duì)照組中Cyclin D1高表達(dá)率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；2 組中Ki-67 高表達(dá)率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表1 PTC遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移組和對(duì)照組Cyclin D1、Ki-67表達(dá)及相關(guān)基因突變情況n（%）

圖1 Cyclin D1 在甲狀腺乳頭狀癌遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移組中高表達(dá)（EnVision 法，×400）。

圖2 Cyclin D1 在對(duì)照組中低表達(dá)（EnVision法，×400）。

圖3 Ki-67在甲狀腺乳頭狀癌遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移組中高表達(dá)（EnVision法，×400）。

圖4 Ki-67在對(duì)照組中低表達(dá)（EnVision法，×400）。

2.2 5 基因（KRAS、NRAS、BRAF、TERT 和HRAS）在PTC遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移組和對(duì)照組中的檢測(cè)結(jié)果

遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移組患者中檢測(cè)到5 項(xiàng)甲狀腺癌相關(guān)基因突變15例次（圖5～7），其中BRAF V600E突變率55.6%（10/18），TERT突變率22.2%（4/18），NRAS突變率5.6%（1/18）；BRAF V600E和TERT啟動(dòng)子共突變3 例，BRAF V600E、TERT 和NRAS 3 種基因同時(shí)突變1 例。TERT 及NRAS 突變均伴隨BRAF V600E突變，未檢測(cè)到KRAS、HRAS突變。

圖5～7 甲狀腺乳頭狀癌遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移病例的基因突變擴(kuò)增曲線

對(duì)照組25例患者中檢測(cè)到5項(xiàng)甲狀腺癌相關(guān)基因突變15例次，均為BRAF V600E基因突變，突變率60%，未檢測(cè)到KRAS、NRAS、TERT 和HRAS基因突變。表1 示，PTC 遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移組TERT突變率22.2%（4/18）明顯高于對(duì)照組（0%），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；BRAF V600E 和NRAS 突變率在2組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.3 PTC 遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移病例Cyclin D1、Ki-67 表達(dá)與臨床特征及基因突變的關(guān)系

表2 示，PTC 遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移組病例的BRAF V600E、TERT基因突變與Cyclin D1和Ki-67表達(dá)強(qiáng)度之間并無(wú)相關(guān)性（P＞0.05）。其臨床特征（性別、年齡）與Cyclin D1 和Ki-67 表達(dá)強(qiáng)度之間也無(wú)相關(guān)性（P＞0.05）。

表2 Cyclin D1、Ki-67表達(dá)與PTC遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移病例臨床特征及BRAF V600E、TERT突變的關(guān)系n（%）

3 討論

3.1 Cyclin D1蛋白表達(dá)與PTC遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的關(guān)系

Motokura 等人[3]在甲狀旁腺腺瘤中首次發(fā)現(xiàn)了Cyclin D1 基因。該基因位于11q13 位置，全長(zhǎng)120kb，有5 個(gè)外顯子和4 個(gè)內(nèi)含子組成，編碼295個(gè)氨基酸殘基。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，Cyclin D1蛋白的過(guò)度表達(dá)可以推動(dòng)細(xì)胞從G1 期進(jìn)入S 期，引起細(xì)胞增殖，導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生[4]。已有研究發(fā)現(xiàn)Cyclin D1 蛋白在PTC 中的表達(dá)明顯高于結(jié)節(jié)性甲狀腺腫，且與患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)[5]，這表明Cyclin D1 的高表達(dá)在PTC 的轉(zhuǎn)移和侵襲過(guò)程中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。Lee 等[6]在PTC 中發(fā)現(xiàn)Cyclin D1 過(guò)度表達(dá)與腫瘤侵襲性、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和細(xì)胞增殖密切相關(guān)；有研究[7]發(fā)現(xiàn)Cyclin D1 在PTC 中均有表達(dá)，但在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的PTC 患者中強(qiáng)陽(yáng)性率為56.2%，在無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的PTC 患者中強(qiáng)陽(yáng)性率為25.0%。本研究中Cyclin D1 在PTC 遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移組病例中以高表達(dá)為主，對(duì)照組中以低表達(dá)為主，2 組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），與以往的研究結(jié)果基本一致。因此，我們推斷Cyclin D1 高表達(dá)與PTC 遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的關(guān)系十分密切，臨床上可以通過(guò)檢測(cè)Cyclin D1 的蛋白表達(dá)，來(lái)預(yù)測(cè)PTC 是否更易發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、是否具有更高的侵襲性。

3.2 Ki-67蛋白表達(dá)與PTC遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的關(guān)系

Ki-67 作為一種重要的免疫組織化學(xué)標(biāo)記物，其功能與有絲分裂密切相關(guān)，在細(xì)胞增殖中不可缺少，可以識(shí)別出G0期以外的G1、S、G2和M期的細(xì)胞，經(jīng)常用于評(píng)估不同實(shí)體瘤發(fā)展過(guò)程中的細(xì)胞增殖指數(shù)[8]。Ki-67 的高表達(dá)與多種癌癥的侵襲性增加有關(guān)[9]。諸多文獻(xiàn)闡明Ki-67 的高表達(dá)與乳腺癌和前列腺癌的預(yù)后不良有關(guān)[10，11]。然而，目前對(duì)Ki-67 的高表達(dá)與甲狀腺癌之間的關(guān)系還沒(méi)有達(dá)成共識(shí)。Pan 和Guadagno 等[12，13]分別進(jìn)行薈萃分析，他們發(fā)現(xiàn)Ki-67 高表達(dá)與患者年齡、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、甲狀腺外侵犯和TNM 分期顯著相關(guān)。此外，他們還證實(shí)，與Ki-67 低表達(dá)的患者相比，Ki-67 高表達(dá)的患者無(wú)病生存期更短，死亡風(fēng)險(xiǎn)更高。Pan 等[14]結(jié)合15項(xiàng)研究的數(shù)據(jù)總結(jié)Ki-67 的表達(dá)水平在大腫瘤（＞4cm）中高于小腫瘤（＜4cm）（合并OR=1.86）；Ki-67 的表達(dá)水平在陰性淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組低于陽(yáng)性淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組（合并OR=2.49）。本研究發(fā)現(xiàn)Ki-67在PTC 遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移組的表達(dá)高于PTC 未轉(zhuǎn)移組，2組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），與上述研究結(jié)果基本一致?？赡苁怯捎贙i-67 是與細(xì)胞增殖相關(guān)的核抗原，因此Ki-67 高表達(dá)可能代表PTC細(xì)胞增殖快、惡性度高、侵襲性更強(qiáng)。

3.3 基因突變與PTC遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的關(guān)系

BRAF V600E 和TERT 啟動(dòng)子突變，已被證實(shí)與PTC的侵襲性及不良預(yù)后有關(guān)[15]。Yang等[16]研究發(fā)現(xiàn)，BRAF V600E 和TERT 啟動(dòng)子突變共存與年齡、腫瘤大小、是否甲狀腺腺外侵犯、T 分期、AJCC 分期及腫瘤復(fù)發(fā)/遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)（P＜0.05）。在我們的18 例PTC 遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移病例中，有3例檢測(cè)到了BRAF V600E 和TERT 啟動(dòng)子共突變，1 例檢測(cè)到BRAF V600E、TERT 和NRAS 3 種基因同時(shí)突變。在對(duì)照組中沒(méi)有檢測(cè)到TERT 啟動(dòng)子突變，這與以往的研究結(jié)果相符，進(jìn)一步提示，當(dāng)PTC 患者檢測(cè)出BRAF V600E 和TERT 啟動(dòng)子共突變時(shí)，可能預(yù)示著更高的侵襲性和更易發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。另有研究顯示，Cyclin D1的表達(dá)強(qiáng)度在BRAF V600E 突變組中更強(qiáng)，呈現(xiàn)正相關(guān)[17]。我們的研究中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)Cyclin D1 表達(dá)與BRAF V600E 和TERT 啟動(dòng)子突變的相關(guān)性，可能與樣本量較少有關(guān)。

綜上所述，Cyclin D1、Ki67 的表達(dá)以及甲狀腺癌5 項(xiàng)基因的突變?cè)赑TC 發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及未發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移患者中存在明顯的差異，這些指標(biāo)對(duì)預(yù)測(cè)PTC患者是否發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有重要意義。