鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶在老年子宮內(nèi)膜癌中的表達(dá)及其相關(guān)性分析

李建敏，高 萍，林維鳳，張 艷

（高密市人民醫(yī)院婦科，山東高密 261500）

子宮內(nèi)膜癌是最常見(jiàn)的婦科惡性腫瘤之一，在過(guò)去10年中發(fā)病率每年上升約1.3%，主要發(fā)生在55～65歲之間的女性[1]，研究顯示老年女性的子宮內(nèi)膜癌比年輕人的更具侵襲性，嚴(yán)重威脅女性健康[2]。因此，探索新的分子標(biāo)志物并確定潛在的治療靶點(diǎn)至關(guān)重要。鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶（calcineurin，CN）和下游信號(hào)通路在結(jié)直腸癌腫瘤和細(xì)胞系中被激活，抑制CN會(huì)降低腫瘤細(xì)胞的存活和增殖。此外CN與惡性腫瘤骨轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，在體內(nèi)參與多種細(xì)胞功能調(diào)節(jié)[3]。然而，CN 表達(dá)在子宮內(nèi)膜癌中的影響尚不完全清楚，仍有待進(jìn)一步闡明。本研究檢測(cè)了CN 在老年子宮內(nèi)膜腫瘤組織中的表達(dá)，并探討其與臨床病理因素和預(yù)后的相關(guān)性，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

收集2015年3月—2021年12月高密市人民醫(yī)院婦科收治的50 例老年子宮內(nèi)膜癌患者作為觀(guān)察組，組織類(lèi)型：子宮內(nèi)膜樣腺癌44 例，漿液性乳頭狀腺癌6例。FIGO（國(guó)際婦產(chǎn)科聯(lián)盟）子宮內(nèi)膜癌分期：Ⅰ期28例，Ⅱ期6例，Ⅲ期11例，Ⅳ期5例。納入標(biāo)準(zhǔn)：觀(guān)察組所有患者均符合子宮內(nèi)膜癌診斷標(biāo)準(zhǔn)，均經(jīng)組織學(xué)檢驗(yàn)確診。所有患者均未接受任何術(shù)前治療，包括化療和放療。

另選取50 例因子宮肌瘤切除的正常子宮內(nèi)膜組織樣本作為對(duì)照組。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并嚴(yán)重感染性疾病的患者；合并其他惡性腫瘤的患者；嚴(yán)重肝腎功能不全的患者。本研究通過(guò)高密市人民醫(yī)院倫理委員會(huì)審批（高醫(yī)倫理2018-0010）。

1.2 研究方法

檢測(cè)CN 在子宮內(nèi)膜癌組織和正常子宮內(nèi)膜組織中的表達(dá)。將各組織樣本用10%中性福爾馬林固定，石蠟包埋，制備成4μm厚切片。切片首先在65℃下孵育30min，然后在二甲苯中脫蠟，乙醇中水化。加入EDTA液和蒸餾水進(jìn)行加壓修復(fù)，進(jìn)行蘇木精-伊紅（HE）染色。用PBS沖洗3次后，將切片在室溫下暴露于小鼠抗鈣調(diào)磷酸酶抗體1h。用PBS 沖洗3 次后，將切片在二抗中孵育30min。室溫下將載玻片在顯色底物3，3'-二氨基聯(lián)苯胺中孵育，蘇木精復(fù)染，脫水，吹干，封固。

CN 表達(dá)陽(yáng)性的判斷：根據(jù)CN 在免疫染色中的表達(dá)，評(píng)估陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞的比例，≥30%為表達(dá)陽(yáng)性，＜30%為表達(dá)陰性[4]。

記錄患者的臨床特征，包括年齡、FIGO 分期、分化程度、肌層浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。全部病例均完成隨訪(fǎng)，隨訪(fǎng)時(shí)間從患者手術(shù)時(shí)間開(kāi)始截止到2022年3月。隨訪(fǎng)時(shí)記錄總生存時(shí)間，總生存時(shí)間定義為從患者手術(shù)時(shí)間至死亡或隨訪(fǎng)截止時(shí)間。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)，組間的CN的陽(yáng)性表達(dá)率的比較采用卡方檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。采用多因素Logistic 回歸分析CN 陽(yáng)性表達(dá)的影響因素。采用Kaplan-Meier 法分析CN 表達(dá)與預(yù)后的相關(guān)性，并用log-rank 檢驗(yàn)進(jìn)行比較。

2 結(jié)果

2.1 不同內(nèi)膜組織標(biāo)本中CN的表達(dá)

采用免疫組化法檢測(cè)CN 在子宮內(nèi)膜癌組織和正常子宮內(nèi)膜組織中的表達(dá)，觀(guān)察到CN主要表達(dá)于子宮內(nèi)膜癌組織的細(xì)胞核中，細(xì)胞核中呈現(xiàn)棕褐色的顆粒，見(jiàn)圖1A、1B（封二）。在正常子宮內(nèi)膜組織中，部分腺體細(xì)胞核中可見(jiàn)CN 陽(yáng)性表達(dá)，見(jiàn)圖1C、1D（封二）。

2.2 CN 在正常子宮內(nèi)膜組織和子宮內(nèi)膜癌組織中的表達(dá)率的比較

比較對(duì)照組和子宮內(nèi)膜癌組中CN的表達(dá)，表1 示，子宮內(nèi)膜癌組的CN 陽(yáng)性表達(dá)率顯著高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。

表1 CN在對(duì)照組和子宮內(nèi)膜癌組中的陽(yáng)性表達(dá)比較

2.3 CN表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

表2 示，子宮內(nèi)膜癌組患者的臨床病理特征中，不同病理類(lèi)型、分化程度、是否合并轉(zhuǎn)移的患者之間CN的陽(yáng)性表達(dá)率差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。FIGO Ⅲ-Ⅳ期患者的CN陽(yáng)性表達(dá)率顯著高于FIGO Ⅰ-Ⅱ期患者（P＜0.05）。肌層浸潤(rùn)深度＞1/2 患者的CN 陽(yáng)性表達(dá)率顯著高于肌層浸潤(rùn)深度＜1/2的患者（P＜0.05）。

表2 子宮內(nèi)膜癌患者中CN的表達(dá)

2.4 子宮內(nèi)膜癌患者CN陽(yáng)性的影響因素

以CN 是否陽(yáng)性為因變量（賦值：否=0，是=1），以FIGO分期、肌層浸潤(rùn)深度為自變量，通過(guò)多因素Logistic 回歸分析發(fā)現(xiàn)，患者FIGO 分期、肌層浸潤(rùn)深度是子宮內(nèi)膜癌患者CN 陽(yáng)性的獨(dú)立影響因素（P＜0.05），見(jiàn)表3。

表3 子宮內(nèi)膜癌患者CN陽(yáng)性的多因素Logistic回歸分析

2.5 CN的表達(dá)和子宮內(nèi)膜癌患者預(yù)后的關(guān)系

KM 生存曲線(xiàn)（圖2）顯示，CN 陰性的子宮內(nèi)膜癌患者平均生存時(shí)間為（73.86±1.89）個(gè)月，顯著高于CN 陽(yáng)性的子宮內(nèi)膜癌患者（61.60±2.30）個(gè)月，Log Rank檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)值為χ2=11.20（P＜0.05）。

圖2 子宮內(nèi)膜癌患者的KM生存曲線(xiàn)

3 討論

3.1 CN與子宮內(nèi)膜癌

子宮內(nèi)膜癌是女性常見(jiàn)的惡性腫瘤。已有研究逐漸探索子宮內(nèi)膜癌的分子機(jī)制及其預(yù)后影響因素[5]。等級(jí)較高、晚期或非子宮內(nèi)膜樣組織學(xué)是高危子宮內(nèi)膜癌的特點(diǎn)[6]。約15%～20%的子宮內(nèi)膜癌患者存在高危疾病且預(yù)后較差[7]。盡管有新的抗腫瘤藥物和更有效的聯(lián)合治療，據(jù)報(bào)道Ⅳ期子宮內(nèi)膜癌患者的5年生存率約為17%[1，8]，迫切需要研究潛在的分子標(biāo)志物以改善子宮內(nèi)膜癌患者的預(yù)后。

CN 是一種鈣依賴(lài)性絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶，由2個(gè)亞基組成，鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶A（CNA）和鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶B（CNB），在免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用，如CN 抑制劑環(huán)孢素A 和他克莫司（FK506）作為免疫抑制劑在臨床具有廣闊的應(yīng)用前景[9]。CN與鈣調(diào)蛋白結(jié)合后被激活和隨后的靶蛋白發(fā)生去磷酸化。此外，CN 底物還包括轉(zhuǎn)錄因子、參與細(xì)胞周期和凋亡的蛋白質(zhì)、細(xì)胞骨架蛋白、膜通道和受體[10]。研究顯示CN/NFAT 通路在乳腺癌中被激活，對(duì)乳腺癌細(xì)胞的存活和轉(zhuǎn)移至關(guān)重要[11]。然而，CN在子宮內(nèi)膜癌中的作用尚不清楚。

3.2 CN陽(yáng)性表達(dá)與子宮內(nèi)膜癌臨床特征的關(guān)系

本研究表明，老年子宮內(nèi)膜癌組織中CN的表達(dá)高于正常子宮內(nèi)膜組織，提示CN在子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞中的表達(dá)上調(diào)，表明CN可能在腫瘤新生血管形成中發(fā)揮重要作用。本研究結(jié)果與其他研究結(jié)果一致，Eleni 等[12]研究顯示鈣調(diào)磷酸酶γ 催化亞基PPP3CC 通過(guò)miR-200c-3p 的調(diào)控影響上皮性卵巢癌細(xì)胞凋亡，這些結(jié)果表明CN與腫瘤的進(jìn)展密切相關(guān)。

為了確定CN 表達(dá)在老年子宮內(nèi)膜癌各種組織學(xué)亞型中的臨床意義，本研究對(duì)患者的臨床特征包括FIGO分期、病理類(lèi)型、分化程度、肌層浸潤(rùn)深度、合并轉(zhuǎn)移進(jìn)行了單因素分析。結(jié)果顯示，F(xiàn)IGO Ⅲ-Ⅳ期患者的CN 陽(yáng)性表達(dá)率顯著高于FIGO Ⅰ-Ⅱ期的患者（P＜0.05）。肌層浸潤(rùn)深度＞1/2患者的CN陽(yáng)性表達(dá)率顯著高于肌層浸潤(rùn)深度＜1/2 的患者（P＜0.05）。未發(fā)現(xiàn)CN 表達(dá)與其他臨床或病理參數(shù)顯著相關(guān)。多因素Logistic 回歸分析結(jié)果顯示FIGO分期、肌層浸潤(rùn)深度是子宮內(nèi)膜癌患者CN陽(yáng)性的獨(dú)立影響因素。

3.3 CN與子宮內(nèi)膜癌的預(yù)后

本研究采用KM 生存曲線(xiàn)分析CN 陽(yáng)性表達(dá)對(duì)老年子宮內(nèi)膜癌患者預(yù)后的影響，結(jié)果顯示CN陰性的子宮內(nèi)膜癌患者平均生存時(shí)間顯著高于CN 陽(yáng)性者。推測(cè)可能由于磷酸化是調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)功能的關(guān)鍵機(jī)制，CN 引起的蛋白質(zhì)去磷酸化在腫瘤形成和進(jìn)展中發(fā)揮重要作用，與腫瘤患者的預(yù)后密切相關(guān)[13]。

綜上，老年子宮內(nèi)膜癌組織中CN的表達(dá)與臨床病理特征密切相關(guān)，包括FIGO分期和肌層浸潤(rùn)深度，檢測(cè)CN的陽(yáng)性表達(dá)對(duì)于評(píng)估老年子宮內(nèi)膜癌的預(yù)后也具有臨床價(jià)值。