抗菌脂肽作用機制及其在畜禽養(yǎng)殖中的應用

陳靜虹,江 山,蘇國旗,黃金秀,蘭云賢,王瑞生

(1.西南大學 動物科學技術學院,重慶402460;2.重慶市畜牧科學院,重慶402460;3.國家生豬技術創(chuàng)新中心,重慶402460)

1 抗菌脂肽的結構特征

抗菌脂肽主要是由非核糖體多肽合成酶(NRPSs)或真菌聚酮合酶-非核糖體多肽合成酶(PKS-NRPS)催化合成的含有脂類部分的天然多肽產物,屬于非核糖體脂肽(NRLPs)[6]。它的結構分為2部分:親水性的寡肽鏈和疏水性的脂肪酸鏈,其具有兩親性并與細胞膜脂質壁相容性的特點。寡肽鏈部分一般由7～10個氨基酸殘基組成[7],由于NRLPs不受遺傳密碼和模板的約束,寡肽鏈部分可以由蛋白源性氨基酸、非蛋白源性氨基酸(如鳥氨酸、高絲氨酸、β-氨基酸)和修飾氨基酸(如羥基化、氯化、N-甲基化或糖基化)的L-構型或D-構型混合組成[8]。脂肪酸鏈部分包含1個或多個附著在寡肽基團上的脂肪酸鏈,主要由β-羥基脂肪酸鏈或β-氨基脂肪酸鏈組成[9]。根據空間結構,抗菌脂肽可分為環(huán)狀脂肽和線性脂肽兩大類。環(huán)狀脂肽又可分為脂肪酸成環(huán)、接環(huán)和離環(huán)3種不同類型,脂肪酸成環(huán)型脂肽(圖1A)是寡肽上氨基酸的-COOH與疏水性脂肪酸鏈的-OH或-NH2結合,導致肽鏈閉合后形成環(huán)狀脂肽;脂肪酸接環(huán)型脂肽(圖1B)是肽環(huán)中N-端氨基酸的α-氨基直接與肽環(huán)相連,肽鏈C-端的-COOH與N-端氨基酸的-OH或非α-氨基相連形成環(huán)狀結構。脂肪酸離環(huán)型脂肽(圖1C),是由脂肪酸鏈間接與含有肽鍵或多種其他酯鍵、酰胺鍵等的肽環(huán)相連形成[10-11]。目前,熟知的環(huán)狀脂肽有多黏菌素B (Polymixin B)、達托霉素(Daptomycin)、表面活性素(Surfactin)、伊枯草菌素(Iturin)、芬薺素(Fengcyin)、棘白菌素(Echinocandins)、Paenibacterin和Pseudofactin等。線性脂肽含有一個順次連接的線性氨基酸基團及與α-氨基或其他羥基結合的脂肪酸鏈[12]。線性脂肽主要有2種,分別是直鏈結構的螺旋形素spiroidesin[13]和支鏈結構的TAN-1511系列,包括TAN-1511 A、B和C[14](圖1D)。近年來,新發(fā)現的線性脂肽包括Gageotetrins[15]、Paenipeptins[16]、Komesuamide和Odo-penicillatamide[17]等。

研究發(fā)現,抗菌脂肽分子中寡肽鏈與脂肪酸鏈以及肽單元之間的相互作用,會引發(fā)自組裝現象,并形成一定的聚集結構[18-19],而親水性寡肽鏈中氨基酸排列、疏水性脂肪酸鏈結構以及兩部分間連接的差異會導致抗菌脂肽具有不同的功能特性[6]。通常,抗菌脂肽的殺菌活性取決于疏水性的強弱,因此可以通過增加疏水性脂肪酸鏈長度(一般是C8～C14)來增強抗菌脂肽的抗菌活性[20]。但較長的脂肪酸鏈(C16或C18)在提升抗菌脂肽抗菌活性的同時,也增加了生物毒性[21-22],因此在人工合成抗菌脂肽時,應選擇適當的脂肪酸鏈長度。

2 抗菌脂肽的作用機制

在研究抗菌脂肽早期,人們普遍認為膜靶向作用是抗菌脂肽唯一的作用機制。隨著機制研究的不斷深入,越來越多的證據表明抗菌脂肽還可通過其他方式發(fā)揮作用。目前,抗菌脂肽的作用機制主要分為膜靶向抑菌機制、非膜靶向抑菌機制和免疫調節(jié)機制。

2.1 膜靶向抑菌機制抗菌脂肽對細胞膜的作用主要是通過改變膜的通透性,造成細胞穿孔、內容物滲漏和菌體破裂,從而殺傷細菌或真菌。研究表明,抗菌脂肽可通過氨基酸殘基正電荷與細胞膜負電荷之間的靜電作用,或兩親性結構與細胞膜磷脂之間的疏水相互作用,靶向作用于細菌細胞膜[23]?？咕呐c細胞膜之間的相互作用主要包括劃分、折疊、插入和結合4個步驟[3]。目前,主要有4種抗菌脂肽膜靶向模型,可分為跨膜孔模型和非孔模型2大類,跨膜孔隙模型又可細分為桶壁孔模型、環(huán)形孔隙模型和聚集體模型[24]。桶壁孔模型最早由OREN等[25]提出,適用于具有兩親性α螺旋、疏水性α螺旋、β折疊結構或同時含有這些結構的抗菌脂肽[26]。在該模型中,抗菌脂肽最初平行于細胞膜,但最終抗菌脂肽以多聚體形式垂直穿透細胞膜,并在親水部分形成類似于蛋白質離子通道,進而促進側肽-肽的相互作用。在環(huán)形孔隙模型中,抗菌脂肽垂直插入脂質雙分子層使膜表面的螺旋束和排列在螺旋中的脂質變得彎曲并形成環(huán)形孔隙[27]。與桶壁孔模型不同的是,環(huán)形孔模型中不存在特定的肽-肽之間的相互作用,且肽構象的親水部分與脂質頭基有關。聚集體模型由WU等[28]提出。在此模型中,抗菌脂肽首先貼附在病原菌胞膜表面,在達到一定濃度后,通過改變自身方向并插入到細胞膜親水性部分和疏水性部分的交界面,與脂質層形成跨脂雙分子層的肽-脂質凝聚物。凝聚物隨后作用于細胞膜,形成動態(tài)離子泄露通道,改變膜的通透性并造成內容物大量滲漏。與環(huán)形孔模型相比,適用聚集體模型的抗菌脂肽物無特定取向。地毯模型屬于非孔模型,最早由POUNY等[29]提出,適用于β折疊結構占主導的抗菌脂肽。在這個模型中抗菌脂肽以類似清潔劑的方式起作用覆蓋在細胞表面,形如“地毯”,直至細胞膜表面閾值濃度,進而改變雙分子層的拓撲結構,最終通過膠束使膜發(fā)生崩解,膜的完整性被破壞[30]。這一模式是抗菌脂肽抑殺革蘭陰性菌和寄生蟲最常見的作用機制[31]。此外,還有其他膜靶向模型,如Shai-Huang-Matsazuki模型、界面活性模型和電穿孔模型[32]。

2.2 非膜靶向抑菌機制

2.2.1作用于細胞壁 傳統的抗生素主要與細胞壁成分合成過程涉及的特定蛋白質結合,而抗菌脂肽通常與細胞壁合成所需的前體分子以及細胞壁的組成成分等相互作用,從而抑制細胞壁合成。研究發(fā)現,抗菌脂肽tridecaptin A1與肽聚糖前體脂質Ⅱ形成緊密絡合物[33],阻止其底物轉糖基化,從而抑制細胞壁肽聚糖合成,引起菌體崩解。帶正電荷的抗菌脂肽paenipetin C與帶負電荷的磷壁酸(LTA)和脂多糖(LPS)結合[34],使抗菌脂肽通過細胞壁并作用于細胞膜,引起顯著的膜電位去極化和胞內鉀離子的泄露。

2.2.2作用于細胞內靶點 現已證實,一些抗菌脂肽具有胞內作用靶點,因為它在最小的有效濃度下,并沒有改變細胞膜的通透性,但仍會導致細胞死亡[35]。目前,抗菌脂肽與細菌胞內靶點的作用方式主要有以下3種:與有害菌DNA或RNA發(fā)生相互作用,使菌體遺傳信息的傳遞和表達功能異常,細菌蛋白合成受阻,造成有害菌繁殖受阻而死亡[36-37],影響相關合成酶活性;Fengycin類抗菌脂肽通過疏水相互作用和氫鍵,與葡聚糖和幾丁質合成酶結合,導致酶活性下降[38],引起細胞器功能紊亂;抗菌脂肽刺激線粒體產生過量的活性氧(ROS),導致線粒體膜電位增加,引起細胞氧化損傷,最終導致細胞死亡[39]。

2.3 免疫調節(jié)機制在真核生物中,抗菌脂肽與其先天性免疫、適應性免疫和炎癥反應均密切相關。除靶向作用于致病菌外,抗菌脂肽還能通過以下方式實現對宿主的免疫調節(jié):促進免疫器官發(fā)育;招募和激活免疫細胞,從而增強對微生物的殺傷能力以及控制炎癥;促進免疫活性物質如:IgG、IgA等的分泌;調控宿主免疫相關基因如IFN-γ,間接影響宿主免疫功能;抑制宿主炎癥反應過程中促炎趨化因子如IL-1β的表達來減少炎癥[40];控制趨化因子、活性氧(ROS)和活性氮(RNS)的表達;中和內毒素活性。

由此可見,抗菌脂肽可以通過膜靶向或非膜靶向的方式直接殺滅病原體,還可以通過調節(jié)機體免疫系統、免疫因子和免疫基因等間接參與免疫調節(jié)過程。

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3 抗菌脂肽在畜禽上的應用

抗菌脂肽具有廣譜抗菌性和不易產生耐藥性的特點,因此作為新型飼料添加劑應用在畜禽養(yǎng)殖中具有很大的潛力。目前,抗菌脂肽在畜禽上的應用主要集中在肉雞和斷奶仔豬,而在反芻動物等其他畜禽上的應用研究較少。

3.1 抗菌脂肽改善畜禽生長性能規(guī)?；B(yǎng)殖的肉雞品種因生長速度快而抵抗力弱,再加上養(yǎng)殖密度過高、環(huán)境應激等原因,容易造成肉雞發(fā)病率和病死率增加[41]。研究發(fā)現,枯草芽孢桿菌fmbj菌株和GD菌株、芽孢桿菌S21、納豆芽孢桿菌NT-6、地衣芽孢桿菌菌株ATCC12713發(fā)酵產生的抗菌脂肽對健康肉雞的生長性能具有正向調節(jié)作用,主要表現為增加平均采食量和日增重,降低料重比[42-45],提高粗蛋白的表觀消化率[46],增加肉雞出欄體質量[45,47]和降低病死率[48]。CHENG等[49]研究發(fā)現,抗菌脂肽能增加肉仔雞股骨和脛骨的重量及灰分重。另外,抗菌脂肽能夠改善感染病原菌(如產氣莢膜梭菌、大腸桿菌等)或寄生蟲的畜禽生長性能的負面影響[50-51]。比較應用地衣芽孢桿菌源抗菌脂肽和抗生素治療禽壞死性腸炎(necrotic enteritis,NE)的試驗發(fā)現,抗菌脂肽使NE肉雞21日齡和35日齡的體質量分別提高12.06%和6.19%[52],與抗生素的效果相當。

仔豬的斷奶應激容易造成腹瀉和水腫,導致生長發(fā)育受阻。研究表明,飼料中添加抗菌脂肽Surfactin、“肽維美”抗菌脂肽制劑100～300 mg/kg能顯著提高斷奶仔豬的日采食量和日增重,減少發(fā)病頭次[53],有效控制斷奶仔豬腹瀉的發(fā)生[54-56]。陳旭波[54]指出抗菌脂肽能顯著降低血清尿素氮濃度和血脂水平,改善斷奶仔豬蛋白質代謝和脂質代謝狀況。另外,YE等[57]研究發(fā)現,抗菌脂肽Iturin A可通過下丘腦-垂體-mTORC1生長軸改善STb-Rosetta大腸桿菌誘導的豬肉骨骼肌生長受限,促進肌肉細胞增殖和肌纖維增大,對斷奶仔豬骨骼肌的生長發(fā)育調節(jié)具有積極的作用。

3.2 抗菌脂肽提高畜禽免疫功能

3.2.1抗菌脂肽促進畜禽血清免疫球蛋白分泌 程曉瑩[58]對肉雞分別使用Surfactin、Fengycin以及Iturin抗菌脂肽進行滴鼻免疫,發(fā)現抗菌脂肽不同程度地增加了血清IgA和各組織涮洗液中SIgA的含量,且Surfactin的效果最為突出。都海明等[44]研究發(fā)現,在肉雞生長前期飼喂4 000 U/kg的抗菌脂肽對血清球蛋白(GLO)的合成具有明顯的促進作用。ERHARD等[59]使用抗菌脂肽PCSL作為蛋雞免疫應答佐劑進行免疫注射,結果顯示抗菌脂肽PCSL能顯著提高蛋雞血清中IgY含量,且PSCL與重組雞源IFN-γ細胞因子佐劑聯合使用時,能獲得更高的抗體滴度。而外源添加100 mg/kg的抗菌脂肽能顯著提高仔豬血清IgG和IgM水平[55]。這些研究結果表明,抗菌脂肽能通過提高血清免疫球蛋白含量,從而增強畜禽機體體液免疫能力。

3.2.2抗菌脂肽增強畜禽體內細胞免疫應答 樹突狀細胞(dendritic cells,DCs)是一類抗原遞呈細胞,在固有免疫和適應性免疫中都發(fā)揮著重要作用。研究發(fā)現,抗菌脂肽Surfactin能直接誘導雞骨髓源DCs形態(tài)和功能的成熟[60],增加細胞標志物CD40和MHC-Ⅱ的表達,提高DCs向CCL19遷移的能力,為DCs激活下游免疫應答提供條件。XU等[61]進一步研究發(fā)現,抗菌脂肽Surfactin處理后的雞骨髓源DCs刺激CD4+T細胞增殖的能力極顯著提高,提示抗菌脂肽可誘導更強的免疫應答。同時,試驗還發(fā)現DCs細胞質中抑制因子I-κBα顯著降低,細胞核p65水平增高,說明NF-κB被激活,抗菌脂肽可能通過影響NF-κB信號通路促進雞骨髓源DCs成熟?？咕倪€可顯著增加仔豬血清中補體C3含量[55],通過補體經典激活和旁路激活等途徑參與抗原遞呈環(huán)節(jié),啟動適應性免疫,在畜禽感染早期發(fā)揮免疫作用。STENFFENS等[62]和HAUSCHILDT等[63]研究顯示抗菌脂肽可作為B淋巴細胞和單核-巨噬細胞的激活劑,促進B細胞增殖,促進巨噬細胞分泌細胞因子IL-1、IL-6和TNF-α,同時增強巨噬細胞的吞噬作用。外周血單個核細胞(PBMC)主要由淋巴細胞和單核細胞組成。KIM等[40]研究發(fā)現,抗菌脂肽可以抑制在LPS刺激下的斷奶仔豬PBMCs對IFN-γ、TNF-α的分泌,且具有劑量效應。另外,抗菌脂肽通過促進肉雞法氏囊、胸腺等中樞免疫器官的生長發(fā)育[43-44],增強淋巴細胞的增殖轉化。LIN等[64]研究發(fā)現,抗菌脂肽能提高肉雞脾臟和法氏囊的IL-1β mRNA水平,從而增加Th1細胞因子IFN-γ豐度,增強Th1介導的細胞免疫應答。這些研究結果表明,抗菌脂肽可通過增強抗原遞呈、激活免疫細胞并促進增殖和轉化等免疫調節(jié)方式來增強畜禽體內的細胞免疫應答,提高免疫能力。

3.2.3抗菌脂肽增強畜禽腸道免疫功能 抗菌脂肽可以緩解腸道炎癥,并通過加快腸道細胞更新和上調腸道屏障基因,促進畜禽受損腸道組織結構的恢復,提升腸道對細菌外毒素等致病因子的抵抗能力,增強畜禽腸道免疫功能。CHEN等[65]發(fā)現受LPS刺激的肉雞十二指腸、空腸和回腸IL-1β和IL-6 mRNA表達上調,日糧中添加3 g/kg的抗菌脂肽使LPS誘導的炎癥相關基因表達回落到正常水平。CHEN等[66]研究發(fā)現,1～3 g/kg枯草芽孢桿菌發(fā)酵產物BSFP(主要成分為Surfactin)能顯著降低葡聚糖硫酸鈉(DSS)刺激下的肉雞腸道cox2、inos、IL-1β和IL-6 mRNA的表達,提示抗菌脂肽通過下調患病畜禽促炎因子的mRNA水平減輕腸道炎癥,控制感染。另據報道,抗菌脂肽能提高健康肉雞空腸黏膜的促炎因子IL-1β、IL-6、IL-12及IFN-γ的含量[58,60],增強腸道黏膜免疫效果。以上說明抗菌脂肽能針對不同健康狀況的畜禽,差異性調控畜禽腸道免疫相關分子的表達。YU等[67]和DANESHMAND等[68]研究表明,抗菌脂肽能顯著提高感染球蟲或大腸桿菌的肉雞腸道絨毛長度,降低隱窩深度,提高絨隱比,增大腸道絨毛表面積。抗菌脂肽還可以促進NE肉雞腸道絨毛的修復,緩解腸道潰瘍和腸壁變薄易碎等壞死情況[49,51-52,64]。腸干細胞(ISC)存在于隱窩的腸道組織囊中,是畜禽腸道細胞自我更新和損傷修復的源泉。研究發(fā)現,抗菌脂肽Iturin A能促使受腸毒素b刺激的仔豬空腸隱窩細胞,在類腸形成效率、表面積、萌芽效率和支化系數等方面具有更大的ISC生長優(yōu)勢[69],提示抗菌脂肽Iturin A可預防腸毒素b誘導的腸道黏膜損傷。另外,抗菌脂肽通過上調十二指腸、空腸和回腸中腸道屏障基因Mucin-2和Occludin表達量[65,70],提高腸道黏液蛋白分泌,加強腸道細胞間的連結,增強腸道屏障功能。

3.3 抗菌脂肽改善腸道微生態(tài)抗菌脂肽對腸道菌群的調節(jié)作用主要是通過降低回腸、盲腸[50,65,70-72]或糞便[40,45]中的總需氧菌、梭狀芽孢桿菌等病原菌豐度,增加乳酸桿菌、未分類的毛螺菌屬等益生菌豐度,優(yōu)化畜禽腸道菌群結構。體外試驗證明,抗菌脂肽可通過多種作用機制抑制腸道有害菌增殖,如:抗菌脂肽Tachyplesin Ⅰ結合到大腸桿菌細胞膜表面,造成細胞膜內膜滲透性增大、離子和胞內大分子物質泄漏,最終導致細胞死亡[73];達托霉素通過擾亂氨基酸轉運、抑制LTA合成從而改變金葡萄球菌細胞膜性質,或通過破壞細胞膜來殺滅細菌[74-75]。比較抗菌脂肽與恩拉霉素治療NE肉雞的試驗發(fā)現,抗菌脂肽能顯著提高盲腸菌群的α多樣性,且對肉雞腸道菌群物種豐富度和均勻度的影響較抗生素小[45,71]。家禽的盲腸腸道菌群被證實存在抗生素抗性基因(ARG),且擬桿菌屬是ARG主要宿主菌屬[76-77]。CHEN等[71]研究發(fā)現日糧中添加3 g/kg的抗菌脂肽,對肉雞盲腸食糜中擬桿菌屬的豐度無顯著變化,但顯著降低了擬桿菌屬中肽類抗生素(短桿菌素等)抗性基因parY含量,還降低了盲腸食糜中肽類抗生素抗性基因的總量。另外,抗菌脂肽還能調節(jié)乳桿菌屬中林可酰胺抗性基因rpoB2和布勞特菌屬中大環(huán)內酯抗性基因efrB的表達。以上說明,抗菌脂肽除通過調節(jié)腸道群落結構來影響肉雞腸道健康外,還可在屬水平上差異調節(jié)盲腸食糜細菌群落中單個ARG豐度,改善肉雞腸道菌群對抗生素的耐藥性。

腸道微生物通過分泌大量代謝物質(短鏈脂肪酸、膽汁酸、必須維生素等)參與宿主腸道內的代謝、免疫、結構和保護等多種活動[78]。研究發(fā)現,日糧中添加抗菌脂肽在優(yōu)化腸道菌群結構的同時,也可顯著提高盲腸食糜中短鏈脂肪酸(SCFA)含量,并且腸道菌群中菌屬的豐度與腸道中SCFA含量具有相關性,如腸道菌群乳酸桿菌屬的豐度與4-甲基戊酸異丁酸、甲酸和丁酸等大部分SCFA含量呈正相關;未分類的毛螺菌屬的豐度與丁酸、乙酸、丙酸、己酸和戊酸含量呈正相關,與異丁酸、2-甲基丁酸、3-甲基丁酸等含量呈負相關[50,70]。以上說明,抗菌脂肽對腸道中SCFA含量的影響,可能是通過影響分泌相關SCFA的菌屬豐度實現的。

4 結語與展望

綜上,抗菌脂肽在促進動物生長、增強免疫能力、促進腸道形態(tài)恢復以及改善腸道微生態(tài)等方面發(fā)揮積極作用,而且抗菌脂肽的廣譜抗菌活性和特殊的膜靶向及非膜靶向作用機制凸顯其作為綠色安全的替抗產品的前景,在畜禽養(yǎng)殖過程中是理想的傳統抗生素替代物。隨著對抗菌脂肽生物學功能的深入挖掘,抗菌脂肽對畜禽的促生長作用已在多方面、多層次展開研究。有研究發(fā)現,抗菌脂肽能通過提高畜禽血清、肝臟[46,79]以及腸道[70]的超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)的水平增強畜禽抗氧化能力,但抗菌脂肽對提升畜禽抗氧化能力的作用機制還缺乏系統研究。另外,抗菌脂肽在畜禽上的應用目前主要集中在斷奶仔豬和生長期肉雞,而未深入研究其對畜禽不同生長階段的影響,后續(xù)可集中在抗菌脂肽對同一物種不同生長階段的影響開展相關研究,并將抗菌脂肽逐漸推廣應用到反芻動物、兔等其他畜禽上。

目前,越來越多抗菌脂肽商品進入市場,包括達托霉素、多黏菌素B、卡泊芬凈、米卡芬凈、奧利凡星、黏菌素和Colistimethate,并已在農林生防、食品保鮮、水產養(yǎng)殖和醫(yī)藥等行業(yè)廣泛應用,抗菌脂肽在畜禽養(yǎng)殖行業(yè)也將逐步受到重視。然而,抗菌脂肽產品創(chuàng)制及其在畜牧生產上的應用還存在:一是生產抗菌脂肽的菌種主要為芽孢桿菌,生產菌種較為單一,且野生型抗菌脂肽生產菌產量低;二是天然抗菌脂肽結構復雜、分子量較大,人工合成抗菌脂肽難度大、成本高且合成脂肽的活性較天然脂肽低;三是抗菌脂肽發(fā)酵液中多種同系物共存或高價值組分比例低,大規(guī)模生產和濃縮純化足量抗菌脂肽的技術尚不成熟;四是抗菌脂肽的結構與其功能的必然聯系仍未明確等諸多問題制約著抗菌脂肽在養(yǎng)殖行業(yè)的廣泛應用。針對以上問題,未來可以在新型抗菌脂肽的發(fā)掘、高產菌株的篩選、活性生產菌合成基因簇的修飾改造、低價高效的純化技術研發(fā)以及抗菌脂肽應用的安全性評價等方面加強研究。通過更深入的研發(fā)和改造,逐漸構建出高產、高轉化率和高生產率菌株,推動抗菌脂肽的工業(yè)化和商品化進程,為我國畜牧業(yè)替抗減抗和可持續(xù)發(fā)展做出更大貢獻。