飼養(yǎng)密度對育成期山麻鴨腸道健康和盲腸微生物菌群結(jié)構(gòu)的影響

林佩儀,梁 宇,侯展鵬,王金輝,王海悅,張續(xù)勐,江丹莉,李婉雁,劉文俊,曹 楠,許丹寧,田允波,黃運茂,李秀金,付新亮

(仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院 動物科技學(xué)院 廣東省水禽健康養(yǎng)殖重點實驗室,廣東 廣州 510225)

隨著現(xiàn)代集約化禽類養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展,飼養(yǎng)密度成為重要的環(huán)境和管理因素之一[1]。增加飼養(yǎng)密度可以在一定程度上提高產(chǎn)量,但這會對家禽的生產(chǎn)性能和健康等方面產(chǎn)生負面影響[2-3],如生長性能降低、氧化應(yīng)激以及腸道微生物菌群失調(diào)等[4]。研究表明,高飼養(yǎng)密度顯著降低肉雞的平均體質(zhì)量和肉品質(zhì)[5-6];隨著飼養(yǎng)密度的增加,鵪鶉的產(chǎn)蛋率下降,羽毛評分降低,免疫器官指數(shù)下降,血清免疫和生化指標受負面影響[7];研究結(jié)果顯示,12只/m2的飼養(yǎng)密度可增強北京鴨黏膜免疫的代償反應(yīng),刺激呼吸道黏膜,提高黏膜中分泌型IgA的含量,降低腸道消化酶的活性,并引起機體發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)[8]。此外,增大飼養(yǎng)密度還會引起蛋鴨機體應(yīng)激反應(yīng),降低機體的抗氧化能力并影響免疫功能[9]。山麻鴨是我國福建省的一個小體型蛋用鴨種,主要分布在我國福建、江西、廣東和浙江等地,飼養(yǎng)量達2.5億～3億只,約占蛋鴨飼養(yǎng)量的1/2,具有早熟、產(chǎn)蛋量高等特點[10-11]。長期以來,對飼養(yǎng)密度的探究多以肉雞和肉鴨為模型,關(guān)于飼養(yǎng)密度對山麻鴨等蛋鴨腸道健康和菌群結(jié)構(gòu)影響的報道較少,且規(guī)?；B(yǎng)殖的適宜飼養(yǎng)密度范圍尚沒有統(tǒng)一的參數(shù)[12-13]。本試驗通過分析不同飼養(yǎng)密度下育成期山麻鴨的腸道黏膜組織學(xué)變化、炎性損傷、消化酶活性以及盲腸微生物菌群結(jié)構(gòu),探究飼養(yǎng)密度對腸道健康的影響,為山麻鴨的集約化養(yǎng)殖提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 動物試驗設(shè)計及日糧180只體質(zhì)量大小基本一致的56日齡健康育成期山麻鴨,隨機分為LSD(低密度,n=30)、MSD(中密度,n=60)和HSD(高密度,n=90)3組,每組3個生物學(xué)重復(fù)。舍內(nèi)分布如下,鴨舍∶運動場∶水池=6 m2∶6 m2∶3 m2,即低密度、中密度、高密度3個試驗組的舍內(nèi)密度分別為5,10,15只/m2(飼養(yǎng)密度按照鴨舍面積計算,運動場與水池面積不計入在內(nèi)[3])。試驗期間嚴格按照生產(chǎn)日糧飼喂,基礎(chǔ)日糧組成及營養(yǎng)水平見表1,其他條件均按常規(guī)飼養(yǎng)規(guī)程執(zhí)行。

1.2 樣品采集每組隨機選取6只鴨,分別于試驗第3,6和9周進行采樣,采樣前禁飼12 h。使用無菌采血管翅下靜脈采血(2 mL/只),室溫下靜置2 h后3 000 r/min離心5 min,取血清于-20℃凍存?zhèn)溆?。采集空腸組織樣品,一份用4%多聚甲醛固定,用于組織形態(tài)學(xué)檢查;另一份液氮速凍后轉(zhuǎn)移到-80℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆?。無菌采集各組盲腸內(nèi)容物樣品于滅菌凍存管中,液氮速凍后轉(zhuǎn)移到-80℃冰箱保存,用于16S rDNA擴增子測序。

1.3 血清內(nèi)毒素、炎性因子水平和腸道消化酶活性測定白細胞介素1β(IL-1β)、白細胞介素8(IL-8)和腫瘤壞死因子α(TNF-α)測定試劑盒均購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司,按照試劑盒說明書通過ELISA方法測定山麻鴨血清中的IL-1β、IL-8和TNF-α含量。LPS測定試劑盒、腸道α-淀粉酶、蔗糖酶和糜蛋白酶活性測定試劑盒均購自南京建成生物工程研究所,根據(jù)試劑盒說明書通過比色法測定血清中LPS水平;用生理鹽水沖洗空腸3次除去食糜后,刮取腸道粘液,根據(jù)試劑盒操作說明書通過比色法分別對α-淀粉酶、蔗糖酶和糜蛋白酶活性進行測定。

1.4 空腸組織基因表達水平測定利用TRIzol法從空腸組織中提取總RNA,并通過PrimeScriptTM反轉(zhuǎn)錄試劑試劑盒(TaKaRa,Da Lian)將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以β-actin為內(nèi)參,進一步通過實時熒光定量PCR(Real-Time qPCR)分別測定各組空腸組織中的炎性因子(IL-8和TNF-α)和相關(guān)通路(TLR-4、MyD88和NF-κB)的基因表達水平,以及腸道組織緊密連接蛋白(OCLN和ZO1)的基因表達水平,引物序列如表2所示,引物由華大基因合成。

表2 引物序列信息

1.5 盲腸內(nèi)容物16S rDNA 擴增子測序分別提取各組盲腸內(nèi)容物總基因組DNA,對16S rDNA的V3-V4區(qū)進行PCR擴增,通過瓊脂糖凝膠電泳對PCR擴增產(chǎn)物進行純化和回收。使用TruSeq?DNA PCR-Free Sample Preparation Kit建庫試劑盒進行文庫構(gòu)建,構(gòu)建好的文庫經(jīng)質(zhì)檢合格后,使用Illumina NovaSeq平臺進行上機測序。對測序得到的原始數(shù)據(jù)(raw data)進行拼接、過濾,得到樣本有效數(shù)據(jù)(clean data),并根據(jù)測序結(jié)果中的有效數(shù)據(jù)進行OTUs(operational taxonomic units)聚類分析和物種分類分析。盲腸內(nèi)容物16S rDNA 擴增子測序送由北京諾禾致源科技股份有限公司完成。

2 結(jié)果

2.1 不同飼養(yǎng)密度對生長性能的影響飼養(yǎng)密度對山麻鴨生長性能的影響如表3所示,在試驗第3,6和9周,LSD組的山麻鴨體質(zhì)量均顯著高于MSD和HSD組(P<0.05),但MSD和HSD兩組之間鴨的體質(zhì)量無顯著差異。以上結(jié)果顯示,飼養(yǎng)密度過大會影響山麻鴨的生長性能。

表3 不同飼養(yǎng)密度對山麻鴨生長性能的影響

2.2 不同飼養(yǎng)密度對空腸組織結(jié)構(gòu)和物理屏障的影響由圖1可知,試驗第6,9周HSD組山麻鴨平均空腸絨毛長度顯著低于LSD和MSD組(P<0.01)(圖1A);而試驗第3,6和9周,HSD組鴨空腸的隱窩深度均高于LSD和MSD組,但無顯著性差異(圖1B)。絨隱比作為衡量腸道功能的重要指標,HSD組在試驗第9周鴨空腸組織絨隱比顯著低于LSD組(P<0.05)(圖1C),與LSD和MSD組相比,HSD組在試驗第3,6周鴨空腸組織絨隱比低于LSD和MSD組,但差異不顯著(P>0.05)?？漳c組織緊密連接蛋白基因表達水平測定結(jié)果顯示,試驗第3,6周各組鴨空腸組織OCLN和ZO1基因的mRNA表達水平無顯著差異(P>0.05),但試驗第9周,HSD組鴨空腸組織OCLN和ZO1基因的mRNA表達水平顯著低于LSD和MSD組(P<0.001)(圖2)。以上結(jié)果表明,長期高飼養(yǎng)密度條件下可引起山麻鴨空腸絨毛長度和絨隱比,以及空腸組織緊密連接蛋白基因表達水平顯著降低,影響腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)和物理屏障功能受損。

A.空腸絨毛長度統(tǒng)計;B.空腸隱窩深度統(tǒng)計;C.空腸絨隱比統(tǒng)計 *表示差異顯著(P<0.05),**(P<0.01)和***(P<0.001)表示差異極顯著。下同

圖2 不同飼養(yǎng)密度對山麻鴨空腸組織中OCLN、ZO1基因表達水平的影響

2.3 不同飼養(yǎng)密度對空腸組織中消化酶活性的影響由圖3可知,試驗第9周HSD和MSD組山麻鴨空腸組織α-淀粉酶活性均顯著低于LSD組(P<0.001),且第6周HSD組空腸α-淀粉酶活性也顯著低于MSD組(P<0.05)(圖3A); HSD和MSD組鴨空腸糜蛋白酶活性在試驗第3,6和9周均顯著低于LSD組(P<0.01)(圖3B);HSD組鴨空腸蔗糖酶活性在試驗第3周顯著低于LSD組(P<0.05),但試驗第6,9周3個試驗組鴨的空腸蔗糖酶活性無顯著變化(圖3C)。以上結(jié)果表明,飼養(yǎng)密度過高可引起山麻鴨空腸組織α-淀粉酶、糜蛋白酶和蔗糖酶的消化酶活性降低。

A.空腸淀粉酶活性變化;B.空腸糜蛋白酶活性變化;C.空腸蔗糖酶活性變化

2.4 不同飼養(yǎng)密度對血清LPS和炎性細胞因子水平的影響由圖4可知,HSD組山麻鴨在試驗第6,9周時,血清LPS水平均顯著高于MSD和LSD組(P<0.05)(圖4A);并且HSD組在試驗第6周時,鴨血清中IL-1β、IL-8和TNF-α 3種炎性細胞因子的水平均顯著高于LSD組(P<0.05),但在第3,9周3個試驗組鴨血清中的炎性細胞因子水平均無顯著變化(圖4B、C、D)。以上結(jié)果表明,高飼養(yǎng)密度可引起山麻鴨血清LPS和炎性細胞因子水平升高,可能對機體造成炎性損傷。

A.血清LPS濃度變化;B.血清TNF-α濃度變化;C.血清IL-1β濃度變化;D.血清IL-8濃度變化

2.5 不同飼養(yǎng)密度對空腸組織TLR4/NF-κB信號通路相關(guān)基因表達的影響由圖5可知,試驗第3,6和9周HSD組山麻鴨空腸組織中IL-8基因mRNA表達水平顯著高于LSD和MSD組(P<0.01)(圖5A),并且在試驗第3周HSD組鴨空腸組織TNF-α基因mRNA表達水平也顯著高于LSD和MSD組(P<0.001)(圖5B);對鴨空腸組織TLR-4、MyD88和NF-κB基因的mRNA表達水平測定結(jié)果顯示,試驗第3周,HSD組鴨3種基因的mRNA表達水平均顯著高于LSD和MSD組(P<0.01),但試驗第6,9周無顯著變化(圖5C、D、E)?？漳c組織炎性因子分析結(jié)果表明,飼養(yǎng)密度過大可誘導(dǎo)TLR-4炎性因子通路的激活,導(dǎo)致山麻鴨空腸組織炎性因子表達量升高,可能誘導(dǎo)空腸組織的炎性損傷。

A.空腸IL-8基因表達水平變化;B.空腸TNF-α基因表達水平變化;C.空腸TLR-4基因表達水平變化;D.空腸MyD88基因表達水平變化;E.空腸NF-κB基因表達水平變化

2.6 不同飼養(yǎng)密度對山麻鴨盲腸微生物菌群的影響OTUs分析結(jié)果(圖6)顯示,試驗第3,6周各組山麻鴨盲腸微生物的OTUs數(shù)目無顯著變化,但試驗第9周,MSD和HSD組盲腸微生物的OTUs數(shù)目低于LSD組(圖6A),表明長期高飼養(yǎng)密度條件下可導(dǎo)致山麻鴨腸道微生物的多樣性降低。另外,分別在門(phylum)和屬(genus)水平上對各組鴨盲腸微生物豐度排名前10的物種進行分析,發(fā)現(xiàn)擬桿菌門(Bacteroidetes)和厚壁菌門(Firmicutes)為各組共同的優(yōu)勢菌門(圖6B),而在屬水平上,擬桿菌屬(Bacteroides)和梭桿菌屬(Fusobacterium)為各試驗組的優(yōu)勢菌屬(圖6C)。通過LEfSe對各試驗組鴨盲腸微生物的主要差異菌群進行分析,結(jié)果顯示,在試驗第3,9周時HSD組的盲腸微生物中厚壁菌門的相對豐度顯著下降(P<0.05),而試驗第6周時HSD組的盲腸微生物中擬桿菌門的相對豐度在顯著下降(P<0.05);此外,在試驗第3,6和9周時,HSD組的盲腸微生物中梭桿菌門(Fusobacteruota)的相對豐度顯著高于LSD和MSD組(P<0.05)(圖6D)。在屬水平上,試驗第3周HSD組的盲腸微生物中擬桿菌門的普雷沃菌屬(Prevotellaceae_Ga6A1_group)和理研菌屬(Rikenellaceae_RC9_gut_group)的相對豐度顯著降低(P<0.05)(圖6D)。盲腸微生物菌群分析結(jié)果表明,飼養(yǎng)密度過大會使山麻鴨盲腸中有益菌的相對豐度減少,而梭桿菌屬等有害菌群的豐度增加,導(dǎo)致腸道微生物菌群失衡。

3 討論

飼養(yǎng)密度對于家禽生長發(fā)育和繁殖至關(guān)重要,低密度飼養(yǎng)有利于青年蛋鴨的生長和性成熟,而高密度飼養(yǎng)顯著影響了青年蛋鴨增重,降低生長速度,推遲產(chǎn)蛋日齡[3]。研究表明,高飼養(yǎng)密度會引起肉雞采食量減少從而導(dǎo)致出欄體質(zhì)量下降[1,14],但也有學(xué)者認為高密度飼養(yǎng)并不能引起生產(chǎn)性能的顯著下降,可能與不同研究中鴨的品種、飼養(yǎng)條件和飼養(yǎng)管理水平等存在差異有關(guān)[12]。

家禽的腸道屏障結(jié)構(gòu)主要包括物理屏障、化學(xué)屏障、免疫屏障和微生物屏障4個方面。家禽在生長過程中容易受環(huán)境應(yīng)激和營養(yǎng)等多種因素的影響,引起腸道屏障功能受損以及腸道菌群紊亂,進而引發(fā)各種疾病和生產(chǎn)性能降低,甚至導(dǎo)致死亡[15]。研究表明,較高的飼養(yǎng)密度可通過破壞腸道物理屏障(緊密連接蛋白)、化學(xué)屏障(黏蛋白和消化酶等)、免疫屏障(腸黏膜分泌型IgA)和微生物屏障(腸道微生物組成)來影響動物的腸道健康,導(dǎo)致腸道的組織結(jié)構(gòu)受損,消化、吸收和黏膜免疫功能降低以及腸道微生物菌群紊亂[8,16]。

腸道的組織結(jié)構(gòu)形態(tài)如小腸絨毛高度、隱窩深度以及絨隱比可以一定程度上反映出腸道的健康情況[14,17]。絨毛高度下降表明吸收面積減少,而隱窩深度加深則表明小腸黏膜絨毛萎縮,吸收消化下降[18]。相關(guān)研究表明,在高飼養(yǎng)密度下(16只/m2)肉雞十二指腸、空腸和回腸的絨毛高度顯著減短,十二指腸絨隱比顯著降低,但對其隱窩深度無顯著影響[19]。本試驗結(jié)果表明,高飼養(yǎng)密度會顯著降低山麻鴨的空腸絨毛高度及絨隱比,而空腸隱窩深度無顯著變化,這與以往研究結(jié)果一致。有學(xué)者提出腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)的損傷有可能是因為腸道微生物菌群結(jié)構(gòu)失調(diào)導(dǎo)致絨毛上皮細胞過度凋亡所致[20]。緊密連接蛋白的表達水平降低是腸道物理屏障功能受損的直接分子證據(jù)[21],本試驗中我們測定了OCLN和ZO1等部分緊密連接蛋白在山麻鴨空腸組織中的基因表達水平。結(jié)果顯示,高飼養(yǎng)密度使山麻鴨空腸組織中OCLN和ZO1的基因表達水平顯著下降,降低了空腸黏膜緊密連接的完整性,這與以往的研究結(jié)果一致[1]。

相關(guān)研究報道,在高飼養(yǎng)密度條件下,北京鴨腸道黏膜中蔗糖酶、糜蛋白酶、堿性磷酸酶的活性顯著降低,而淀粉酶和脂肪酶的活性在不同飼養(yǎng)密度下無顯著變化[8]。與之相似,在本試驗中,高飼養(yǎng)密度會導(dǎo)致山麻鴨空腸組織中的α-淀粉酶和糜蛋白酶活性顯著降低,本試驗結(jié)果提示較高的飼養(yǎng)密度可能會影響山麻鴨腸道的消化功能。

目前,我國鴨主要養(yǎng)殖模式以地面平養(yǎng)與水養(yǎng)相結(jié)合為主,在高密度飼養(yǎng)條件下極易導(dǎo)致鴨舍和水體糞便污染嚴重,鴨群直接接觸病原促使大量病原菌進入其腸道,細菌內(nèi)毒素LPS誘導(dǎo)鴨腸道上皮細胞產(chǎn)生炎癥反應(yīng),對鴨腸道免疫屏障造成一定的損傷[22-23]。TLR-4可特異性識別LPS并激活MyD88/NF-κB炎癥信號通路,誘導(dǎo)促炎因子(IL-1β、TNF-α等)的產(chǎn)生,引起機體的炎性損傷[24,25]。相關(guān)研究表明,LPS能引起肉雞血清中TNF-α、IL-2、IL-6和IFN-γ的細胞因子水平顯著升高[26],并導(dǎo)致雛鵝盲腸黏膜組織中TLR-4、MyD88、NF-κB、IL-1β和TNF-α基因的mRNA表達水平顯著升高,進而造成腸道的炎性損傷[20,24]。在本試驗中,高飼養(yǎng)密度組山麻鴨血清中IL-1β、IL-8和TNF-α濃度以及空腸組織中IL-8、TNF-α、TLR-4、MyD88和NF-κB基因的mRNA表達水平均顯著升高,結(jié)果提示高飼養(yǎng)密度可能對鴨空腸組織造成一定的炎性損傷。而炎性因子水平升高的原因可能是在高飼養(yǎng)密度下環(huán)境中的LPS升高,進而在鴨體內(nèi)累計引起TLRs/NF-κb等信號通路激活誘導(dǎo) IL-1β和IL-8等炎性細胞因子的產(chǎn)生[14]。腸道組織受損、腸黏膜通透性升高以及腸道微生物菌群結(jié)構(gòu)失調(diào)導(dǎo)致的細菌移位也可能與機體炎性因子水平升高有關(guān)[27]。

腸道微生物菌群結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定對于維持腸道屏障功能至關(guān)重要[28-29]。擬桿菌門和厚壁菌門作為本研究中山麻鴨腸道微生物屏障的主要優(yōu)勢菌,前者在降解非纖維性碳水化合物方面發(fā)揮了重要作用,而后者主要在降解纖維物質(zhì)方面發(fā)揮作用;在擬桿菌門中,普雷沃菌屬參與淀粉、多糖的分解和蛋白質(zhì)代謝[30-31],與理研菌屬在鴨腸道屏障完整性和腸道內(nèi)穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮著重要作用[32],兩者相對豐度的下降是山麻鴨腸道微生物居群失調(diào)的特征[33]。另外,梭桿菌門中主要的梭桿菌屬與腸道疾病密切關(guān)系[34]。本試驗結(jié)果表明,在高飼養(yǎng)密度下山麻鴨腸道擬桿菌門和厚壁菌門的豐度降低,并且普雷沃菌屬和理研菌屬等有益菌豐度也顯著降低,而梭桿菌屬等有害菌群豐度的豐度顯著增加,這與以往研究結(jié)果相符[13]。也有研究表明,高飼養(yǎng)密度對山麻鴨腸道微生物菌群結(jié)構(gòu)的影響有可能是因為應(yīng)激或糞便增多導(dǎo)致的病原體增加、定植率升高所致[35,36]。

本試驗通過研究不同飼養(yǎng)密度下育成期山麻鴨的空腸黏膜組織學(xué)變化、屏障結(jié)構(gòu)功能、消化酶活性、炎性因子表達水平及盲腸微生物菌群結(jié)構(gòu),探究飼養(yǎng)密度對山麻鴨腸道健康及功能的影響,可為山麻鴨的集約化養(yǎng)殖提供理論參考。

本試驗結(jié)果表明,15只/m2試驗組山麻鴨空腸黏膜組織結(jié)構(gòu)發(fā)生顯著改變,空腸組織消化酶活性降低,腸道屏障結(jié)構(gòu)受損,并引起盲腸微生物菌群結(jié)構(gòu)紊亂,而5,10只/m22個試驗組各項指標無顯著變化。在本試驗條件下,鴨舍內(nèi)適宜飼養(yǎng)密度推薦為5～10只/m2。